Utilizzando Terminal transferasi-mediata dUTP Nick End-labelling (TUNEL) e caspasi 3/7 saggi alla morte delle cellule epidermiche di misura in rane con Chytridiomycosis
16 maggio 2018
Quantifichiamo la morte delle cellule epidermiche in rane con chytridiomycosis utilizzando due metodi. In primo luogo, utilizziamo terminal transferasi-mediata dUTP nick end-labelling (TUNEL) in situ istologia per determinare le differenze tra animali clinicamente infetti e non infetti. In secondo luogo, conduciamo un'analisi di serie temporali di apoptosi sopra infezione utilizzando un'analisi della proteina di caspase 3/7.
L'obiettivo generale di questo esperimento è osservare l'effetto del patogeno fungino anfibio batrachochytrium dendrobatidis sull'apoptosi e sulla morte cellulare nel tessuto epidermico delle rane. Questo metodo può aiutarci a capire le malattie della fauna selvatica, ad esempio se l'infezione causa la morte cellulare o, al contrario, se ci sono meccanismi immunitari contro l'infezione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere eseguita su piccoli campioni di biopsia tissutale in modo che piccoli individui possano essere campionati ripetutamente durante il corso dell'infezione.
Per iniziare questa procedura, preparare vetrini idrofili con il tessuto campione come indicato nel protocollo di testo. Per deparaffinare le sezioni di tessuto, lavare i vetrini tre volte con xilene per cinque minuti ciascuno in un barattolo di coplin. Quindi, lavare i vetrini con etanolo al 100% due volte per cinque minuti ciascuno.
Successivamente, lavare i vetrini con etanolo al 95% e etanolo al 70% per tre minuti ciascuno. Quindi, lavare i vetrini una volta con PBS per cinque minuti. Per preparare vetrini sperimentali e di controllo negativi, pretrattare il tessuto aggiungendo direttamente ai vetrini la proteinasi K appena diluita.
Incubare i vetrini per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare i vetrini in PBS due volte per due minuti ciascuno. Per preparare i vetrini di controllo positivi, pretrattare il tessuto con un tampone DN, quindi incubare i vetrini a temperatura ambiente per cinque minuti.
Successivamente, sciogliere la DNasi uno nel tampone DN a una concentrazione finale di 0,1 microgrammi per millilitro. Aggiungere la soluzione di DNasi preparata ai vetrini. Incubare i vetrini per 15 minuti a temperatura ambiente.
Quindi, lavare i vetrini con acqua distillata in un barattolo di coplin cinque volte per tre minuti ciascuno. Spegnere la reazione in perossido di idrogeno al 3% in PBS per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare i vetrini in PBS due volte per due minuti ciascuno.
Quindi, aggiungere un tampone di equilibrio al tessuto sui vetrini. Incubare per 10 secondi a temperatura ambiente. Quindi, picchiettare il liquido in eccesso attorno alla sezione di tessuto.
Diluire l'enzima terminale deossinucleotidil transferasi nel tampone di reazione. Quindi, aggiungerlo al tessuto sui vetrini di controllo sperimentale e positivo. Incubare in una camera umidificata per un'ora a 37 gradi Celsius.
Successivamente, posizionare i vetrini in un barattolo di coplin contenente la concentrazione di lavoro del tampone di arresto. Agitare per 15 secondi e poi incubare i vetrini a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi, lavare i vetrini con PBS tre volte per un minuto ciascuno e picchiettare il liquido in eccesso.
Successivamente, aggiungere il coniugato anti-digossigenina, preriscaldato a temperatura ambiente, direttamente sul tessuto. Incubare i vetrini per 30 minuti a temperatura ambiente in una camera buia umidificata. Al termine dell'incubazione, lavare i vetrini con PBS quattro volte per due minuti ciascuno.
Eliminare il liquido in eccesso. Quindi, aggiungere il mezzo di montaggio alle diapositive. Aggiungere 15 microlitri di soluzione DAPI al mezzo di montaggio sui vetrini.
Coprire ogni vetrino con un vetrino coprioggetti e sigillare con smalto per unghie. Lasciare asciugare i vetrini al buio. Utilizzando un microscopio a fluorescenza, osservare i vetrini immediatamente dopo il completamento del processo in piedi.
Scatta foto 400 volte a intervalli casuali lungo ogni sezione della pelle. Conta le cellule blu colorate con DPI per assicurarti che siano visibili almeno 100 cellule per sezione di pelle per animale. Quindi, conta il numero di celle TUNEL-positive che appaiono come singole celle rosse con bordi chiari.
Per iniziare, usa un microscopio ottico invertito a 40 volte per scattare una foto di ciascuna delle dita dei piedi della rana. Disegna linee attorno al bordo della clip della punta e usa il software di imaging per stimare l'area all'interno della forma. Per valutare la superficie del campione di pelle tridimensionale, moltiplicare l'area stimata per pi greco.
Per estrarre le proteine da un campione congelato di punta di rana, posizionare il campione in una provetta da microcentrifuga con tappo a vite da 1,5 millilitri contenente 100 microlitri di tampone campione e due perle di acciaio inossidabile. Utilizzare un frusta per perline alla massima velocità per lisare le cellule. Dopodiché, metti il tubo sul ghiaccio per tre minuti.
Quindi, centrifugare la provetta per raccogliere il surnatante. Per eseguire il saggio della caspasi 3/7 in una piastra a 384 pozzetti, aggiungere 10 microlitri di tampone campione in bianco e 10 microlitri di estratto proteico in triplicato. Quindi, pipettare 10 microlitri di reagente caspasi 3/7 disponibile in commercio nell'estratto proteico e nei pozzetti in bianco.
Quindi, agitare delicatamente la piastra per 15 secondi per mescolare i due reagenti. Incubare a temperatura ambiente al buio per 30 minuti. Infine, utilizzare un lettore di piastre luminescenti per misurare la luminescenza del campione.
In questo studio, gli animali infetti presentano un numero significativamente maggiore di cellule TUNEL-positive rispetto agli animali di controllo, come illustrato dalle cellule colorate di rosso o rosa. Negli animali di controllo, ci sono poche cellule TUNEL-positive e non sono concentrate nell'epidermide. Negli animali infetti, le cellule TUNEL-positive sono più frequenti nell'epidermide.
Le cellule TUNEL-positive sono più concentrate e direttamente adiacenti al mirino delle cellule infette. Inoltre, ci sono cellule TUNEL-positive più diffuse sull'epidermide e negli strati epidermici che sono più profondi di dove risiedeva il patogeno fungino. Negli animali infetti, ci sono più cellule TUNEL-positive in tutti e tre i tipi di pelle, con un livello particolarmente elevato nella coscia e nella pelle del ventre.
Nel test della caspasi, l'intensità dell'infezione è correlata positivamente con l'attività della caspasi 3/7. Inoltre, l'attività della caspasi 3/7 negli animali infetti e non infetti differiva nel tempo. L'attività della caspasi 3/7 è diminuita entro le prime settimane dopo l'inoculazione e poi è aumentata verso la fine della settima settimana negli animali infetti.
L'attività della caspasi 3/7 è rimasta costante negli individui non infetti. Durante il tentativo di eseguire la procedura per il test TUNEL, è importante leggere i vetrini lo stesso giorno del test per evitare la perdita di sensibilità e conservare i vetrini in un luogo fresco e buio per proteggere i coloranti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come rilevare l'apoptosi e la morte cellulare utilizzando due diversi metodi di rilevamento in piccoli campioni di tessuto come la pelle di anfibio.
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Panoramica
Questo studio analizza l'impatto del patogeno fungino anfibio Batrachochytrium dendrobatidis sull'apoptosi e sulla morte cellulare nel tessuto epidermico delle rane. Utilizzando l'istologia istochimica TUNEL in situ e l'analisi della proteina caspasi 3/7, la ricerca mira a chiarire la relazione tra infezione e morte cellulare.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Malattie selvatiche
- Biologia cellulare
Sfondo
- La quitridiomicosi rappresenta una minaccia significativa per le popolazioni di anfibi.
- Comprendere i meccanismi della morte cellulare può contribuire agli sforzi di conservazione.
- L'apoptosi potrebbe svolgere un ruolo nella risposta alle infezioni fungine.
- Campioni tissutali di piccole dimensioni permettono analisi ripetute durante tutta l'infezione.
Scopo dello studio
- Quantificare la morte cellulare dell'epidermide in rane infette da chitridiomicosi.
- Determinare le differenze nell'apoptosi tra rane infette e non infette.
- Analizzare il decorso temporale dell'apoptosi durante l'infezione.
Metodi Utilizzati
- Etichettatura degli estremi frammentati del DNA mediata da terminal transferasi (TUNEL) per l'analisi istologica.
- Analisi proteica delle caspasi 3/7 per la valutazione in serie temporale.
- Preparazione di vetrini in vetro idrofilo con campioni di tessuto.
- Deparaffinizzazione delle sezioni di tessuto mediante lavaggi con xilolo ed etanolo.
Risultati principali
- Sono state osservate differenze nei tassi di apoptosi tra rane infette e non infette.
- L'analisi delle serie temporali ha rivelato tendenze nella morte cellulare nel corso dell'infezione.
- I metodi hanno dimostrato efficacia nell'analizzare campioni tissutali di piccole dimensioni.
- Le informazioni ottenute potrebbero contribuire alla comprensione delle risposte immunitarie all'infezione.
Conclusioni
- Lo studio fornisce dati preziosi sugli effetti della chytridiomicosi sulle cellule epidermiche delle rane.
- Comprendere l'apoptosi in questo contesto potrebbe contribuire a strategie di conservazione della fauna selvatica.
- Ricerche future potrebbero esplorare i meccanismi immunitari contro le infezioni fungine.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
Questo studio dimostra come i saggi di apoptosi possano essere utilizzati per valutare i danni tissutali indotti da patogeni nei modelli di malattie della fauna selvatica, fornendo un quadro per la riduzione del rischio meccanicistica nella validazione precoce dei bersagli. Quantificando la morte cellulare epidermica in rane infettate da Batrachochytrium dendrobatidis, questo approccio rafforza la capacità predittiva nella valutazione delle interazioni ospite-patogeno e orienta la scoperta di biomarcatori traslazionali. L'uso di piccole biopsie tissutali consente un campionamento longitudinale, fondamentale per monitorare l'evoluzione della malattia e l'intervento terapeutico in sistemi preclinici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche distinguendo l'apoptosi indotta dal patogeno dai meccanismi di difesa dell'ospite nel tessuto epidermico.
- Valore operativo: Fornisce dati spazialmente risolti sulla morte cellulare mediante colorazione TUNEL, chiarificando i meccanismi di alterazione tissutale nei modelli di malattia infettiva.
- Valore predittivo: Sostiene la fiducia sul bersaglio correlando l'attività delle caspasi 3/7 al carico infettivo nel tempo, permettendo analisi di risposta dose-dipendente e profili temporali.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Stabilisce protocolli standardizzati per il rilevamento dell'apoptosi in campioni tissutali di piccole dimensioni, consentendo schermate riproducibili di composti in condizioni con materiale limitato.
- Valore operativo: Il saggio della caspasi 3/7 offre compatibilità con schermate ad alto rendimento per esperimenti in serie temporale, mentre il test TUNEL fornisce la validazione dei modelli spaziali di apoptosi.
- Prontezza del saggio: La microscopia fluorescente e i segnali luminiscenti generano output quantitativi adatti all'ottimizzazione del saggio e alla riproducibilità tra laboratori.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega l'apoptosi epidermico alla gravità della malattia, sostenendo l'allineamento di biomarcatori tra letture molecolari e progressione clinica dell'infezione.
- Valore operativo: Consente decisioni di avanzamento aggiustate per il rischio, monitorando la dinamica delle caspasi 3/7 attraverso le fasi dell'infezione in studi longitudinali.
- Continuità traslazionale: Dimostra come saggi istologici e biochimici dell'apoptosi possano essere combinati per rafforzare la validità preclinica nei modelli di malattie infettive.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta fornendo letture dell'apoptosi che supportano la validazione del bersaglio e l'identificazione dei composti promettenti, in particolare negli studi in cui la disponibilità del tessuto limita l'istologia convenzionale.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica di ipotesi su se l'esposizione a patogeni induca o sopprima l'apoptosi nel tessuto ospite, chiarificando i meccanismi di danno tissutale.
- Screening: Il saggio della caspasi 3/7 consente uno screening quantitativo e scalabile di modulatori che influenzano l'apoptosi in campioni bioptici di piccole dimensioni.
- Analisi: I segnali luminiscenti e fluorescenti forniscono misurazioni quantificabili e normalizzate per confrontare l'apoptosi tra diverse condizioni e punti temporali.
- Ricerca traslazionale: Correla l'attività molecolare dell'apoptosi con modifiche istopatologiche, supportando la qualificazione di biomarcatori in modelli preclinici.
- Riutilizzo aziendale: L'approccio combinato di TUNEL e caspasi 3/7 stabilisce una piattaforma riutilizzabile per il profilo dell'apoptosi in studi su malattie infettive e tossicologia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica distinguendo localizzazione e cinetica dell'apoptosi nei tessuti infetti rispetto ai tessuti di controllo.
- Valore operativo: Protocolli standardizzati di preparazione dei vetrini e di acquisizione delle immagini garantiscono la riproducibilità tra laboratori e lotti di campioni.
- Valore strategico: Permette decisioni precoci di tipo go/no-go fornendo biomarcatori precoci dello stress tissutale e dell'impatto del patogeno.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio degli obiettivi quantificando l'apoptosi come lettura funzionale del meccanismo della malattia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in istologia, microscopia a fluorescenza ed estrazione di proteine da campioni tissutali limitati.
- È subordinato all'accesso a criostato, microscopio a fluorescenza e lettore luminometrico per saggi TUNEL e caspasi 3/7.
- Necessita di standardizzazione tra gli utilizzatori per il taglio dei tessuti, i tempi di colorazione e le impostazioni di acquisizione delle immagini, al fine di mantenere la sensibilità del saggio.
- L'adattamento ad altri sistemi modello richiede la validazione della penetrazione degli anticorpi e dell'accessibilità enzimatica in diversi tipi di tessuto.
- Limite pratico: le piccole biopsie delle dita dei piedi limitano il rendimento proteico, richiedendo metodi alternativi di normalizzazione, come la stima della superficie cutanea tramite imaging, per evitare il consumo dell'estratto.
