Name: Costruzione del fago sintetico visualizzato favolosa biblioteca con diversità su misura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Impara a costruire una libreria di anticorpi umani sintetici visualizzati su fago con diversità su misura. Questo metodo sostituisce le tecniche tradizionali basate su ibridoma per lo sviluppo di anticorpi monoclonali terapeutici.

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Gli autori apprezzano Dr. Frederic Fellouse dal laboratorio Sidhu per osservazioni critiche sulla costruzione della libreria di Kunkel metodo basata sintetica dei fagi Fab. Gli autori apprezzano la signora Alevtina Pavlenco e gli altri membri dal laboratorio Sidhu per il prezioso aiuto di preparazione ad alta efficienza elettro-competenti le cellule e. coli e alta qualità dU-ssDNA. Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (Grant No.: 81572698, 31771006) a DW e dall'Università di ShanghaiTech (Grant No.: F-0301-13-005) al laboratorio di ingegneria dell'anticorpo.

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<li>Huang, R., Fang, P., Kay, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+to+the+Kunkel+mutagenesis+protocol+for+constructing+primary+and+secondary+phage-display+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Improvements to the Kunkel mutagenesis protocol for constructing primary and secondary phage-display libraries.</a> Methods. 58 (1), 10-17 (2012).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Per costruire alta diversità, dei fagi-visualizzato Fab biblioteche, controllo di qualità sono necessari punti di controllo per monitorare le varie fasi del processo di costruzione, tra cui la competenza delle celle electro-competenti, qualità del modello dU-ssDNA, efficienza di CCC-dsDNA sintesi, titolo dopo elettroporazione, Fab pieghevole e diversità dell'amminoacido di CDRs mediante analisi di sequenza di cloni di Fab-fago.
Alta resa e purezza di dU-ssDNA è essenziale per tasso di alta mut...

anticorpi monoclonali hanno vaste applicazioni che vanno dalla ricerca di base alla malattia diagnostica e terapeutica. A partire dal 2016, mAbs più di 60 sono stati approvati dagli Stati Uniti Food and Drug Administration (USFDA) per il trattamento clinico delle malattie autoimmuni, il cancro e malattie infettive1,2.
Nel 1975, Kohler e Milstein segnalato una tecnica per la generazione continua di anticorpi di una singola specificità clonale da una fonte cellulare indicata come 'ibridomi' e questa tecnica è successivamente diventato una pietra miliare nella medicina e nell'industria3 ,4. Generazione di anticorpi monoclonali da questo metodo richiede vari passaggi tra cui la produzione dell'antigene, l'immunizzazione del mouse, estrazione dei linfociti B, fusione di cellule B con cellule di mieloma per formare cellule di ibridoma immortale, selezione clonale e per le applicazioni terapeutiche, umanizzazione è necessaria per evitare di anticorpo umano anti-topo (HAMA)4,5. Tuttavia, per questa tecnologia, gli antigeni incluse proteine altamente conservati tossine e agenti patogeni sono relativamente inefficaci nell'innescare la risposta immunitaria in vivo per mAb produzione5.
Nel 1978, Hutchison et al ha segnalato l'uso di un oligonucleotide di mutagenesi diretta di un residuo in un singolo filamento batteriofago virus6. Nel 1985, Smith ha riferito che frammenti di gene estraneo possono essere fuso nel telaio con del gene che codifica la proteina di cappotto dei fagi III e pertanto possono essere visualizzati sulla superficie dei fagi senza compromettere la sua infettività7. Questi lavori pionieristici gettato le basi per la successiva costruzione di librerie anticorpali dei fagi-visualizzati nel sistema immunitario, ingenuo, e sintetico forme con i formati del frammento variabile singola catena (scFv) e antigene-legante frammento (Fab) per terapeutico mAb sviluppo8,9. Dal punto di vista tecnico, lo sviluppo dei fagi dell'anticorpo basato su display offre un approccio complementare allo sviluppo basato su ibridoma mAb che possa aiutare ad per aggirare le limitazioni che possono rappresentare alcuni antigeni e processo di umanizzazione che anticorpi derivati ibridoma spesso richiedono5. A partire dal 2016, 6 phage display-derivato mAbs sono state approvate nel mercato compreso Humira, uno dei più riusciti mAbs utilizzato per il trattamento dell'artrite reumatoide, e molti dei fagi display-derivato dell'anticorpo candidati sono attualmente in varie fasi della clinica indagine10.
Per librerie anticorpali fagiche immunitario e ingenuo, la diversità di dideterminazione regioni (CDR) nella catena leggera e pesante è derivato dal repertorio immune naturale (vale a dire, dalle cellule di B). Al contrario, la diversità di CDRs in librerie anticorpali sintetico dei fagi è interamente artificiale. Approcci sintetici per la costruzione della libreria forniscono il controllo preciso sopra il disegno della diversità di sequenza e offrono opportunità per studi meccanicistici di struttura dell'anticorpo e funzionano11,12. Inoltre, il framework per le librerie sintetiche può essere ottimizzato prima costruzione della libreria per facilitare a valle, lo sviluppo industriale su larga scala11,12.
Nel 1985, Kunkel segnalati un approccio di mutagenesi basate su modelli single-stranded DNA (ssDNA) per introdurre le mutazioni sito-diretta in batteriofago M13 efficientemente13. Questo approccio è stato successivamente utilizzato ampiamente per costruzione delle librerie dei fagi-visualizzato. Oligonucleotidi di DNA sintetizzati chimicamente progettati per introdurre diversità nella Fab CDRs sono incorporati in un phagemid con un modello di spina dorsale dell'anticorpo. In questo processo, il phagemid è espressa come un uracile-contenente ssDNA (dU-ssDNA) e gli oligonucleotidi sono ricotto sul CDRs ed estesa per sintetizzare DNA a doppia elica (dsDNA) in presenza di DNA di T7 polimerasi e T4 DNA ligasi. Infine, generato ds-DNA può essere introdotto in Escherichia coli mediante elettroporazione.
Per elevata diversità, costruzione della libreria dei fagi-visualizzati, elettroporazione ad alta tensione di una miscela di due componenti delle cellule electro-competenti e covalenza dsDNA circolare chiusa (CCC-dsDNA) deve essere preparato con cura. Sidhu et per volta la preparazione di cellule competenti di electro e DNA da metodi tradizionali e notevolmente migliorato biblioteca diversità14.
In questo protocollo, descriviamo un metodo per la costruzione di librerie Fab dei fagi-visualizzato sintetiche con le diversità del9-10 1010 ottenibili con un singolo elettroporazione. La figura 1 Mostra una panoramica della libreria costruzione tra cui: 1) preparazione delle cellule electro-competente ad alta efficienza; 2) estrazione di dU-ssDNA; 3) metodo di Kunkel base mutagenesi oligonucleotide-diretta; 4) elettroporazione e calcolo della dimensione di biblioteca; 5) proteina A/L-based ELISA per la piegatura e la valutazione della diversità funzionale; e 6) analisi di sequenza del DNA della diversità. Tutti i reagenti, ceppi e attrezzature sono elencati nella tabella del materiale. La tabella 1 Mostra la configurazione di reagente.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagenti</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,0 M H3PO4</td><td>Fisher</td><td>AC29570</td><td></td></tr><tr><td>1,0 M Tris, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15568-025</td><td></td></tr><tr><td>10 mM ATP</td><td>Invitrogen</td><td>18330-019</td><td></td></tr><tr><td>100 mM ditiotreitolo</td><td>Fisher</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dNTP miscela</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4065-60</td><td>soluzione contenente 25 mM ciascuno di dATP, dCTP, dGTP e dTTP.</td></tr><tr><td>3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB)</td><td>Kirkegaard & Perry Laboratories Inc</td><td>50-76-02</td><td></td></tr><tr><td>50X TAE</td><td>Invitrogen</td><td>24710030</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Fisher</td><td>BP160</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillina, carb</td><td>Sigma</td><td>C1389</td><td>100 mg/mL in acqua,&nbsp; 0,22 &mu; m filtro-sterilizzare, concentrazione di lavoro: 100 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Cloramfenicolo, cmp</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>100 mg/mL in etanolo, 0,22 &mu; m filtro-sterilizzare, concentrazione di lavoro: 10 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9620G</td><td></td></tr><tr><td>agar granulato</td><td>VWR</td><td>J637-500G</td><td></td></tr><tr><td>H2O2 substrato di perossidasi</td><td>Kirkegaard & Perry Laboratories Inc</td><td>50-65-02</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>795488</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina, kan</td><td>Fisher</td><td>AC61129</td><td>50 mg/mL in acqua,&nbsp; 0,22 &mu; m filtro-sterilizzazione, concentrazione di lavoro: 50 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P2222</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>94046</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>U19C015</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop Fisher</td><td></td><td>ND2000C</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS256</td><td>! ATTENZIONE Il NaOH provoca ustioni.</td></tr><tr><td>Latte in polvere NON magro</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600669</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Fisher</td><td>BP233</td><td></td></tr><tr><td>Proteina A-HRP coniugato</td><td>Invitrogen</td><td>101123</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin M13 Kit</td><td>Qiagen</td><td>22704</td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione del gel QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>Kit di purificazione QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Proteina ricombinante L</td><td>Fisher</td><td>77679</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA polimerasi</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203S</td><td></td></tr><tr><td>T4 polinucleotide chinasi</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>T7 DNA polimerasi</td><td>New England Biolabs</td><td>M0274S</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina, tet</td><td>Sigma</td><td>T7660</td><td>50 mg/mL in acqua, 0. 22 &mu; m filtro-sterilizzare, concentrazione di lavoro: 10 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Fisher</td><td>0123-07-5</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20 Sigma</td><td></td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo ultrapuro</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Uridina</td><td>Sigma</td><td>U3750</td><td>25 mg/mL in etanolo, concentrazione di lavoro: 0,25 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>VWR</td><td>DF0127-08</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company </td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E.coli CJ236</td><td>New England Biolabs</td><td>E4141</td><td>Genotipo: dut-&nbsp; ung-&nbsp; thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Utilizzato per la preparazione di dU-ssDNA.</td></tr><tr><td>E.coli SS320</td><td>Lucigen</td><td>60512</td><td>Genotipo: [F'proAB+lacIq lacZ&Delta; M15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 &Delta; (araABC-leu)7679 e Delta; lacX74 galUgalK rpsL thi. Ottimizzato per l'elettroporazione ad alta efficienza e la produzione di batteriofagi filamentosi.</td></tr><tr><td>M13KO7</td><td>New England Biolabs</td><td>N0315S</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda </td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2-cm gap electroporation cuvetta</td><td>BTX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-pozzetto 2mL Piastre a pozzetti profondi</td><td>Fisher</td><td>278743</td><td></td></tr><tr><td>96 pozzetti Maxisorp</td><td>piastre Nunc</td><td>151759</td><td></td></tr><tr><td>Flaconi deflettori</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da banco</td><td>Eppendorf</td><td>5811000096</td><td></td></tr><tr><td>Flaconi per centrifuga</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECM-630 Elettroporatore</td><td>BTX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetic ancorette</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo Fisher centrifuga</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitatore ad alta velocità</td><td>TAITEK</td><td>MBR-034P</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore per micropiastre</td><td>QILINBEIER</td><td>QB-9002</td><td></td></tr><tr><td>Gestore di liquidi per 96 e 384 pozzetti</td><td>RAININ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetta multicanale</td><td>RAININ</td><td>E4XLS</td><td></td></tr><tr><td>Amicon concentratore</td><td>Merck</td><td>UFC803096</td><td></td></tr></tbody></table>

costruzione del fago sintetico visualizzato favolosa biblioteca con diversità su misura

Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity

Domanda per gli anticorpi monoclonali (mAbs) nella ricerca di base e la medicina è in aumento ogni anno. Tecnologia dell'ibridoma è stato il metodo dominante per lo sviluppo di mAb dal suo primo rapporto nel 1975. Come una tecnologia alternativa, metodi di visualizzazione dei fagi per sviluppo di mAb sono sempre più attraente poiché Humira, il primo anticorpo dei fagi-derivato e uno dei Best-Seller mAbs, è stato approvato per il trattamento clinico dell'artrite reumatoide nel 2002. Come un non-animale basato su tecnologia di sviluppo di mAb, esposizione dei fagi bypassa l'immunogenicità dell'antigene, umanizzazione e manutenzione degli animali che sono richiesti da ibridomi tradizionale tecnologia basato lo sviluppo di anticorpi. In questo protocollo, descriviamo un metodo per la costruzione di librerie Fab dei fagi-visualizzato sintetiche con le diversità del9-10 1010 ottenibili con un singolo elettroporazione. Questo protocollo si compone di: 1) preparazione delle cellule electro-competente ad alta efficienza; 2) estrazione di uracile-contenenti DNA single-stranded (dU-ssDNA); 3) metodo di Kunkel base mutagenesi oligonucleotide-diretta; 4) elettroporazione e calcolo della dimensione di biblioteca; 5) analisi della proteina A/L-based enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) per la piegatura e la valutazione della diversità funzionale; e 6) analisi di sequenza del DNA della diversità.

Seguendo il diagramma di flusso della costruzione favolosa biblioteca (Vedi Figura 1), abbiamo preparato M13KO7 helper dei fagi pre-infettato 320 Escherichia coli cellule electro-competenti. L'efficienza di queste cellule electro-competente è stimato come 2 X 109 cfu / µ g quando la spina dorsale phagemid Fab per la costruzione della libreria è stata utilizzata (Figura 4).
<p class="jove_content" fo:keep-t...

Questo protocollo descrive una procedura dettagliata per la costruzione di una libreria dei fagi-visualizzato anticorpo sintetico con diversità su misura. Gli anticorpi sintetici hanno vaste applicazioni dalla ricerca di base alla malattia diagnostica e terapeutica.

Costruzione del fago sintetico visualizzato favolosa biblioteca con diversità su misura

Demand for monoclonal antibodies (mAbs) in basic research and medicine is increasing yearly. Hybridoma technology has been the dominant method for mAb ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fornire ai lettori un'esperienza pratica dettagliata nella costruzione di una libreria di anticorpi umani sintetici visualizzati con fagi con una diversità su misura. Le librerie di anticorpi sintetici con esposizione di fagi hanno un grande potenziale per sostituire le tecniche tradizionalmente basate sull'ibridoma per lo sviluppo terapeutico di anticorpi monoclonali, bypassando la necessità di immunizzazione animale e la successiva umanizzazione degli anticorpi. Il vantaggio della libreria di anticorpi sintetici è che la diversità su misura viene introdotta in un quadro di anticorpi utilizzando informazioni sulla diversità posizionale che supportano un'interazione ad alta affinità e proprietà proteiche desiderabili.Oltre all'utilità pratica, le librerie di anticorpi sintetici possono anche essere utilizzate per sondare sperimentalmente il ruolo di specifici amminoacidi nelle interazioni biomolecolari, supportando così il loro continuo miglioramento. Questa procedura sarà dimostrata dallo studente laureato di nome Zhenwei Zhong e dal dottor Shin-chen Hou del nostro laboratorio. Essere

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In questo video, dimostriamo la tecnica di visualizzazione dei fagi per isolare proteine pre-ingegnerizzate che esprimono proteine con un'elevata affinità per la proteina bersaglio.

Utilizzo del phage display per selezionare proteine con elevata affinità per una proteina target

Phage display è una tecnica potente per catturare proteine ​​o porzioni di proteine ​​che interagiscono con una molecola immobilizzata di interesse. Una volta presa una decisione del tipo di libreria di cDNA fagi per creare e lo schermo, il protocollo qui descritto consente la selezione affinità efficiente che porta alla identificazione di interattori.

Un protocollo per Phage Display e affinità selezione con esche proteina ricombinante

Un metodo è descritto con accompagnamento visivo per lo svolgimento scalabili, selezioni elevati di throughput da combinatorie librerie di anticorpi sintetici fagi-mostrato contro centinaia di antigeni contemporaneamente. Usando questo approccio parallelo, abbiamo isolato frammenti anticorpali che presentano elevata affinità e specificità per diversi antigeni che sono funzionali in immunodosaggi standard.

Scalabile High Throughput Selection Da sintetici Biblioteche Antibody fagi-visualizzato

Una nuova generazione di piattaforme senza cellula trascrizione-traduzione è stata progettata per costruire sistemi biochimici in vitro mediante l'esecuzione di circuiti di gene. In questo articolo, descriviamo come batteriofagi, quali MS2, ΦΧ174 e T7, sono sintetizzati dal loro genoma utilizzando un sistema di TXTL senza cellula e. coli .

Sintesi dei batteriofagi infettive in un e. coli -basato sistema di espressione senza cellula

I protocolli descritti consentono la costruzione, la caratterizzazione e la selezione (contro il bersaglio di scelta) di una libreria di "domainome" fatta da qualsiasi fonte di DNA. Questo risultato è ottenuto da una pipeline di ricerca che combina diverse tecnologie: phage display, un reporter pieghevole e sequenziamento di nuova generazione con uno strumento web per l'analisi dei dati.

Interactoma-Seq: Un protocollo per la costruzione della libreria Domainome, la convalida e la selezione di Phage Display e sequenziamento di nuova generazione

La creazione di sistemi di dimerizzazione delle proteine indotta chimicamente con l'affinità e la specificità desiderate per ogni piccolo ligando molecolare avrebbe molte applicazioni biologiche di rilevamento e attuazione. Qui, descriviamo un metodo efficiente e generalizzabile per l'ingegneria de novo di sistemi di dimerizzazione chimicamente indotti attraverso la selezione graduale di una libreria di anticorpi combinatori combinatori e di foragi.

Creazione di sistemi di dimerizzazione delle proteine altamente specifici indotta chimicamente mediante la selezione stepwise di phage di una biblioteca combinatoria di anticorpi a dominio singolo

L'ubiquitinazione è una modificazione post-traduzionale critica della proteina, la cui disregolazione è stata implicata in numerose malattie umane. Questo protocollo descrive in dettaglio come la visualizzazione dei fagi può essere utilizzata per isolare nuove varianti di ubiquitina in grado di legare e modulare l'attività delle ligasi E3 che controllano la specificità, l'efficienza e i modelli di ubiquitinazione.

Utilizzo di Phage Display per sviluppare modulatori varianti di ubiquitina per le ligasi E3

Un metodo semplice per l'identificazione di batteri patogeni priorità è quella di utilizzare fago giornalista geneticamente modificato. Queste fago reporter, che sono specifici per la loro specie ospite particolare, sono in grado di trasduzione rapidamente una risposta bioluminescente segnale alle cellule ospite. Qui, descriviamo l'uso del fago giornalista per la rilevazione...

Phage &#39;Bioluminescent&#39; Reporter per il rilevamento di batteri patogeni di categoria A

Questo protocollo offre un passo-passo procedura per monitorare il comportamento singola cellula dei batteri diversi nel tempo con modalità automatizzate fluorescenza microscopia time-lapse. Inoltre, forniamo le linee guida su come analizzare le immagini di microscopia.

Cellulare Imaging in diretta di Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Utilizzando automatico Time-lapse Microscopia

Descriviamo un metodo efficace per separare singolo filamento di DNA a doppio filamento di DNA e le molecole di RNA virale ambientale comunità. Gli acidi nucleici sono frazionate mediante cromatografia di idrossiapatite con concentrazioni crescenti di fosfati contenenti buffer. Questo metodo consente l'isolamento di tutti i tipi virali acidi nucleici da campioni ambientali.

Separazione di DNA a singolo filamento, doppia elica del DNA e RNA da una Comunità Ambientale virale usando la cromatografia idrossiapatite

Impara a costruire una libreria di anticorpi umani sintetici visualizzati su fago con diversità su misura. Questo metodo sostituisce le tecniche tradizionali basate su ibridoma per lo sviluppo di anticorpi monoclonali terapeutici.

Costruzione del fago sintetico visualizzato favolosa biblioteca con diversità su misura

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