Microdissection di segmenti di tessuto renale primario e incorporazione con tecnologia romanzo costrutto senza impalcatura

L'obiettivo generale di questa procedura di dissezione microscopica è isolare segmenti discreti di tessuto renale vivente con architettura renale intatta per applicazioni di ingegneria tissutale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ingegneria tissutale, ad esempio è possibile raccogliere sterili interi segmenti di tessuto di organi primari isolati ed essere mantenuti in vita in coltura? Il vantaggio principale di questa tecnica è che i segmenti contengono un'architettura renale intatta rispetto all'utilizzo di linee cellulari per ricreare un organo complesso con oltre 26 diversi tipi di cellule.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia della malattia renale allo stadio terminale perché questi costrutti miglioreranno la filtrazione e possono aiutare i pazienti a non dialisi. Durante l'intervento, indossare un'attrezzatura chirurgica adeguata, tra cui una maschera e un berretto per ridurre al minimo il rischio di contaminazione. Allo stesso modo, fai ogni sforzo per mantenere la sterilità per tutto il tempo.

Iniziare i preparativi drappeggiando il tavolo operatorio. Quindi, aprire la confezione degli strumenti autoclavati sui teli sterili. Devono includere tre piccoli emostatici, pinze fini con denti, pinze fini senza denti e forbici dell'iride dritte.

Coprire il centro del tavolo operatorio con un secondo telo chirurgico non fenestrato. Prima di allestire la sala operatoria, preparare 50 millilitri di DBPS integrato con antibiotico e aliquotare cinque millilitri in una provetta da 15 millilitri. Ora anestetizza un topo C57 black six di 8-12 settimane e monitora periodicamente il livello di anestesia valutando il suo riflesso del pedale con un pizzico deciso.

Quindi, usa una crema depilatoria per rimuovere tutti i peli dalla zona ventrale del busto e risciacqua la crema e i capelli con acqua distillata. Quindi trasferire il mouse sul tavolo operatorio e posizionarlo supino sotto il telo non fenestrato. Ora ritaglia una fenestrazione quadrata di due centimetri nel drappo sopra l'addome del topo.

Quindi strofinare la pelle esposta con iodio povidone seguito da etanolo al 70% tre volte per sterilizzare la pelle e completare i preparativi per l'intervento chirurgico. Inizia l'intervento usando una pinza sottile con denti e forbici dell'iride. Fai un'incisione cutanea di tre o quattro centimetri parallela alla linea mediana, mezzo centimetro a sinistra della linea mediana.

Quindi, afferra il peritoneo usando una pinza sottile senza denti e incidi con le forbici dell'iride per entrare nella cavità addominale. Quindi applicare gli emostatici sui bordi laterali superiore e inferiore della pelle e del peritoneo per posizionare la tensione lateralmente e migliorare l'esposizione. Ora sposta delicatamente il contenuto intestinale a destra dell'addome per esporre il rene sinistro.

Quindi posizionare delicatamente la trazione sul rene per sollevarlo dall'addome. Ora posiziona un emostatico attraverso l'ilo del rene e usa le forbici dell'iride per sezionare l'uretere e i vasi renali. Quindi trasferire il rene nella provetta di DBPS all'1% di penna-streptococco su ghiaccio.

Portare questa provetta in una cappa di coltura sterile per la lavorazione. Lì trasferisci il rene in una capsula di Petri da 60 millimetri e sciacqualo due volte con cinque millilitri freschi di DPBS contenenti calcio e magnesio. Dopo il secondo lavaggio, sospendere il rene in cinque millilitri freschi di DBPS in un nuovo piatto da 60 millimetri.

Quindi preparare un'ulteriore capsula di Petri contenente solo cinque millilitri di DBPS per un uso successivo. Continuare a utilizzare la tecnica sterile, inclusi guanti sterili, maschera chirurgica e bouffant per ridurre al minimo i rischi di contaminazione. Quindi drappeggiare l'area del tavolino e l'area circostante lo stereomicroscopio.

Quindi, posizionare i fogli di plastica adesiva sulle manopole di messa a fuoco del microscopio e spruzzarli con etanolo al 70%. Quindi accendi il doppio illuminatore a collo d'oca per illuminare il palco. Ora sui teli sterili, apri una confezione di strumenti sterilizzati contenenti pinze sottili senza denti, un manico di bisturi, una lama di bisturi numero 15, due emostatici dritti e due aghi a foro cavo calibro 30,5.

Posiziona la lama numero 15 sul manico del bisturi e attacca un emostatico a ciascun mozzo dell'adattatore dell'ago per creare strumenti di dissezione dell'ago. A questo punto trasferire le due piastre, una con il rene in DPBS e l'altra solo in DPBS, nell'area del microscopio. Rimuovere il coperchio del piatto renale e mettere a fuoco il microscopio sulla superficie anteriore o posteriore del rene con un ingrandimento da 3,2 a 4X.

Successivamente, con la mano non dominante, usa una pinza fine senza denti per perforare e bloccare il rene contro il piatto ai poli inferiore e superiore del rene. Quindi, con la mano dominante, utilizzare la lama numero 15 per rimuovere lo strato capsulare fibroso traslucido dalla superficie esposta. Radere la superficie più superficiale di 0,5 millimetri dalla superficie esposta del rene per rimuovere il resto della capsula.

Continua usando la lama numero 15 per sezionare una piramide rovesciata di tessuto dall'area decapsulata che è di circa due millimetri quadrati. Quindi trasferire il fazzoletto nella capsula pulita di DBPS e scartare il resto del rene. Ora concentrati sul tessuto sezionato e riduci l'ingrandimento da 1,5 a 2,0X.

Utilizzando i due strumenti dell'ago dell'emostatico come strumenti da taglio, tagliare il frammento di tessuto in pezzi progressivamente più piccoli fino a quando i segmenti di tessuto non hanno le dimensioni delle punte dell'ago o più piccoli. Dovrebbero essere prodotti circa 50 segmenti. Questa è una parte fondamentale della procedura.

Ogni segmento deve approssimare il diametro della punta dell'ago calibro 30-1/2 per evitare segmenti di grandi dimensioni che potrebbero ostacolare la diffusione. Rimettere il tessuto nella cappa di coltura tissutale e rimuovere il DPBS utilizzando una micropipetta P1000. Quindi aggiungere nuovamente cinque millimetri di DMEM integrato con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di pen-streptococco.

Quindi coltivare il tessuto o impiantarlo immediatamente all'interno di costrutti cellulari. La vitalità dei segmenti renali intatti prodotti dalla procedura descritta è stata esaminata per tre giorni in coltura utilizzando un test di vitalità. La calcium AM fluorescente verde è presente con attività esterasi intracellulare indicativa di cellule viventi.

L'omodimero di etidio-1 fluorescente rosso si osserva con perdita di integrità della membrana plasmatica. Quando i segmenti renali sono stati incorporati in costrutti di fibroblasti endoteliali privi di scaffold , entro il terzo giorno sono stati incorporati con i costrutti cellulari per formare strutture intatte. I costrutti hanno mantenuto la loro rete endoteliale pre-vascolare mostrata dalla marcatura con il fattore di von Willebrand.

Le cellule epiteliali renali possono essere viste in verde marcate da cytokertain-18. Per testare la funzionalità renale in vitro, i costrutti sono stati incubati con albumina marcata con FITC. Mentre c'era albumina residua trovata lontano dai segmenti di tessuto renale incorporato, c'erano anche hotspot nelle cellule epiteliali tubulari renali.

Questi punti caldi sono l'albumina che attraversa intraluminalmente e si pensa rappresenti la ricaptazione dell'albumina nel costrutto cellulare del segmento renale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare i segmenti renali dai reni murini per applicazioni di ingegneria tissutale. Una volta padroneggiata, questa procedura può essere eseguita in una o 1-1/2 ore.

Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, tra cui la semina di costrutti cellularizzati, al fine di rispondere ad altre domande riguardanti la fabbricazione e la caratterizzazione dei costrutti renali. Non dimenticare che lavorare con strumenti chirurgici e bombole di ossigeno pressurizzate può essere estremamente pericoloso. Prestare attenzione quando si lavora con oggetti appuntiti e ricordarsi di ancorare le bombole di ossigeno a un banco da laboratorio.