Name: Metodi di consegna orale RNA double-stranded per indurre RNAi nel floema e insetti Pentatomomorfi pianta-sap-alimentazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Scopri metodi di consegna orale di dsRNA per indurre RNAi nel floema e negli insetti Pentatomomorfi. Questa tecnica consente il silenziamento genico in vivo per la gestione sostenibile dei parassiti agricoli.

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Gli autori riconoscono con gratitudine Donald Weber e Megan Herlihy (USDA, ARS Beltsville, MD) per fornire BMSB e HB per la sperimentazione e mantenere le colonie; e Maria T. Gonzalez, Salvador P. Lopez, (USDA, ARS, Fort Pierce, FL) e Jackie L. Metz (University of Florida, Fort Pierce, FL) per manutenzione di Colonia, preparazione dei campioni e le analisi.

1. BMSB allevamento
<ol><li>Posteriore BMSB insetti secondo la pratica di laboratorio standard e precedentemente descritti63.</li>
	<li>Sollevare gli insetti ACP (d. citri) su Citrus macrophylla in una serra (22 ° C) e luce naturale. Uso adulto ACP, a circa 5-7 giorni post eclosion.</li>
</ol>2. selezione di regioni del Gene e la sintesi In Vitro di dsRNA
<ol><li>Selezionare geni specifici per BMSB da precedentemente pubblicati transcriptome profili32.</li>
	<li>Garantire le regioni di interesse selezionato variano tra 200 e 500 paia di basi.</li>
	<li>Eseguire la reazione a catena della polimerasi (PCR) utilizzando le condizioni descritte di seguito per generare frammenti associate al gene selezionato di interesse da DNA genomic. Vedere la tabella 1 per gli oligonucleotidi gene-specifico.<ol>
<li>Reazione di PCR: In un tubo PCR di 0,25 mL, combinare 5 µ l di tampone di PCR, 4 µ l di dNTP miscela (2,5 mM), 2 µ l di templato di DNA (50 ng / µ l), 2,5 µ l di primer 1 e 2 (10 µM), 0,25 µ l di DNA polimerasi (5 U / µ l): 10x , e fino a 50 µ l di acqua gratuita di DNasi e RNasi.</li>
		<li>Condizione PCR: ciclo la reazione di PCR per amplificare la regione di interesse a 95 ° C per 3 min seguita da 30 cicli di 98 ° C per 10 s, 55 ° C per 30 s, 72° C per 1 min. Incubare la reazione a 72 ° C per un ulteriore 10 min purificare la reazione di PCR utilizzando un kit di purificazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Amplificare i frammenti PCR ottenuti ulteriormente con i primers specifici del gene affiancato con la sequenza del promotore T7 RNA polimerasi (5'-GAA TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA-3') come accennato precedenti62.</li>
	<li>Utilizzare il gene LacZ come controllo negativo (mock) per RNAi. Nota: LacZ è un gene che codifica la β-galattosidasi amplificata da DNA genomic Escherichiacoli (primer usati sono elencati nella tabella 1).</li>
	<li>Eseguire la trascrizione in vitro per produrre dsRNA come precedente descritto62.</li>
	<li>Sciogliere e risospendere il dsRNA risultante in acqua libera dnasi/RNAsi di 150 µ l, misurare la concentrazione e conservare a-80 ° C per un uso futuro.</li>
</ol>3. consegna di dsRNA Using fagiolini
<ol><li>Selezionare presto 4th instar BMSB ninfe nati dallo stesso uovo di massa e di farli morire di fame per 24 h prima dell'alimentazione del dsRNA.</li>
	<li>Selezionare fagioli verdi organici certificati snelli (Phaseolus vulgaris L.) e lavare con soluzione di ipoclorito di sodio 0,2% per 5 min. Nota: Snelle fagiolini sono stati selezionati affinché i fagioli possono facilmente essere ospitati nelle provette microcentrifuga da 2 mL.</li>
	<li>Lavare 3 volte con ddH2O e lasciare asciugare all'aria.</li>
	<li>Tagliare i fagiolini dall'estremità di calice per una lunghezza totale di 7,5 cm con una lama di rasoio pulita.</li>
	<li>Immergete i fagiolini lavati e tagliati in un tubo del microcentrifuge PAC-meno 2 mL contenente 300 µ l di soluzione di controllo (un 01:10 diluizione di colorante alimentare verde (ingredienti: acqua, glicole propilenico, Fd & C giallo 5, Fd & C Blue 1 e Propylparaben come conservante)).</li>
	<li>Diluizioni di marca in vitro sintetizzato RNAds LacZ, JHAMT o Vg di diluzione µ g 5 o 20 µ g a 300 µ l di acqua gratuita di RNAsi/dnasi per produrre concentrazioni finali di 0,017 µ g / µ l o 0,067 µ g / µ l, rispettivamente.</li>
	<li>Immergete i fagiolini lavati e tagliati in un tubo del microcentrifuge PAC-meno 2 mL contenente 300 µ l di soluzione di dsRNA (dal punto 3.6).</li>
	<li>Avvolgere e sigillare il bordo delle provette microcentrifuga che racchiude i fagioli immersi per evitare l'evaporazione della soluzione dsRNA e per evitare che gli animali entrino il tubo del microcentrifuge.</li>
	<li>Posizionare questi tubi in maniera verticale a temperatura ambiente per 3 h per consentire la soluzione di dsRNA deve essere caricato in tutto il fagiolo verde per azione capillare.</li>
	<li>Posizionare questi tubi in recipienti di coltura pulita (polipropilene). Posto tre affamato 4th instar ninfe BMSB in recipienti di coltura.</li>
	<li>Trattare tre animali per peschereccio cultura ciascuno contenente tre fagiolini con soluzione di colorazione o dsRNA cibo verde. Mantenere gli insetti a 25 ° C e il 72% di umidità relativa, sotto un fotoperiodo di 16 L: 8 in un'incubatrice.</li>
	<li>Consentire gli insetti per nutrirsi i fagiolini (immersi e assorbito con dsRNA) per 5 giorni ma ricostituire con diete fresche di perline di dsRNA trattamento verde dopo 3 giorni.</li>
</ol>4. in tempo reale quantitativa (qPCR) analisi di espressione seguente RNAi mediata silenziamento genico in BMSB
<ol><li>Misurare l'effetto di RNAi sui livelli di espressione della trascrizione di qPCR.</li>
	<li>il RNA totale dagli animali dsRNA Trattato di isolare e sintetizzare il cDNA62.</li>
	<li>Programma di installazione le reazioni di qPCR utilizzando un sistema PCR in tempo reale e i primer elencati nella tabella 1. Utilizzare la seguente condizione di ciclismo qPCR: 95 ° C per 10 minuti seguiti da 40 cicli di 95 ° C per 15 s, 60 ° C per 1 min, insieme con passo di dissociazione tra cui 95 ° C per 15 s, 60 ° C per 1 min, 95 ° C per 15 s e 60 ° C per 15 s.</li>
	<li>Determinano gli standard di qPCR: utilizzare la diluizione seriale di cDNA preparato da RNA totale isolato da un animale normale come uno standard di riferimento per la quantificazione.</li>
	<li>Utilizzare RNA 18s BMSB come standard interno per correggere le differenze nel recupero di RNA da tessuti32.</li>
</ol>5. fogliari applicazione in grandi vasi di agrumi e piantine
Nota: Piante della cultivar agrumi 'Carrizo' citrange (Citrus sinensis XPoncirus trifoliata, Rutaceae), sono stati mantenuti in una serra sotto luce naturale e la temperatura, coltivate in contenitori di 1,2 L. Le piante erano costantemente potate per promuovere la crescita di nuovi germogli fogliari, chiamato 'filo'. ACP preferisce alimentazione e deposizione delle uova sulla nuova crescita di agrumi64.
<ol><li>Selezionare piante o piantine e non acqua per 2-3 giorni prima dell'uso per lasci il terreno asciugarsi a umido, ma non completamente asciutto.</li>
	<li>Utilizzando uno spruzzatore con pompa a mano applicare un 200 mL di soluzione di dsRNA (0,5 mg/mL) per la calotta inferiore (Figura 4A). Nota: Preparare il sopra menzionato dsRNA soluzioni in acqua libera del DNase/RNasi.</li>
	<li>Post-applicazione a spruzzo, lasciare che la soluzione di dsRNA applicata deve essere completamente assorbita dalle foglie. Nota: Alberi di agrumi assorbito il dsRNA applicato, e quindi le foglie da entrambi nuova crescita o dai rami che sono stati coperti prima dell'applicazione, sono stati estratti; il dsRNA era rilevabile mediante qPCR e ha mostrato il movimento sistemico nelle foglie degli alberi alto baldacchino in 3-4 h44,45,46.</li>
	<li>Assaggiare la nuova crescita dagli alberi precedentemente conditi dopo 25-40 giorni raccogliendo circa 10 foglie dalle punte dei quattro rami. Estratto il RNA totale e analizzarlo da trascrizione d'inversione PCR (RT-PCR) e qPCR per la presenza del trigger dsRNA applicata utilizzando i primers elencati nella tabella 1 e precedentemente descritti metodi46. Nota: La raccolta del campione, isolamento di RNA totale, RT-PCR e qPCR sono stati eseguiti come descritto in precedenza46.</li>
	<li>Allo stesso modo, per via topica spray 10ml dsRNA nella regione inferiore di un semenzale o fogliame piccolo albero in vaso. Nota: Gli insetti Pentatomomorfi (ACP ed esse) ci hanno dato accesso alimentazione normalmente a 24 h, post trattamenti su nuova crescita (foglie) che non era stato spruzzato direttamente, o che si è sviluppato dopo settimane, o piante intere. Questo prodotto di insetti quali testato positivo per il dsRNA a 3, 6 e 10 giorni, post allattamento.</li>
</ol>6. suolo/radice inzuppare applicazione in grandi o piccole in vaso piante e alberi di agrumi
<ol><li>Selezionare piantine o piante e non li acqua per 2-3 giorni prima dell'uso per lasci il terreno asciugarsi all'umidità ma non completamente asciutto (questo crea lo spazio aereo per contenere la soluzione liquida da applicare).</li>
	<li>Aggiungere 1 L di soluzione di dsRNA (0,2 mg/mL) al terreno delle grandi piante in vaso (circa 2,5 m) e 1 L di acqua (chaser) dopo 1 h.</li>
	<li>Applicare gli alberi di 100 mL di soluzione di dsRNA (1,33 mg/mL) al terreno di 1 m di altezza in vaso in terreni parzialmente asciutti.</li>
	<li>Per le piccole piantine, applicare 10 mL di soluzione di dsRNA (1 mg/mL) al suolo in coni o le radici nude (Figura 4B, C).</li>
	<li>Consentire le piante che ricevono la soluzione di dsRNA applicata come trattamento del suolo in ammollo per 30 min. Quindi applicare il trattamento solo acqua semplice per facilitare l'assorbimento dalle radici (20 mL per piante in contenitori gialli), o 100 se più grandi vasi della pianta sono > 1 gallone. Nota: DsRNA d'attualità applicato a fogliame è provocato da rilevamento al più distale punte dei rami all'interno di trattamenti post 3-6 h, mostrando circolazione sistemica attraverso gli alberi. Nuovi rami di sviluppo sono risultati positivi per dsRNA a 60-90 giorni post-trattamenti. I tagli sono forniti agli insetti (ACP ed esse) in un dsRNA alimentazione analisi biologica44.</li>
</ol>7. gambo rubinetto (iniezione del tronco di albero) applicazione in grandi vasi di agrumi e piantine
<ol><li>Selezionare piantine di agrumi, nuovo, o circa 3,5 anni vecchi impianti per l'iniezione di dsRNA utilizzando il gambo tocca il metodo (iniezioni di tronco).</li>
	<li>Forare le piante di agrumi con un trapano e una punta di 10 mm, facendo attenzione a non superare i 2 cm, o circa la metà del diametro del gambo.</li>
	<li>Avvolgere la punta di rame di ogni iniettore 4 - 6 volte con una striscia di larghezza di 0,6 cm (¼ di pollice) di film per evitare perdite nei pressi della punta saldante.</li>
	<li>Riempire gli iniettori del tronco di albero con 6 mL (1,7 mg/mL) di soluzione di dsRNA diluito in acqua libera del DNase/RNasi (indicato qui come soluzione colorata).</li>
	<li>Iniettare la soluzione nel tronco dell'albero e lasciare l'iniettore nel bagagliaio per 6-10 h per consentire l'assorbimento della soluzione dsRNA. Consentire gli insetti per nutrirsi le talee da alberi trattati a 3, 10 e 30 giorni dopo il trattamento. Nota: Il dsRNA iniettato usando il metodo di iniezione di tronco persistente tra gli alberi per un periodo di 30-60 giorni41,42,44. Convalida per RNAi è stata effettuata da qPCR utilizzando i primers elencati nella tabella 1.</li>
</ol>8. dsRNA granuli di argilla trattata per il recapito a insetti attraverso terreno
<ol><li>Versare l'argilla assorbente in una provetta conica da 50 mL fino alla tacca di 35 mL (circa 30 g di argilla assorbente) sul tubo.</li>
	<li>Versare 20 mL di soluzione di dsRNA diluito in acqua libera del DNase/RNasi (100 µ g/mL) nel tubo di bagnare tutto l'assorbente. Richiudere la provetta conica, punta il tubo per aiutare a rimuovere aria e richiudere la provetta.</li>
	<li>Disporre il tubo verticalmente e lasciar riposare per 1-2 min per le particelle di argilla di assorbire la soluzione.</li>
	<li>Aggiungere abbastanza argilla imbevuta di dsRNA nel suolo mix per riempire un vaso di 1 gallone.</li>
	<li>Mescolare e girare il terreno a mano per mescolare l'argilla imbevuta di dsRNA nel terreno.</li>
	<li>Utilizzare questo terreno per rinvasare semenzali selezionati per il trattamento di dsRNA.</li>
	<li>Acqua il terreno con 200 mL di acqua naturale senza dsRNA. Dopo 30 min a 1 h, seguire con 100 mL di acqua naturale. Dopo 24 h, mettere la pianta su un normale programma d'irrigazione.</li>
	<li>Test 4-6 foglie di piante in vaso trattate con sostanze assorbenti dell'argilla e dsRNA ogni trattamento post mese per dsRNA raccogliendo le foglie più apicale di nuovo sviluppo di pianta. Nota: Piante o talee da queste piante trattate sono alimentate agli insetti qualsiasi momento dopo 24h post-trattamento e sono stati in grado di consegna RNAi per fino ad un anno agli insetti (dati non pubblicati).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

RNAi ha dimostrato di essere uno strumento importante per esplorare la funzione biologica del gene e regolazione, con un grande potenziale per essere utilizzato per la gestione dei parassiti di insetto19,68,69,70, 71. il design e la scelta di un appropriato geni per silenziamento in una determinata specie di insetti e il metodo di consegna della dsRNA(s) corr...

Gli insetti Pentatomomorfi comprendono alcuni dei parassiti economicamente più significativi di agriculturebecause delle loro capacità per conseguire crescita demografica elevata e diffondere malattie delle piante. BMSB, H. halys Stål, è un parassita invasivo che è stato accidentalmente introdotto nell'emisfero occidentale a Allentown, in Pennsylvania, dall'Asia (Cina, Taiwan, Corea e Giappone) con il primo avvistamento segnalato nel 19961. Sin dalla sua introduzione, BMSB è stato rilevato in 43 Stati, con le popolazioni più alte nel Mid-Atlantic (DE, MD, PA, NJ, VA e WV), così come in Canada e in Europa e rappresenta una potenziale minaccia per l'agricoltura2. Come un parassita polifago, BMSB possono provocare danni ai circa 300 ospiti della pianta identificati tra cui colture di alto valore come mele, uva, piante ornamentali, colture da seme, semi di soia e mais. Danno è causato soprattutto a causa della modalità di alimentazione conosciuto come lacerare e a filo, dove l'animale trafigge il raccolto di host con suo mandrino aghiformi per ottenere l'accesso alle sostanze nutrienti dai tessuti vascolari2,3. BMSB è anche un parassita coperto come essi possono trovare residenza in ambienti quali scuole e case durante l'autunno e inverno2. Prodotti chimici e aeroallergens rilasciato da BMSB sono stati segnalati per illecita reazione allergica negli operai del raccolto di frutta. BMSB può anche contribuire alla malattia allergica che porta alla dermatite da contatto, congiuntivite e rinite allergica in individui sensibili4,5. Un altro insetto ematofago, l'ACP, d. citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), è un parassita serio di agrumi e trasmette i batteri limitato nel floema (Candidatus Liberibacter asiaticus) causando Huanglongbing (HLB), meglio conosciuto come citrus greening malattia6,7. HLB in primo luogo è stato segnalato dalla Cina meridionale e si è diffuso a 40 diversi asiatici, africani, dell'Oceania, Sud e nord americano Paesi7. Citrus greening è un problema in tutto il mondo con minacciose perdite economiche e finanziarie a causa della perdita di agrumi; quindi, gestione dell'ACP è considerato di estrema importanza per prevenire e controllare HLB.
Misure per un effettivo controllo di questi insetti di solito richiede l'applicazione di pesticidi chimici che sono relativamente breve vissuto. Strategie di controllo insetticida chimico spesso mancano strategie di gestione ambientale sicura o essersi ridotta suscettibilità a causa di resistenza agli antiparassitari in pest popolazioni8,9. Quindi, il controllo biologico dei parassiti con biopesticidi molecolare è un'alternativa potenziale, ma il suo utilizzo a livello mondiale rimane modesto, e varie specie di parassitoidi (ad es., Trisolcus japonicus) può anche essere efficace come naturale biologico controlli. il RNAi è un potenziale emergente tecnologia per la gestione dei parassiti di insetto invasivi con biopesticidi molecolare10. il RNAi è un meccanismo di regolazione genica descritta bene che facilita l'efficace post-trascrizionale genico di endogeno nonché invadendo dsRNA in modo sequenza-specifico, che finalmente conduce alla regolazione della espressione genica a mRNA livello11,12. Brevemente, quando dsRNA esogeno è interiorizzato in una cella che viene elaborato in siRNA da un membro della superfamiglia di RNAsi III bidentati nucleasi, chiamata Dicer, che è evolutivamente conservata in vermi, mosche, piante, funghi e mammiferi13, 14 , 15. questi duplex del siRNA di 21-25 nucleotidi sono quindi svolto e integrati nel complesso silenziamento indotto da RNA (RISC) come guida RNAs. Questo complesso RISC-RNA permette di Watson-Crick appaiamento complementare destinazione mRNA; questo alla fine porta alla scissione dalla proteina Argonaute, una proteina di dominio multi contenente un RNasi H-come dominio, che degrada il mRNA corrispondenti e riduce la traduzione della proteina, determinando così il silenziamento genico post-trascrizionale16 , 17 , 18.
RNAi per gestione dei parassiti richiede l'introduzione del dsRNA in vivo per silenziare il gene di interesse, quindi attivazione della via di siRNA. Vari metodi che sono stati utilizzati per la consegna di dsRNA per insetti e cellule di insetto per indurre RNAi sistemica includono alimentazione10,19, ammollo20,21, microinjection22, vettori quali liposomi 23e altre tecniche24. RNAi è stato prima dimostrato in Caenorhabditis elegans al silenzio unc-22 l'espressione genica di Fire e Mello25, seguita da atterramento nell'espressione dei geni frizzled in Drosophila melanogaster26. Gli studi funzionali iniziali utilizzate microiniezione per offrire dsRNA in insetti, come Apis mellifera22,27, Acyrthosiphon pisum28, Blattella germanica29, H. halys30e lepidotteri insetti (recensiti da Terenius et al. 31). microinjection è vantaggiosa per consegnare un dosaggio accurato e preciso per il sito di interesse per l'insetto. Anche se tali punture settici possono suscitare espressione dei relativi geni immuni a causa di trauma32, quindi, escludere la sua praticità nello sviluppo agricolo biopesticidi.
Un altro metodo di consegna dsRNA in vivo è di ammollo, che coinvolge ingestione o assorbimento di dsRNA da sospensione di animali o di cellule generalmente nel mezzo extracellulare contenente dsRNA. Ammollo è stato utilizzato in modo efficiente indurre RNAi in cellule di coltura del tessuto della drosofila S2 per inibire a valle-di-Raf1 (DSOR1) della proteina mitogene-attivata della chinasi della chinasi (MAPKK)20, così come in c. elegans per mettere a tacere la pos-1 gene33. Tuttavia, dsRNA recapitato tramite ammollo è meno efficace per indurre RNAi rispetto a microiniezione20. RNAi mediata silenziamento in un insetto da masticare era primo indicato nella diabrotica del mais (WCR) (Diabrotica virgifera virgifera) infondendo il dsRNA in una dieta artificiale agar10. Rapporti più iniziali sono riassunti i metodi per consegnare dsRNA infuso in diete naturali specifiche di artropodi34. Questi metodi di consegna più ulteriormente sono stati determinati per essere efficace in modo paragonabile ai mezzi artificiali di consegna; come nel caso della mosca tse-tse (Glossina glossinidius glossinidius), dove uguale colpo di un gene di immuno-correlati è stata osservata quando il dsRNA è stato consegnato tramite pasto di sangue o iniettati35. Allo stesso modo, consegna di dsRNA attraverso le goccioline in light brown apple moth (Epiphyas postvittana)36, diamondback moth (Plutella xylostella) larve37, nonché miele le API38,39 indotto RNAi efficiente. Esperimenti di RNAi più efficaci in Pentatomomorfi hanno utilizzato iniezione del dsRNA40 perché la consegna orale di dsRNA negli insetti Pentatomomorfi è ardua, poiché deve essere consegnato attraverso tessuti vascolari della pianta ospite. RNAi efficace inoltre è stata osservata nei paesi ACP e cicaline glassy-winged sharpshooter (esse), Homalodisca vitripennis: dsRNA è stato recapitato tramite agrumi e viti che avevano assorbito dsRNA nei tessuti vascolari attraverso inzuppare radice, fogliare spray, iniezioni di tronco o assorbimento di talee41,42,43,44,45,46. Ciò inoltre ha provocato il primo brevetto per dsRNA contro i paesi ACP (2016, noi 20170211082 A1). Consegna di siRNA e dsRNA utilizzando vettori come nanoparticelle e liposomi conferisce stabilità e aumenti nell'efficacia di dsRNA consegnati stanno rapidamente emergendo23,47,48,49 ,50. Una nuova classe di veicoli di consegna basato su nanoparticelle per acidi nucleici per in vitro e in vivo che è stato ricapitolato specificamente per le applicazioni terapeutiche possono conferire un potenziale immenso come adatto consegna file vettoriale51. Le nanoparticelle come un veicolo di consegna per dsRNA possono avere svantaggi tra cui solubilità, idrofobicità o bioaccumulazione limitata52, ma una consegna di favoreggiamento di polimero adatto può compensare questi svantaggi. Sviluppo e l'utilizzo di auto-consegna nucleotidi stanno emergendo anche chiamati 'oligonucleotidi antisenso', che sono single stranded RNA/DNA duplex46.
Vitellogenesi in artropodi sono un fondamentale processo di controllo della riproduzione e regolati da ormone giovanile (JH) o ecdisone, che sono il chiavi induttori di Vg sintesi del grasso di corpo; il Vg è finalmente ripreso dall'ovocita in via di sviluppo via Vg recettore mediata endocytosis53. VG è un gruppo di polipeptidi sintetizzati extraovarially, che è essenziale per lo sviluppo della proteina del tuorlo dell'uovo principali, vitellino54,55, e pertanto, è importante nella riproduzione e invecchiamento56. VG è stato silenziato con successo in nematodi57 come pure in ape del miele (mellifera di Apis) dove RNAi mediata deplezione di Vg è stato osservato in adulti e uova22. RNAi genico post-trascrizionale mediata di Vg è stato testato perché si pensava che suo svuotamento porterebbe ad un effetto fenotipico osservabile come ridotta fertilità e fecondità, per potenzialmente aiutare nel controllo BMSB. Il gene JHAMT che codifica per la S-adenosyl-L-metionina (SAM)-dipendente JH acido O-metiltransferasi, catalizza la tappa finale del JH biosintesi via58. In questo percorso Farnesil pirofosfato (FPP) in sequenza si trasforma da farnesolo, a farnesoic acido seguita dalla conversione di metile farnesoate a JH da JHAMT. Questa via è conservata in insetti e artropodi in particolare per la metamorfosi, un processo che inerente allo sviluppo è regolato da ormoni59,60,61. In b. mori, espressione genica JHAMT e l'attività biosintetica JH i Corpora allata suggeriscono che la soppressione trascrizionale del gene JHAMT è cruciale per la terminazione di JH biosintesi58. Di conseguenza, i geni JHAMT e Vg sono stati selezionati per lo svuotamento mirato mediante RNAi. RNAi è stato testato anche in alberi di agrumi per il controllo dei paesi ACP e di esse. Alberi di agrumi sono stati trattati con dsRNA attraverso inzuppare radice, gambo rubinetto (iniezioni di tronco), così come spray fogliare con RNAds contro insetti specifici arginina chinasi (AK) trascrizioni42,44. L'applicazione topica di dsRNA è stato rilevato tutto sopra il baldacchino di alberi di agrumi, che indica una consegna efficiente attraverso i tessuti di piante vascolari e ha provocato la mortalità aumentata in ACP ed esse41,42, 45.
Nello studio corrente, abbiamo identificato un metodo di consegna dieta naturale per trattamenti quali dsRNA. Questa tecnica di recente sviluppata è stato successivamente utilizzata per mettere a tacere la JHAMT e Vg mRNA mediante dsRNA specifico gene in ninfe BMSB come dimostrato precedenti62. Questi nuovi protocolli di recapito ha dimostrati qui sostituiscono convenzionali sistemi di consegna di RNA che utilizzano spray topici o microiniezioni. Verdure e frutta, staminali rubinetto, suolo inzuppando e assorbenti di argilla in possono essere utilizzati per la consegna di dsRNA, che è fondamentale per il costante sviluppo di biopesticida gestione dei parassiti e patogeni.

<table><tbody><tr><td>BMSB (H. halys) insetti&nbsp;</td><td>USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACP (D. citri) insetti&nbsp;</td><td>Fagiolini biologici USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piante di agrumi</td><td>Soluzione di</td> ipoclorito di sodio USDA <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>J.T. Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>colorante alimentare verde</td><td>McCormick & Co., Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camere Thermo Forma&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magenta vessel (Cultura)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primers&nbsp;</td><td>IDT DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SensiMix SYBR</td><td>Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qPCR ABI 7500</td><td>Applied Biosystems&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flacone spray</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>American Can Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaKaRa Ex Taq</td><td>Clontech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metodi di consegna orale rna double-stranded per indurre rnai nel floema e insetti pentatomomorfi pianta-sap-alimentazione

Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

Floema e pianta sap alimentazione insetti invadono l'integrità delle colture e frutti per recuperare le sostanze nutrienti, nel processo di danneggiare le colture alimentari. Gli insetti Pentatomomorfi rappresentano un certo numero di parassiti economicamente sostanziali delle piante che causano danni alle colture di alimentazione su sap del floema. Il marrone marmorated stink bug (BMSB), Halyomorpha halys (Heteroptera: Pentatomidae) e l'Asian psyllid agrumi (ACP), Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) sono parassiti di insetto ematofago introdotti in Nord America, dove essi sono un parassita agricolo dilagante di agrumi, riga e colture di base e specialità di alto valore, come pure un parassita di fastidio quando raccolgono al chiuso. Resistenza agli insetticidi in molte specie ha portato allo sviluppo di metodi alternativi di strategie di lotta. Double-stranded RNA (dsRNA)-mediata RNA interference (RNAi) è un meccanismo per studi di genomica funzionali che ha applicazioni potenziali come uno strumento per la gestione dei parassiti di insetto il silenziamento genico. DsRNA esogenicamente sintetizzato o short interfering RNA (siRNA) può innescare altamente efficiente del silenziamento genico attraverso la degradazione del RNA endogeno, che è omologo a quello presentato. Uso efficace e ambientale di RNAi come biopesticidi molecolare per biocontrollo di insetti Pentatomomorfi richiede la consegna in vivo di RNAds attraverso l'alimentazione. Qui dimostriamo metodi per la consegna di dsRNA agli insetti: caricamento di dsRNA in fagiolini per immersione e assorbimento di gene-specific del dsRNA con consegna orale attraverso l'ingestione. Inoltre abbiamo delineato non transgenica pianta approcci di recapito utilizzando spray fogliare, inzuppare di radice, iniezioni di tronco così come granuli di argilla, che può essere essenziale per il rilascio prolungato di dsRNA. Consegna efficiente di dsRNA ingerito per via orale è stata confermata come un dosaggio efficace per indurre una diminuzione significativa nell'espressione del gene targeting, come ormone giovanile l'acido O-metiltransferasi (JHAMT) e vitellogenina (Vg). Questi metodi innovativi rappresentano strategie per la consegna di dsRNA da usare nella protezione delle colture e superare le sfide ambientali per la gestione dei parassiti.

Consegna di verdure dsRNA mediata attraverso alimentazione in BMSB 4th instar ninfe è stato testato per lo sviluppo di biopesticidi molecolare mediante RNAi per parassiti di insetto invasivi. BMSBs feed utilizzando loro stiletti aghiformi da un meccanismo conosciuto come lacerare e lavare, causando notevoli danni alle colture. Fagioli verdi organici snelli, p. vulgaris L., sono stati utilizzati per verificare se le sostanze nutrienti o dsRNA poteva essere recapitata <e...

In questo articolo vengono illustrate le tecniche romanzo sviluppati per la consegna orale del RNA double-stranded (dsRNA) attraverso i tessuti vascolari delle piante per interferenza del RNA (RNAi) in sap floema insetti d'alimentazione.

Metodi di consegna orale RNA double-stranded per indurre RNAi nel floema e insetti Pentatomomorfi pianta-sap-alimentazione

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

L'obiettivo generale di queste procedure è dimostrare un metodo di somministrazione orale naturale. Per dsRNA gene-specifici, per indurre l'interferenza dell'RNA in vivo e insetti nocivi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave su come fornire biomolecole all'interno degli insetti, a chiarire l'effetto dei biopesticidi molecolari basati su RNAi e a controllare gli insetti nell'ambiente.Il vantaggio principale di questa tecnica è che questa somministrazione attraverso il silenziamento genico mediato dall'acido nucleico può essere applicata all'alimentazione della linfa delle piante e agli insetti masticatori. Sebbene i metodi qui dimostrino la consegna di RNA a doppio filamento ai parassiti degli emitteri, come la cimice marmorata bruna, la cimice arlecchino e la psillide asiatica degli agrumi. Possono essere applicati ad altri insetti.Per iniziare il protocollo, seleziona la cimice marmorata marrone del 4° stadio, o ninfe BMSB, nate dalla massa dell'uovo, e falle morire di fame per 24 ore prima dell'alimentazione del dsRNA. Successivamente, seleziona i fagiolini sottili e certificati biologici e lavali con una soluzione di ipoclorito di sodio allo 0,2% per cinque mi

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In questo protocollo, si descrive due strategie che sopprimono contemporaneamente due geni (doppia knockdown gene) di api mellifere. Poi ci presentiamo come usare la risposta estensione proboscide (PER) test per studiare l'effetto di doppio knockdown gene sul miele d'api percezione gustativa.

RNAi mediato doppia Gene atterramento e gustative Percezione misura di api mellifere (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

Qui si descrive un procedimento per inibire la funzione del gene in zanzare vettori di malattie attraverso l'uso di chitosano / RNA interferenti nanoparticelle che vengono ingeriti da larve.

Il chitosano / interferenti RNA nanoparticelle mediata silenziamento genico in Disease Vector Mosquito Larve

L'interferenza dell'RNA (RNAi) è uno strumento estremamente prezioso per scoprire la funzione genica. Tuttavia, la capacità di indirizzare i geni utilizzando l'RNAi durante gli stadi pre-adulti è limitata nel principale vettore umano della malaria, l'Anopheles gambiae. Descriviamo un protocollo RNAi per ridurre la funzione genica tramite iniezione diretta durante lo sviluppo della pupa.

RNAi trigger consegna in<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Pupe

Qui, vi presentiamo i protocolli per l'allevamento di un coleottero intermedio di germi, Dermestes maculatus (D. maculatus) in laboratorio. Condividiamo anche protocolli per embrionale e genitori RNAi e metodi per l'analisi dei fenotipi embrionali per studiare la funzione dei geni in questa specie.

Allevamento e RNA a doppio filamento mediata silenziamento genico nel Hide Beetle, Dermestes maculatus

Questo manoscritto viene illustrato lo svuotamento dell'espressione genica in midgut il tedesco scarafaggio attraverso ingestione orale di RNA double-stranded incapsulato in liposomi.

Uso pratico di interferenza del RNA: consegna orale del RNA Double-stranded in elementi portanti di liposomi per scarafaggi

L'interferenza dell'RNA è una tecnica potente e ampiamente applicabile per manipolare l'espressione genica in fasi di sviluppo specifiche. Qui, descriviamo i passaggi necessari per l'implementazione di questa tecnica nel coleottero subacqueo acquatico Thermonectus marmoratus, dall'acquisizione di sequenze geniche al knockdown di geni che influenzano la struttura o il comportamento.

Interferenza dell'RNA nei Coleotteri acquatici come potente strumento per manipolare l'espressione genica in punti specifici del tempo di sviluppo

Il presente protocollo descrive un metodo per raccogliere una quantità sufficiente di saliva dagli insetti che succhiano il piercing usando un mezzo artificiale. Questo è un metodo conveniente per raccogliere la saliva degli insetti e studiare la funzione salivare sul comportamento di alimentazione degli insetti e sulla trasmissione del virus trasmesso da vettori.

Metodo sandwich a membrana a due strati per la raccolta della saliva di Laodelphax striatellus

La somministrazione orale di dsRNA prodotto dai batteri, un metodo di consegna per l'interferenza dell'RNA (RNAi) che viene regolarmente utilizzato in Caenorhabditis elegans, è stato applicato con successo qui alle zanzare adulte. Il nostro metodo consente robusti studi di genetica inversa e studi vettoriali che bloccano la trasmissione senza l'uso dell'iniezione.

Somministrazione efficace di interferenza orale dell'RNA (RNAi) alle zanzare Anopheles gambiae adulte

Qui, introduciamo un metodo dettagliato di ammollo dell'interferenza dell'RNA in Bursaphelenchus xylophilus per facilitare lo studio delle funzioni geniche.

Applicazione dell'interferenza dell'RNA nel nematode del pino, Bursaphelenchus xylophilus

La manipolazione dell'interferenza dell'RNA (RNAi) rappresenta una sfida formidabile in molte specie di parassitoidi di dimensioni ridotte, come le vespe Trichogramma . Questo studio ha delineato un metodo RNAi efficiente in Trichogramma denrolimi. La presente metodologia fornisce un modello robusto per lo studio della regolazione genica nelle vespe Trichogramma .

Interferenza dell'RNA nel parassitoide dell'uovo, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Qui viene presentato un protocollo per la somministrazione di nanoparticelle di chitosano/dsRNA nelle larve di Bombyx mori del baco da seta per indurre il silenziamento genico attraverso l'ingestione.

Interferenza dell'RNA larvale nel baco da seta Bombyx mori attraverso la somministrazione di nanoparticelle di chitosano/dsRNA

Scopri metodi di consegna orale di dsRNA per indurre RNAi nel floema e negli insetti Pentatomomorfi. Questa tecnica consente il silenziamento genico in vivo per la gestione sostenibile dei parassiti agricoli.

Metodi di consegna orale RNA double-stranded per indurre RNAi nel floema e insetti Pentatomomorfi pianta-sap-alimentazione

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