Name: Ricombinante collagene Peptide Microcarriers per lespansione delle cellule e loro potenziale utilizzo come sistema di consegna di cella in un bioreattore modello (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Scopri l'espansione cellulare su microvettori macroporosi per l'ingegneria tissutale utilizzando bioreattori a perfusione. Questo metodo consente la consegna di cellule senza raccolta in siti di difetto per applicazioni cliniche.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

La ricerca che porta a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dall'Unione europea settimo quadro programma FP7/2007-2013 sotto accordo di finanziamento n ° 607051 (BIO-ispirare). Ringraziamo Carolien van Spreuwel-Goossens da Fujifilm Manufacturing Europe B.V., per l'assistenza tecnica durante la produzione di RCP e Werner Stracke dall'Istituto Fraunhofer per silicato ricerca ISC, per assistenza con l'analisi di SEM.

hBMSCs sono stati isolati dalla testa del femore di pazienti di osteoartrite che subiscono la chirurgia di sostituzione della testina del femore. La procedura è stata eseguita sotto l'approvazione del comitato etico locale dell'Università di Wuerzburg e consenso informato dei pazienti. Cellule endoteliali microvascolari primarie sono state isolate da biopsie di prepuzio dei donatori giovanile. Loro in qualità di rappresentante legale fornito pieno consenso informato per iscritto. Lo studio è stato approvato dal comitato etico locale dell'Università di Wuerzburg (votazione 182/10).
1. isolamento di hBMSCs e HDMECs
<ol><li>Derivate da midollo osseo cellule mesenchimali umane stromali (hBMSCs)<ol>
<li>Rimuovere osso spugnoso dalla testa del femore utilizzando un cucchiaio sterile. Nota: L'osso spugnoso appare come una sostanza sciolto e granulare all'interno dell'osso corticale, che è duro e rigido. Può essere necessario novo parti dell'osso spugnoso da osso corticale usando un bisturi.</li>
		<li>Inserire l'osso spugnoso rimosso in due provette da 50 mL. Il volume dell'osso spugnoso può variare da 5 a 10 mL secondo la dimensione della testa del femore rimossa durante la chirurgia di sostituzione dell'anca.</li>
		<li>Lavare con DMEM-F12 (miscela 1:1 di medium DMEM e prosciutto F12), riempire il tubo con circa 30 mL di terreno.</li>
		<li>Agitare manualmente, il tubo in modo longitudinale, per 5 s per lasciare che le cellule adipose dall'osso spugnoso. Centrifugare a 300 x g e 22 ° C per 5 min.</li>
		<li>Aspirare con una pipetta di plastica graduata, lo strato delle cellule di grasso e circa 20 mL di surnatante rimanente. Lasciate abbastanza medio per coprire l'osso spugnoso.</li>
		<li>Riempire le provette con 10 ml di DMEM-F12 e agitare vigorosamente longitudinalmente, per 10-15 s, di lasciare le cellule fuori.</li>
		<li>Consente di trasferire un nuovo tubo 50 mL 10-15 mL di sospensione cellulare con una pipetta di plastica graduata dai tubi.</li>
		<li>Ripetere 2 - 3 volte dal passo 1.1.6 pool insieme la sospensione cellulare ottenuta fino a quando l'osso spugnoso raccolto nel tubo 50 mL è bianco.</li>
		<li>Trasferire la sospensione cellulare con una pipetta di plastica graduata in due nuove provette, evitando aspirando il pellet di collagene depositato sul fondo delle provette 50ml.</li>
		<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g e 22 ° C per 5 min. eliminare il supernatante aspirando con una pipetta di plastica graduata.</li>
		<li>Aggiungere 40 mL di DMEM-F12 10% FCS 1% Pen/Strep 50 µ g/mL dell'ascorbato-2-fosfato in un terzo tubo. Trasferire 5 mL di questo mezzo ogni provetta contenente il pellet cellulare. Risospendere il pellet cellulare di sfarfallamento vigorosamente il fondo della provetta e trasferire le sospensioni delle cellule nella provetta contenente solo mezzo.</li>
		<li>OPTIONAL: Diluire 100 µ l della sospensione di cellule per il conteggio delle cellule, diluizione 1: 100 prima con PBS e poi 01:10 in blu di trypan, aggiungendo 15 µ l della diluizione prima a 15 µ l di DPBS e 30 µ l Trypan blu per ottenere un DPBS: rapporto tripan blu 1:1. Contare le celle con una camera a Neubauer standard.</li>
		<li>Come descritto in 1.1.11 del seme le cellule a 109 celle/175 cm2 T-boccetta in 25 mL di terreno. In alternativa, è possibile dividere la sospensione di cellule intere in matracci di cultura di cellule di2 cm 175 fino a dieci senza contare. In questa fase, non sono distinguibili dagli eritrociti, che li superano notevolmente hBMSCs. hBMSCs apparirà come colonie sparse (1-2/boccetta) nel corso dei primi 7 giorni.</li>
		<li>Sostituire il terreno dopo 4 giorni dalla semina per consentire l'interazione delle cellule del sangue con il hBMSCs. Dopo il primo scambio medio, cambiare il mezzo ogni 2-3 giorni. Eseguire il cambio medio di rimuovere completamente il terreno di coltura con una pipetta di plastica graduato, lavare due volte con DPBS (da aggiungere 10 mL di DPBS per le celle aderenti e rimuovere completamente DPBS con una pipetta di plastica graduata) e quindi aggiungere 20 mL di terreno di nuovo, come descritto in 1.1.11.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cellule endoteliali microvascolari cutanee umane (HDMECs)<ol>
<li>Trattare le biopsie della pelle e isolare il HDMECs secondo protocolli precedentemente pubblicati21. Brevemente, dopo la separazione del derma dall'epidermide, incubare il derma in tripsina per 40 min a 37 ° C e 5% CO2. Dopo il tempo di incubazione, trasferire il derma una piastra Petri contenente terreno di coltura e graffiare ogni pezzo con l'uso di un bisturi. Trasferire la sospensione cellulare ottenuta a un tubo di plastica da 50 mL e centrifugare per 5 minuti a 300 x g e 22 ° C. Contare la sospensione cellulare utilizzando una camera di Neubauer e seme ad una densità di 1.2 x 104 cellule/cm2. Modificare il mezzo completamente ogni altro giorno.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. set-up e la sterilizzazione di boccette di spinner, RCP microcarriers e bioreattore
<ol><li>Boccette di Spinner e RCP microcarriers<ol>
<li>Un giorno prima degli esperimenti, set-up lo spinner boccette e prepararli per la sterilizzazione in autoclave. Nota: Lasciare i tappi delle beute spinner sciolto e, quando possibile, sterilizzarli in posizione verticale.<ol>
<li>Avvolgere le beute spinner con foglio di alluminio attorno i tappi laterali separatamente al fine di evitare la contaminazione durante la rimozione del wrapping. Avvolgere le beute con 1-2 strati di carta stagnola per sterilizzazione in autoclave al fine di minimizzare i rischi di contaminazione dopo la sterilizzazione.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Pesare la quantità necessaria di RCP macroporosa microcarriers in 20 mL di DPBS. Nota: 30 mg è necessaria per fiaschetta spinner. Far loro tenere a bagno per almeno 1 h prima di sterilizzazione in autoclave (121 ° C per 15 min).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bioreattore a perfusione<ol>
<li>Utilizza il sistema di bioreattore descritto per produrre tessuto vascolarizzato equivalenti20. Questo bioreattore è costituito da un recipiente, in cui è collocato il biomatrice, un serbatoio medio e una bottiglia di pressione.<ol>
<li>Collegare il vaso con il serbatoio medio e la bottiglia di pressione attraverso tubicini di silicone (Vedi Figura 3). Lasciare i tappi sciolto e metterlo in un sacchetto di plastica di autoclave, chiudere bene e questo posto in un sacchetto di plastica autoclave secondo. Sterilizzare in autoclave.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. la cultura di hBMSCs e HDMECs su microcarriers macroporosa RCP
Nota: I HDMECs utilizzati per inizializzare il microcarriers RCP sono stati etichettati con RFP attraverso la trasduzione lentivirale. Questo protocollo è stato modificato dopo un protocollo precedentemente pubblicato5.
<ol><li>Lasciate che la RCP macroporosa microcarriers depositano alla parte inferiore e lavare con 10 mL di terreno di coltura. Ripetere 3 volte.</li>
	<li>Lavare boccette di spinner con 10 mL di terreno di coltura.</li>
	<li>Aggiungere 30 mg di RCP macroporosa microcarriers per fiaschetta spinner in 8 mL di terreno di coltura. Equilibrare le beute spinner contenente la RCP microcarriers a 37 ° C e 5% di CO2 per 30 min, prima della semina delle cellule. Nota: Questo si basa sul peso secco approssimativo di RCP microcarriers prima della sterilizzazione.</li>
	<li>Per fiaschetta spinner in 2 mL di terreno di coltura del seme 5x105 hBMSCs o HDMECs (passaggio 3).</li>
	<li>Posizionare le beute spinner sulla piastra di agitatore e inizio mescolando a 90 rpm per 5 min e resto per 55 min a 37 ° C e 5% CO2, per un totale di 1 h di incubazione statico/dinamico. Ripetere 4 volte.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di terreno di coltura cellulare per fiaschetta spinner e quindi avviare continua agitazione a 95 giri/min. Incubare a 37 ° C e 5% CO2.</li>
	<li>Con l'uso di una micropipetta prelevare campioni a giorni 1, 4 e 7:333 µ l di DNA contenuto (~ 0,5 mg), 1000 µ l per analisi SEM (~ 1,5 mg) e 333 µ l per la macchiatura live/dead (~ 0,5 mg). Nota: Questo si basa sul peso secco approssimativo di RCP microcarriers prima della sterilizzazione.</li>
	<li>Cambiare 10 mL di terreno di coltura ogni altro giorno. Per questo, attendere che la RCP microcarriers depositano alla parte inferiore e molto attentamente aspirare 10 mL dalla beuta spinner, con l'uso di una pipetta da 10 mL e quindi aggiungere 10 mL di terreno di coltura fresco.</li>
	<li>Mantenere le culture sulla piastra agitatore a 95 rpm, a 37 ° C e 5% di CO2 per 7 giorni.</li>
</ol>4. contenuto di DNA, analisi SEM, vivere morto macchiatura e dosaggio di germogliatura
<ol><li>Contenuto di DNA<ol>
<li>Con l'uso di una micropipetta, raccogliere circa 0,5 mg di microcarriers da ogni boccetta di spinner (contenuta nel 333 µ l di sospensione) e il trasferimento a un tubo di plastica di 2 ml. Nota: Questo si basa sul peso secco approssimativo di RCP microcarriers prima della sterilizzazione.</li>
		<li>Lavare una volta con 1 mL di DPBS, quindi aspirare il surnatante.</li>
		<li>Togliere il restante DPBS in un liofilizzatori e peso il liofilizzato microcarriers per normalizzazione successiva.</li>
		<li>Congelare i campioni a-80 ° C per almeno 6 ore.</li>
		<li>Incubare i campioni a 60 ° C durante la notte con papaina di 300 µ l 5 U/mL.</li>
		<li>Stabilire le curve di titolazione appropriata seguendo le istruzioni del produttore del dosaggio quantificazione (ad es., analisi di dsDNA PicoGreen) kit ed eseguire la misurazione del segnale fluorescente a 520 nm con un rilevatore di luminescenza.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analisi di microscopia elettronica (SEM) a scansione<ol>
<li>Raccogliere ca. 1 mg di microcarriers da ciascuna beuta spinner e trasferire a un tubo di plastica di 2 mL.</li>
		<li>Lavare microcarriers una volta con 1 mL di DPBS.</li>
		<li>Rimuovere DPBS e incubare in 1 mL di etanolo al 70% per 1 h.</li>
		<li>Rimuovere il surnatante e incubare in 1 mL di etanolo di 80% per 1 h.</li>
		<li>Rimuovere il surnatante e incubare in 1 mL di etanolo al 90% per 1 h.</li>
		<li>Rimuovere il surnatante e incubare in 1 mL di etanolo al 100% per 1 h.</li>
		<li>Rimuovere il surnatante e incubare in 1 mL di esametildisilazano per 10 min.</li>
		<li>Aprire il tappo e lasciare che il pernottamento asciutto campioni sotto una cappa chimica.</li>
		<li>Difficoltà campioni su adeguato supporto e procedere all'analisi SEM secondo i protocolli stabiliti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DAPI e Live/Dead macchiatura<ol>
<li>Al giorno 2, 4 e 7 dopo semina sul microcarriers cellulare raccogliere 0,5 mg di microcarriers da ciascuna beuta spinner e trasferire a un tubo di plastica di 2 mL. Lavare una volta con 1 mL di DPBS.</li>
		<li>DAPI<ol>
<li>Difficoltà campioni per 10 min in abbastanza paraformaldeide al 4% per la loro copertura.</li>
			<li>Lavare una volta con 1 mL di DPBS.</li>
			<li>Incubare a temperatura ambiente con la soluzione colorante per 45 minuti su un agitatore a dondolo.</li>
			<li>Rilevare il segnale fluorescente DAPI il microscopio a fluorescenza con un filtro di emissione 420 nm e acquisire immagini.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Live/Dead macchiatura<ol>
<li>Incubare i campioni in 500 µ l di soluzione colorante Live/Dead. Conservare i campioni a 37 ° C per 20 min, al riparo dalla luce.</li>
			<li>Lavare una volta con 1 mL di DPBS.</li>
			<li>Rilevare il segnale di fluorescenza delle cellule viventi con un filtro di emissione 490 nm e di cellule morte con un filtro di emissione 545 nm su un microscopio a fluorescenza. Acquisire immagini.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Test di germinazione per HDMECs<ol>
<li>Mix 330 µ l di soluzione di collagene R 0.4%, 170 µ l di acido acetico 0.1% e 50 µ l di medium M199 in un tubo di plastica da 15 mL. Tenere il ghiaccio.</li>
			<li>Prendere ~0.375 mg di microcarriers (250 µ l) con l'uso di una micropipetta. Trasferire in una provetta di plastica da 1,5 mL, attendere per la RCP microcarriers depositano alla parte inferiore e rimuovere completamente il mezzo. Nota: Questo si basa sul peso secco approssimativo di RCP microcarriers prima della sterilizzazione.</li>
			<li>Aggiungere il volume di NaOH 0,2 N necessario per neutralizzare la miscela di collagene e miscelare immediatamente con la RCP microcarriers. Nota: Determinare la quantità necessaria di NaOH 0,2 N in anticipo aggiungendo alla miscela fino al cambiamento del pH (girare dal colore giallo al rosa) e poi mettendo la miscela nell'incubatrice per 1 min, dopo di che deve essere formato un gel.</li>
			<li>La miscela di microcarriers collagene gel-RCP in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti della piastra. Incubare a 37 ° C e 5% CO2 per 30 min.</li>
			<li>Aggiungere 200 µ l del fattore di crescita endoteliale vascolare (ad es., terreno di coltura VascuLife VEGF-Mv). Incubare a 37 ° C e 5% CO2 per 24 h.</li>
			<li>Osservare sotto un microscopio di contrasto di fase inverso, utilizzando un oggetto di ingrandimento, di 10x e acquisire immagini.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. biomatrice seeding e inizio del bioreattore sistema per HDMECs
<ol><li>Un giorno prima di iniziare le culture di bioreattore, tagliare aperto BioVaSc (il biomatrice) longitudinalmente sul lato antimesenteric e risolvere il problema in una cornice in policarbonato precedentemente disinfettato (Vedi Figura 3A, B). Nota: Il BioVaSc è una biomatrice ottenuti da un segmento di decellularizzazione digiunale porcina, preparato come precedentemente pubblicato21. Nota: come il telaio in policarbonato non può essere sterilizzato con il calore, disinfettarlo di incubazione di 20 min in bagno ad ultrasuoni (40KHz) seguita da incubazione 3 volte in etanolo al 70% per 25 min. Poi, lavare il telaio 3 volte con DPBS sterile.<ol>
<li>Posizionare il sistema biomatrice-frame in un 100mm di Petri e riempirlo con il fattore di crescita endoteliale vascolare + 1% penicillina streptomicina (Pen/Strep).</li>
		<li>Equilibrare il biomatrice incubando una notte a 37 ° C e 5% CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo lo scollegamento e il conteggio delle cellule, iniettare 10 x 107 HDMECs a 1000 µ l di terreno di coltura attraverso il sistema vascolare conservato della stessa, con l'uso di una siringa da 2 mL. Nota: Iniettare ~ 700 µ l attraverso l'ingresso arterioso e ~ 300 µ l attraverso lo sbocco della vena.</li>
	<li>Incubare a 37 ° C e 5% CO2 per 3 h, per consentire il collegamento delle cellule.</li>
	<li>Riempire l'impianto di bioreattore con 350 mL del fattore di crescita endoteliale vascolare + 1% Pen/Strep e incubare a 37 ° C e 5% CO2.</li>
	<li>Posizionare il telaio all'interno del recipiente del bioreattore. Collegare i pedicles arteriosi e venosi alla nave.</li>
	<li>Avviare l'aspersione collegando il sistema di bioreattore per una pompa peristaltica. Impostare la pressione a 10 ± 1 mmHg e ampiezza.</li>
	<li>Aumentare la pressione graduale ogni ora fino a raggiungere 100 mmHg di pressione, ampiezza ± 20.</li>
	<li>Mantenere il sistema di bioreattore per 7 giorni in queste Condizioni a 37 ° C e 5% CO2.</li>
</ol>6. aggiunta di RFP-HDMECs per il biomatrice
<ol><li>Mix 330 µ l di soluzione di collagene R 0,4%, 170 µ l di acido acetico 0.1% e 50 µ l di medium M199 in un tubo Falcon da 15 mL. Tenere il ghiaccio.</li>
	<li>Prendere la RCP microcarriers dai palloni spinner. Rimuovere completamente il terreno di coltura.</li>
	<li>Aggiungere il volume di NaOH 0,2 N necessario per neutralizzare la miscela di collagene e miscelare immediatamente con la RCP microcarriers.</li>
	<li>Aggiungere la miscela di collagene gel-RCP microcarriers sul lume del biomatrice. Consentire la gelificazione per 30 min.</li>
	<li>In parallelo, cambiare il mezzo del bioreattore rimuovendo completamente il mezzo e quindi aggiungere 350 mL di fresco, pre riscaldato, fattore di crescita endoteliale vascolare + 1% Pen/Strep.</li>
	<li>Collegare il bioreattore per la pompa peristaltica e impostare la pressione a 100 ± 20 mm Hg e ampiezza.</li>
	<li>Modificare il mezzo ogni 7 giorni.</li>
	<li>Tenere il bioreattore in cultura per 21 giorni.</li>
</ol>7. analisi e letture delle culture di bioreattore
<ol><li>Preparazione dei campioni<ol>
<li>Staccare il biomatrice bioreattore e rimuoverlo dal telaio in policarbonato.</li>
		<li>Tagliare il pezzo ottenuto in 6 sezioni: 2 MTT, 2 per paraffina incorporamento di colorazione e 2 per analisi SEM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inclusione in paraffina<ol>
<li>Inserire le sezioni in una capsula di Petri e lavare con abbastanza DPBS per la loro copertura. Scartare il DPBS.</li>
		<li>Difficoltà durante la notte le sezioni in paraformaldeide al 4%.</li>
		<li>Preparare le cassette per inclusione in paraffina ed eseguire secondo protocolli standard.</li>
		<li>Preparare le sezioni in blocchi di paraffina e tagliare campioni di 3 µm per la macchiatura di H & E, con l'uso di un microtomo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>H & E colorazione<ol>
<li>Macchia reidratati sezioni secondo protocolli standard32.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analisi di microscopia elettronica (SEM) a scansione<ol>
<li>Inserire le sezioni in una capsula di Petri e lavare con abbastanza DPBS per la loro copertura. Scartare il DPBS.</li>
		<li>Fissare le sezioni con glutaraldeide al 4,75% durante la notte.</li>
		<li>Eseguire catena di disidratazione con aumento delle concentrazioni di etanolo 50% - 100%.</li>
		<li>Coprire le sezioni con esametildisilazano (HMDS) per 10 min. scartare il HMDS usate e aggiungere HMDS fresco.</li>
		<li>Consentire le sezioni per asciugare durante la notte sotto cappa e quindi preparare i campioni per l'imaging.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromuro (MTT)<ol>
<li>Agitare il reagente di MTT con fattore di crescita endoteliale vascolare, in una concentrazione di 1 mg/mL.</li>
		<li>Incubare le sezioni nella soluzione MTT per 90 min a 37 ° C e 5% CO2.</li>
		<li>Osservare le strutture vascolari delle cellule seminate microcarriers macroscopicamente o sotto un microscopio a campo chiaro, per rilevare cellule metabolicamente attive. Acquisire immagini.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2214031X15000182">Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering.</a> Journal of Orthopaedic. 3 (2), Translation 51-57 (2015).</li>
<li>Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+solid+and+porous+microcarriers+for+cell+growth+and+production+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of solid and porous microcarriers for cell growth and production of recombinant proteins.</a> Methods Mol Biol. 1104, 137-147 (2014).</li>
<li>Akhmanova, M., Osidak, E., Domogatsky, S., Rodin, S., Domogatskaya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical%2C+Spatial%2C+and+Molecular+Aspects+of+Extracellular+Matrix+of+In+Vivo+Niches+and+Artificial+Scaffolds+Relevant+to+Stem+Cells+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Physical, Spatial, and Molecular Aspects of Extracellular Matrix of In Vivo Niches and Artificial Scaffolds Relevant to Stem Cells Research.</a> Stem Cells Int. 2015, 167025(2015).</li>
<li>Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+aggregates+of+mesenchymal+stem+cells%3A+cellular+mechanisms%2C+biological+properties%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B.+Rev%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications.</a> Tissue Eng Part B. Rev. 20, 365-380 (2014).</li>
<li>Fitzgerald, K. A., Malhotra, M., Curtin, C. M., Brien, F. J. O., O'Driscoll, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+in+3D+is+never+flat%3A+3D+models+to+optimise+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Life in 3D is never flat: 3D models to optimise drug delivery.</a> Journal of Controlled Release. 215, 39-54 (2015).</li>
<li>Tan, K. Y., Reuveny, S., Oh, S. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+serum-free+microcarrier+expansion+of+mesenchymal+stromal+cells%3A+Parameters+to+be+optimized%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Recent advances in serum-free microcarrier expansion of mesenchymal stromal cells: Parameters to be optimized.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 473, 769-773 (2016).</li>
<li>de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., da Silva, C. L., Cabral, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+microcarrier-based+manufacturing+of+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells.</a> J Biotechnol. 236, 88-109 (2016).</li>
<li>Schop, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+human+mesenchymal+stromal+cells+on+microcarriers%3A+growth+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Expansion of human mesenchymal stromal cells on microcarriers: growth and metabolism.</a> J Tissue Eng Regen. Med. 4, 131-140 (2010).</li>
<li>Carmelo, J. G., Fernandes-Platzgummer, A., Diogo, M. M., da Silva, C. L., Cabral, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+xeno-free+microcarrier-based+stirred+culture+system+for+the+scalable+expansion+of+human+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells+isolated+from+bone+marrow+and+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">A xeno-free microcarrier-based stirred culture system for the scalable expansion of human mesenchymal stem/stromal cells isolated from bone marrow and adipose tissue.</a> Biotechnol J. 10, 1235-1247 (2015).</li>
<li>Malda, J., Frondoza, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcarriers+in+the+engineering+of+cartilage+and+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Microcarriers in the engineering of cartilage and bone.</a> Trends Biotechnol. 24, 299-304 (2006).</li>
<li>Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+human+mesenchymal+and+pluripotent+stem+cell+microcarrier+cultures+in+cellular+therapy%3A+achievements+and+future+direction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction.</a> Biotechnol Adv. 31, 1032-1046 (2013).</li>
<li>Confalonieri, D., La Marca, M., van Dongen, E., Walles, H., Ehlicke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Injectable+Recombinant+Collagen+I+Peptide-Based+Macroporous+Microcarrier+Allows+Superior+Expansion+of+C2C12+and+Human+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stromal+Cells+and+Supports+Deposition+of+Mineralized+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">An Injectable Recombinant Collagen I Peptide-Based Macroporous Microcarrier Allows Superior Expansion of C2C12 and Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells and Supports Deposition of Mineralized Matrix.</a> Tissue Eng Part A. , (2017).</li>
<li>Davidenko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+crosslinking+for+tailoring+collagen-based+scaffolds+stability+and+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Control of crosslinking for tailoring collagen-based scaffolds stability and mechanics.</a> Acta biomaterialia. 25, 131-142 (2015).</li>
<li>Jin, G. Z., Park, J. H., Seo, S. J., Kim, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+cell+culture+on+porous+biopolymer+microcarriers+in+a+spinner+flask+for+bone+tissue+engineering%3A+a+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Lett%22%5BJournal%5D)">Dynamic cell culture on porous biopolymer microcarriers in a spinner flask for bone tissue engineering: a feasibility study.</a> Biotechnol Lett. 36, 1539-1548 (2014).</li>
<li>Bae, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23152325">Building Vascular Networks.</a> Science Translational Medicine. 4 (160), 160ps23(2012).</li>
<li>Cao, L., Wang, J., Hou, J., Xing, W., Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+and+bone+regeneration+in+a+critical+sized+defect+using+2-N%2C+6-O-sulfated+chitosan+nanoparticles+incorporating+BMP-2%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Vascularization and bone regeneration in a critical sized defect using 2-N, 6-O-sulfated chitosan nanoparticles incorporating BMP-2.</a> Biomaterials. 35 (2), 684-698 (2014).</li>
<li>Novosel, E., Kleinhans, C., Kluger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+is+the+key+challenge+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Vascularization is the key challenge in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).</li>
<li>Cartmell, S. H., Porter, B. D., García, A. J., Guldberg, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+medium+perfusion+on+cell-seeded+three-dimensional+bone+constructs+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Effects of medium perfusion on cell-seeded three-dimensional bone constructs in vitro.</a> Tissue Engineering. 9 (6), 1197-1203 (2004).</li>
<li>Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularised+human+tissue+models%3A+a+new+approach+for+the+refinement+of+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research.</a> Journal of biotechnology. 148 (1), 56-63 (2010).</li>
<li>Steinke, M., Gross, R., Walles, H., Schütze, K., Walles, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineered+3D+human+airway+mucosa+model+based+on+a+SIS+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An engineered 3D human airway mucosa model based on a SIS scaffold.</a> Biomaterials. 35 (26), 7355-7362 (2014).</li>
<li>Moll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Engineering+of+a+Human+3D+in+vitro+Tumor+Test+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System.</a> J. Vis. Exp. (78), e50460(2013).</li>
<li>Groeber, F., Kahlig, A., Loff, S., Walles, H., Hansmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioreactor+system+for+interfacial+culture+and+physiological+perfusion+of+vascularized+tissue+equivalents%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">A bioreactor system for interfacial culture and physiological perfusion of vascularized tissue equivalents.</a> Biotechnology Journal. 8, 308-316 (2013).</li>
<li>Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26848/">Blood vessels and endothelial cells.</a> Molecular Biology of the Cells. , New York. (2002).</li>
<li>Logsdon, E. A., Finley, S. D., Popel, A. S., Gabhann, F. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24237862">A systems biology view of blood vessel growth and remodeling.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (8), 1491-1508 (2014).</li>
<li>Scheller, K., Dally, I., Hartmann, N., Münst, B., Braspenning, J., Walles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upcyte%C2%AE+Microvascular+endothelial+cells+repopulate+decellularized+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Upcyte® Microvascular endothelial cells repopulate decellularized scaffold.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (1), 57-67 (2012).</li>
<li>Nietzer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+Metastases+Including+Tumor+Stroma%3A+A+New+Technique+to+Generate+a+Three-Dimensional+Colorectal+Cancer+Model+Based+on+a+Biological+Decellularized+Intestinal+Scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Mimicking Metastases Including Tumor Stroma: A New Technique to Generate a Three-Dimensional Colorectal Cancer Model Based on a Biological Decellularized Intestinal Scaffold.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (7), 621-635 (2016).</li>
<li>Göttlich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Combined+3D+Tissue+Engineered+In+Vitro%2FIn+Silico+Lung+Tumor+Model+for+Predicting+Drug+Effectiveness+in+Specific+Mutational+Backgrounds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds.</a> J. Vis. Exp. (110), e53885(2016).</li>
<li>Stratmann, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+human+3D+lung+cancer+model+based+on+a+biological+tissue+matrix+combined+with+a+Boolean+in+silico+model%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+oncology%22%5BJournal%5D)">Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model.</a> Molecular oncology. 8 (2), 351-365 (2014).</li>
<li>Groeber, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+first+vascularized+skin+equivalent+for+as+an+alternative+to+animal+experimentation%5BTitle%5D)+AND+%22Altex%22%5BJournal%5D)">A first vascularized skin equivalent for as an alternative to animal experimentation.</a> Altex. 33 (4), 415-422 (2016).</li>
<li>Plunkett, N., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreactors+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Technology+and+Health+Care%22%5BJournal%5D)">Bioreactors in tissue engineering.</a> Technology and Health Care. 19 (1), 55-69 (2011).</li>
<li>Nienow, A. W., Rafiq, Q. A., Coopman, K., Hewitt, C. J. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X14000278">A potentially scalable method for the harvesting of hMSCs from microcarriers.</a> Biochemical Engineering Journal. 85, 79-88 (2014).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), pdb-prot4986(2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Uno degli obiettivi principale di microcarrier è l'espansione di cellule pur mantenendo la loro differenziazione al fine di fornire le cellule al posto del bisogno. Il metodo rappresentato introdurre RCP microcarriers dove le cellule erano in grado di allegare, proliferare e colonizzare il microcarriers con densità elevata delle cellule. Ciò è stata osservata da live/dead colorazione, in cui oltre il 90% delle cellule vitali sono stati rilevati mentre solo poche cellule morte sono state ottenute dopo 7 giorni di culture ...

Un problema generale in applicazioni di ingegneria del tessuto è di produrre una massa elevata delle cellule con il fenotipo di differenziazione corretta nella posizione di bisogno. L'applicazione di microcarriers per affrontare questo problema iniziato nel 1967 con sempre maggiore importanza fino ad oggi nei campi come ingegneria tissutale ortopedici per generazione su larga scala di pelle, ossa, cartilagine e tendini1. Essi consentono la movimentazione di culture aderente in modo simile a quello di sospensione culture2 espandendo cellule su substrati di Microscala tridimensionale (3D). Quindi le cellule esperienza un apporto nutritivo omogeneo e interazioni cellula-matrice che piombo per migliore manutenzione di in vivodifferenziazione4 3,, che è spesso persa nel tempo in 2D si avvicina a5. Un più alto rapporto superficie-volume - finalmente che conduce alla cella superiore rendimenti6,7, superiore di gas e nutrienti tassi di cambio rispetto a sistemi statici8, la possibilità di regolare e salvi la cultura fisica stimoli9e il potenziale per la scalabilità del processo espansione7 sono ulteriori vantaggi. Diverse funzionalità come diametro, densità, porosità, carica superficiale e adesione proprietà10,11 distinguere il commercialmente disponibili micro - e macro-elementi portanti differenti. Tuttavia, uno del vantaggio principale è la loro consegna potenziale come microtissues sito difetto o domanda.
Per le applicazioni della tecnologia microcarrier in ingegneria del tessuto osseo, abbiamo illustrato in un precedente rapporto12 la produzione di un nuovo microcarrier tipo costituita di un collagene ricombinante I peptidi (RCP, disponibile nel commercio come Cellnest). Questo nuovo microcarrier permette il secondo GMP le proporzioni di impalcatura e cella di produzione, come necessario per la consegna delle cellule in uno scenario clinico. In questo contesto, ottimizzazione della stabilità dell'impalcatura, tasso di degradazione e proprietà di superficie attraverso la corretta scelta di una strategia di reticolazione adatta permette di adattare la tecnica per l'applicazione selezionata, cell tipo di interesse o tessuto13di destinazione. In particolare, l'occupazione potenziale di questa microcarrier come un sistema di consegna delle cellule iniettabili per applicazione terapeutica14 li rende particolarmente interessanti in una regolazione clinica.
In questa carta, abbiamo quindi illustrare la procedura di coltura per l'isolamento e l'espansione delle derivate da midollo osseo cellule mesenchimali umane stromali (hBMSCs) e cellule endoteliali microvascolari cutanee umane (HDMECs) il collagene-io-base ricombinante microcarriers peptidici e la loro preparazione per la consegna in una regolazione clinica. Inoltre, descriviamo protocolli aggiuntivi utili per il mantenimento della vitalità cellulare al momento dell'impianto.
La vitalità cellulare dopo l'impianto è infatti fortemente dipendente vascolarizzazione15,16,17, che assicura uno scambio di ossigeno e nutrienti e facilita la rimozione dei rifiuti. Bioreattori costituiscono un approccio per superare le sfide di vascolarizzazione in ingegneria tissutale e mantenere la vitalità cellulare, tramite aspersione del terreno di coltura fornendo quindi ossigeno e sostanze nutritive18. Qui, vi illustriamo un metodo in vitro per valutare la capacità di migrazione delle cellule endoteliali microvascolari da microcarriers la RCP per una biomatrice e la loro capacità di contribuire alla vascolarizzazione de novo e l'angiogenesi. Questo biomatrice è un segmento decellularizzato del digiuno porcina definito BioVaSc (Scaffold biologici vascolarizzato), ricca di collagene ed elastina e con conservato le strutture vascolari, che comprende un'arteria d'alimentazione e una vena drenante19 che è stato applicato per l'impianto problemi20.

<table><tbody><tr><td>3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT)</td><td>Serva Electrophoresis GmbH</td><td>20395.01</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-fenilidridicloridrato (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico 100%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>533,001</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia analitica Kern EG 2200-2NM</td><td>Kern & Sohn GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ascorbato-2-fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Bioreattore</td><td>Cattedra di ingegneria tissutale e medicina rigenerativa, Wuerzburg, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a campo chiaro Axiovert 40C</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellnest</td><td>Fujifilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provette per centrifuga (15 mL, 50 mL)</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di collagene R 0,4%</td><td>Serva Electrophoresis GmbH</td><td>47254.01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Modificato, senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio</td></tr><tr><td>Eosina 1%</td><td>Morphisto</td><td>10177.01000</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo 96%</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>T171.4</td> Siero fetale di vitello <td>denaturato</td></tr><tr><td>(FCS)</td><td>Bio& VEDI FCS</td><td>. ADD.0500</td> microscopio a fluorescenza <td>non inattivato a caldo</td></tr><tr><td>BZ-9000</td><td>Keyence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ematossilina</td><td>Morfito</td><td>10231.01000</td><td></td></tr><tr><td>Esametildisilazano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440191</td><td>grado di reagente, &ge; 99%</td></tr><tr><td>Incubatore per bioreattore</td><td>Cattedra di Ingegneria Tissutale e Medicina Rigenerativa, Wuerzburg, Germania</td><td></td><td></td></tr> Kit <tr><td>di Doppia Colorazione a Cellule Vive/Morte</td><td>Fluka</td><td>04511KT-F</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di agitazione magnetica</td><td>2Mag</td><td>80002</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0650</td><td>Lettore di micropiastre 10X</td></tr><tr><td> Tecan Infinite M200</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ago 21G 16mm</td><td>VWR</td><td>613-5389</td><td></td></tr><tr><td>Papaina da lattice di papaya</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4762</td><td>polvere liofilizzata, &ge; 10 unità/mg di proteina</td></tr><tr><td>Paraffina</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6642.6</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Pompa peristaltica</td><td>Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quanti-iT PicoGreen dsKit per il dosaggio del DNA</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>Histofix 4%</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P087</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a scansione Supra 25</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di idrossido di sodio 1,0 N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td></td></tr><tr><td>Firacci per spinner (25 mL)</td><td>Siringa Wheaton</td><td>356879</td><td></td></tr><tr><td>1 mL</td><td>VWR</td><td>720-2561</td><td></td></tr><tr><td>Fiasche per colture tissutali (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2)</td><td>TPP Techno Plastik Products AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue 0,4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>VascuLife VEGF-Mv</td><td>Lifeline cell technology</td><td>LL-0005</td><td></td></tr></tbody></table>

ricombinante collagene peptide microcarriers per l'espansione delle cellule e loro potenziale utilizzo come sistema di consegna di cella in un bioreattore modello

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Ingegneria tissutale è un settore promettente, focalizzato sullo sviluppo di soluzioni per la crescente domanda su tessuti e organi in relazione alle finalità di trapianto. Il processo per generare tali tessuti è complesso e comprende un'appropriata combinazione di tipi cellulari specifici, impalcature e stimoli fisici o biochimici per guidare la crescita delle cellule e differenziazione. Microcarriers rappresentano uno strumento attraente per espandere le cellule in un microambiente tridimensionale (3D), poiché forniscono maggiore superficie--rapporti di volume e imitare più da vicino la situazione in vivo rispetto ai metodi tradizionali bidimensionali. Il sistema vascolare, approvvigionamento di ossigeno e sostanze nutritive alle cellule e per garantire la rimozione dei rifiuti, costituisce un elemento importante quando generazione progettato tessuti. Infatti, maggior parte dei costrutti non riuscire dopo essere impiantati a causa della mancanza di supporto vascolare. In questo studio, presentiamo un protocollo per l'espansione delle cellule endoteliali su microcarriers basati su collagene ricombinante in condizioni dinamiche in boccetta spinner e bioreattori e spieghiamo come determinare in questa vitalità cellulare impostazione e funzionalità. Inoltre, proponiamo un metodo per la consegna delle cellule per scopi di vascolarizzazione senza passaggi aggiuntivi distacco necessari. Inoltre, mettiamo a disposizione una strategia per valutare la vascolarizzazione delle cellule potenziale in un bioreattore di aspersione su una matrice biologica decellularizzato. Noi crediamo che l'uso dei metodi presentati potrebbe portare allo sviluppo di nuove terapie basate sulle cellule per una vasta gamma di applicazioni nella pratica clinica di ingegneria tissutale.

Come mostrato in Figura 1A, abbiamo ottenuto elevato numero di cellule vitali su microcarriers la RCP dopo 7 giorni di cultura, determinato dalla macchiatura live/dead. Tali risultati sono stati confermati da analisi di SEM, in cui sono stati osservati microcarriers completamente colonizzata intorno i pori, parzialmente surclassando li (Figura 1B). D'altra parte, gli esperimenti in cui le cellule non sono state seminate in modo u...

Vi proponiamo un protocollo di espansione delle cellule su microcarriers macroporosa e loro uso come sistema di consegna in un bioreattore di perfusione per inizializzare una matrice di tessuto decellularizzati. Abbiamo anche diverse tecniche per determinare la proliferazione delle cellule e l'attuabilità delle cellule coltivate su microcarriers. Inoltre, dimostriamo la funzionalità delle cellule dopo le culture di bioreattore.

Ricombinante collagene Peptide Microcarriers per l'espansione delle cellule e loro potenziale utilizzo come sistema di consegna di cella in un bioreattore modello

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di espandere le cellule su un'elevata superficie disponibile e di fornire ulteriormente queste cellule ai siti di difetto o di domanda per applicazioni cliniche. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ingegneria tissutale, come l'espansione cellulare, la consegna cellulare e la vascolarizzazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo espandere le cellule e consegnarle, senza alcuna fase di raccolta, nei siti difettosi, in modo biocompatibile.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché il funzionamento di microcarrier e bioreattori può essere complicato, all'inizio, a causa dei numerosi passaggi coinvolti. Ad aiutare con la procedura sarà Jihyoung Choi, uno studente di dottorato del nostro laboratorio. Un giorno prima degli esperimenti, sistemare i palloni e prepararli per la sterilizzazione in autoclave.Avvolgere separatamente le borracce con un foglio di alluminio attorno ai tappi laterali per evitare contaminazioni durante l'apertura. Avvolgere i palloni con uno o due strati di foglio di alluminio per la sterilizzazione in autoclave per ridurre al minimo i rischi di contaminazione dopo la sterilizzazione. Lasciare i tappi dei palloni rotanti allentati e, quando possibile, sterilizzarli in posizione verticale.Successivamente, pesare la quantità richiesta di microvettori macroporosi RCP in 20 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco. Lasciarli idratare per almeno un'ora prima della sterilizzazione a caldo in autoclave. Utilizzare il sistema di bioreattore a cui si fa riferimento nel protocollo di testo per produrre equivalenti tissutali vascolarizzati.Questo bioreattore è costituito da un recipiente in cui è posizionata la biomatrice, un serbatoio medio e una bottiglia a pressione. Collegare il recipiente con il serbatoio del fluido e la bombola a pressione attraverso tubi in silicone. Lasciare i tappi allentati e riporre il sistema in un sacchetto di plastica per autoclave.Chiudere bene il sacchetto e metterlo in un secondo sacchetto di plastica per autoclave prima di sterilizzarlo in autoclave. Lasciare che i microvettori macroporosi RCP sterilizzati si depositino sul fondo e lavarli con 10 millilitri di terreno di coltura. Ripeti questo processo tre volte.Lavare anche i palloni con 10 millilitri di terreno di coltura. Quindi, aggiungere 30 milligrammi di microvettori macroporosi RCP per pallone in otto millilitri di terreno di coltura. Equilibrare i microvettori macroporosi RCP a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 30 minuti prima di seminare le cellule.Quindi, seminare mezzo milione di cellule stromali mesenchimali derivate dal midollo osseo umano o cellule endoteliali microvascolari dermiche umane per pallone di filatura in due millilitri di terreno di coltura. Posizionare i palloni su una piastra di agitazione a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica e iniziare a mescolare a 90 giri/min per cinque minuti. Quindi, riposare per 55 minuti per un totale di un'ora di incubazione dinamica statica.Ripeti questo ciclo di incubazione quattro volte. Ora, aggiungere 10 millilitri di terreno di coltura cellulare per pallone da centrifuga. Quindi iniziare a mescolare continuamente a 95 giri/min durante l'incubazione a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Un giorno prima di iniziare le colture del bioreattore, aprire longitudinalmente la biomatrice sul lato anetimesenterico e fissarla in un telaio di policarbonato precedentemente disinfettato. Dopo aver staccato e contato le cellule, utilizzare una siringa da due millilitri per iniettare 10 milioni di HDMEC in mille microlitri di terreno di coltura attraverso la vascolarizzazione conservata della biomatrice. Iniettare circa 700 microlitri attraverso l'ingresso arterioso e circa 300 microlitri attraverso l'uscita venosa.Incubare la biomatrice con cellule iniettate a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per tre ore per consentire l'adesione delle cellule. Dopo l'incubazione, il collegamento della biomatrice al bioreattore deve essere effettuato da due individui, avendo cura che i peduncoli arterioso e venoso siano collegati correttamente al flusso del mezzo. Riempire il sistema del bioreattore con 350 millilitri di fattore di crescita dell'endotelio vascolare, 1% di penicillina streptomicina e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Posizionare il telaio all'interno del recipiente del bioreattore. Quindi, collegare con cura i peduncoli arteriosi e venosi al vaso. Avviare la perfusione collegando il sistema del bioreattore a una pompa peristaltica.Impostare la pressione a 10 millimetri di ampiezza del mercurio più meno uno. Aumentare la pressione gradualmente ogni ora fino a raggiungere una pressione di 100 millimetri di ampiezza di mercurio più meno 20. Mescolare 330 microlitri di soluzione di collagene R allo 0,4%, 170 microlitri di acido acetico allo 0,1% e 50 microlitri di M199 medio in un tubo Falcon da 15 millilitri.Tenete il composto in ghiaccio. Quindi, prelevare i microcarrier RCP dai palloni della centrifuga. Rimuovere completamente il terreno di coltura.Quindi, aggiungi il volume di idrossido di sodio necessario per neutralizzare la miscela di collagene. Una volta neutralizzata, miscelare immediatamente la miscela con i microcarrier RCP. È importante consentire la gelificazione del gel di collagene prima di iniziare il flusso medio.In caso contrario, il gel si staccherà e i microvettori verranno lavati via dal lume della biomatrice. Aggiungere la miscela di microcarrier RCP in gel di collagene sul lume della biomatrice. Lasciare gelificare per 30 minuti.Quindi, collegare il bioreattore alla pompa peristaltica e impostare la pressione a 100 millimetri di ampiezza di mercurio più meno 20. Infine, eseguire l'analisi e la lettura delle colture del bioreattore come descritto nel protocollo di testo. I risultati rappresentativi della proliferazione cellulare sui microcarrier sono dimostrati dalla colorazione con morte vive in cui molte cellule viventi possono essere osservate sui microcarrier dopo sette giorni di colture dinamiche.Questi risultati sono stati confermati dall'analisi al microscopio elettronico a scansione che ha mostrato microcarrier completamente colonizzati dopo sette giorni di colture dinamiche. Gli HDMEC hanno mantenuto la loro funzionalità dopo sette giorni di colture dinamiche su microcarrier RCP. Qui, la microscopia a campo chiaro rivela germogli che crescono dai microvettori colonizzati quando vengono coltivati su un gel di collagene.Gli HDMEC marcati con RFP sono stati osservati nelle strutture vascolari della biomatrice dopo 21 giorni di colture di bioreattori, indicando la loro migrazione dai microvettori RCP alla biomatrice. Inoltre, dopo 21 giorni di colture di bioreattori, l'immagine al microscopio elettronico a scansione mostra che i microvettori erano in prossimità della biomatrice. È interessante notare che non sono più colonizzati dalle cellule.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come espandere le cellule su microcarrier per prepararle in un sistema di somministrazione cellulare iniettabile per l'applicazione terapeutica. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro ore. Questa procedura rappresenta una strategia promettente nella medicina rigenerativa per ottenere e massimizzare l'espansione cellulare e per fornire cellule ai siti di impianto dove potrebbero migliorare la vascolarizzazione per gli innesti di ingegneria tissutale.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla vascolarizzazione perché può essere utilizzata su qualsiasi tipo di cellula per un'applicazione specifica del tessuto in uno scenario clinico. Questo metodo può anche fornire informazioni sul potenziale impiego dei microvettori come sistema di rilascio di cellule iniettabili per scopi terapeutici. Non dimenticare che lavorare con le cellule primarie può essere estremamente pericoloso e che quando si esegue questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare guanti e camice da laboratorio e lavorare in una cabina di biosicurezza.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'ingegneria tissutale per esplorare la migrazione cellulare in vitro che potrebbe aiutare a comprendere o prevedere situazioni in vivo.

recombinant-collagen-i-peptide-microcarriers-for-cell-expansion-their

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Uno degli ostacoli principali nelle terapie attuali delle cellule staminali sta determinando il metodo più efficace per fornire queste cellule ai tessuti ospitanti. Qui, descriviamo uno a base di chitosano metodo di consegna che sia efficiente e semplice l'approccio, consentendo nel contempo derivate da tessuto adiposo cellule staminali per mantenere il loro multipotenza.

Costruire un idrogel collagene per la fornitura di Stem Cell-loaded Chitosan Microsfere

In questo lavoro, presentiamo una tecnica per la rapida fabbricazione di tessuti vascolari viventi mediante coltura diretta di collagene, cellule muscolari lisce e cellule endoteliali. Inoltre, viene descritto un nuovo protocollo per la caratterizzazione meccanica di tessuti vascolari ingegnerizzati.

Ingegneria 3D Cellularized collagene Gel per Vascolare Rigenerazione Tissutale

L'ingegneria dei tessuti include spesso espansione in vitro per creare autologhi per la rigenerazione tissutale. In questo studio un metodo per l'espansione del tessuto, rigenerazione e ricostruzione in vivo è stata sviluppata al fine di minimizzare la trasformazione di cellule e materiali biologici di fuori del corpo.

Tissue tritata in Compressed Collagene: A Biotransplant cellulare contenente per la riparazione singolo-messa in scena Ricostruttiva

Vi presentiamo un protocollo per ottenere matrici derivati ​​dalle cellule ricche di proteine ​​della matrice extracellulare, utilizzando Crowders macromolecolari (MMC). Inoltre, vi presentiamo un protocollo che incorpora MMC nella generazione di pelle co-coltura organotipica 3D, che riduce i tempi di cultura, pur mantenendo la maturità di costrutto.

Migliorare 2D e 3D della pelle<em&gt; In Vitro</em&gt; modelli con Macromolecole affollamento

Il collagene è una componente fondamentale della ECM, e fornisce spunti essenziali per molti processi cellulari che vanno dalla migrazione verso la differenziazione e la proliferazione. Qui fornito è un protocollo per l'incorporamento celle all'interno di idrogel di collagene 3D, e una tecnica più avanzata per la generazione di matrici di collagene randomizzati o allineati con microcanali PDMS.

Preparazione del 3D collagene Gel e microcanali per lo studio delle interazioni 3D<em&gt; In Vivo</em

La matrice extracellulare tessuto-specifico (ECM) è un mediatore chiave della funzione delle cellule. Questo articolo descrive metodi per sintetizzare schiume e microcarriers che sono stabili in coltura senza la necessità di reticolazione chimica per applicazioni in 3D avanzata in colture di cellule in vitro o come bioscaffolds pro-rigenerativi ECM-derivato puri.

Fabbricazione di Schiume matrice extracellulare-derivati ​​e microcarriers come tessuto-specifica delle cellule, Cultura e piattaforme di distribuzione

Questo protocollo descrive la fabbricazione di microcryogels elastico 3D macroporosa integrando microfabbricazione con tecnologia cryogelation. Durante il caricamento con cellule, microtissues 3D vengono generati, che possono essere facilmente iniettate in vivo per facilitare la terapia rigenerativa o assemblati in matrici per in vitro screening di farmaci di alto-rendimento.

Microtissues 3D per la terapia rigenerativa iniettabile e droga di High-throughput Screening

Questo protocollo dimostra l'uso di un canale microfluidico con geometria variabile lungo la direzione del flusso del fluido per generare tensione estensionale (stretching) per allineare le fibre in un idrogel di collagene 3D (&lt;250 μm di spessore). L'allineamento risultante si estende su diversi millimetri ed è influenzato dalla velocità di deformazione estensionale.

Idrogel di collagene 3D di microingegneria con allineamento delle fibre a lungo raggio

Qui, presentiamo un protocollo per ottenere la produzione su larga scala di cellule aderenti attraverso un sistema completamente chiuso basato su microcarrier solubili di grado GMP. La coltivazione di cellule staminali mesenchimali umane, cellule HEK293T e cellule Vero è stata convalidata e ha soddisfatto sia le richieste di quantità che i criteri di qualità per l'industria della terapia cellulare e genica.

Produzione di celle su larga scala basata su microcarrier porosi solubili di grado GMP

Questo protocollo mira a valutare peptidi biofunzionali autoassemblanti per l'adesione cellulare, la morfologia degli organoidi e l'espressione genica mediante immunocolorazione. Utilizzeremo una linea cellulare di cancro del colon-retto per fornire un modo economico per ottenere organoidi per test intensivi.

Fabbricazione e caratterizzazione di organoidi di cancro del colon-retto da una linea cellulare SW1222 in una matrice peptidica autoassemblante ultracorta

Scopri l'espansione cellulare su microvettori macroporosi per l'ingegneria tissutale utilizzando bioreattori a perfusione. Questo metodo consente la consegna di cellule senza raccolta in siti di difetto per applicazioni cliniche.

Ricombinante collagene Peptide Microcarriers per lespansione delle cellule e loro potenziale utilizzo come sistema di consegna di cella in un bioreattore modello (Video) | JoVE Journal

Ricombinante collagene Peptide Microcarriers per l'espansione delle cellule e loro potenziale utilizzo come sistema di consegna di cella in un bioreattore modello

Esplora altri video