Metodi di consegna orale RNA double-stranded per indurre RNAi nel floema e insetti Pentatomomorfi pianta-sap-alimentazione

L'obiettivo generale di queste procedure è dimostrare un metodo di somministrazione orale naturale. Per dsRNA gene-specifici, per indurre l'interferenza dell'RNA in vivo e insetti nocivi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave su come fornire biomolecole all'interno degli insetti, a chiarire l'effetto dei biopesticidi molecolari basati su RNAi e a controllare gli insetti nell'ambiente.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che questa somministrazione attraverso il silenziamento genico mediato dall'acido nucleico può essere applicata all'alimentazione della linfa delle piante e agli insetti masticatori. Sebbene i metodi qui dimostrino la consegna di RNA a doppio filamento ai parassiti degli emitteri, come la cimice marmorata bruna, la cimice arlecchino e la psillide asiatica degli agrumi. Possono essere applicati ad altri insetti.

Per iniziare il protocollo, seleziona la cimice marmorata marrone del 4° stadio, o ninfe BMSB, nate dalla massa dell'uovo, e falle morire di fame per 24 ore prima dell'alimentazione del dsRNA. Successivamente, seleziona i fagiolini sottili e certificati biologici e lavali con una soluzione di ipoclorito di sodio allo 0,2% per cinque minuti. Seguire con tre lavaggi di H2O a doppia distillazione e lasciare asciugare i chicchi all'aria.

Una volta asciutti, taglia i fagiolini dall'estremità del calice fino a una lunghezza totale di 7,5 centimetri usando una lama di rasoio pulita. Immergere i fagiolini lavati e mondati in una provetta da microcentrifuga da due millilitri senza tappo contenente 300 microlitri di soluzione di controllo. Effettuare diluizioni dei lac Z, JHAMT o VGDSRNA sintetizzati in vitro, diluendo 5 microgrammi, o 20 microgrammi, e 300 microlitri di RNA, acqua priva di DNA, per ottenere concentrazioni finali di 0,017 microgrammi per microlitro, o 0,067 microgrammi per microlitro, rispettivamente.

Immergere i fagiolini lavati e mondati in una provetta da microcentrifuga da due millilitri senza tappo, contenente 300 microlitri di soluzione di dsRNA. Avvolgere e sigillare i bordi delle provette per microcentrifuga, racchiudendo i fagioli immersi per evitare l'evaporazione della soluzione di dsRNA e per evitare che gli animali entrino nella provetta per microcentrifuga. Posizionare le provette in posizione verticale a temperatura ambiente per tre ore, per consentire alla soluzione di dsRNA di caricarsi in tutto il fagiolo verde per azione capillare.

Posizionare le provette in recipienti di coltura puliti in polipropilene e posizionare 3 ninfe BMSB di 4° stadio affamate nei recipienti di coltura. Trattare tre insetti per recipiente di coltura. Ciascuno contiene tre fagiolini con colorante alimentare verde o soluzione di dsRNA.

Mantenere gli insetti a 25 gradi Celsius e 72% di umidità relativa, sotto un 16L, 8D fotoperiodo in un'incubatrice. Consenti agli insetti di nutrirsi dei fagiolini immersi e assorbiti nel dsRNA per cinque giorni e reintegrali con diete fresche di fagiolini trattati con dsRNA dopo tre giorni. Seleziona piante o piantine e non annaffiarle per due o tre giorni prima dell'uso, per lasciare che il terreno si asciughi fino a diventare umido, ma non completamente asciutto.

Utilizzando un flacone spray pompato a mano, applicare 200 millilitri di soluzione di dsRNA sulla chioma inferiore. Campiona la nuova crescita da alberi precedentemente cimati dopo 25-40 giorni, raccogliendo circa 10 foglie dalle punte di quattro rami. Estrarre l'RNA totale e analizzarlo mediante RT-PCR e qPCR per la presenza del trigger del dsRNA applicato.

Allo stesso modo, spruzzare localmente 10 millilitri di dsRNA nella regione inferiore di una piantina o del fogliame di un albero in vaso piccolo. Seleziona piante o piantine e non annaffiarle per due o tre giorni prima dell'uso, per lasciare che il terreno si asciughi, per inumidire, ma non asciugare completamente. Quindi, aggiungi un litro di soluzione di dsRNA al terreno delle piante in vaso grande.

Aggiungere un litro d'acqua dopo un'ora. Applicare 100 millilitri di soluzione di dsRNA sul terreno di alberi in vaso alti un metro in terreni parzialmente asciutti. Lascia che le piante ricevano la soluzione di dsRNA come inzuppamento del terreno, in ammollo per 30 minuti.

Quindi applicare un semplice trattamento con sola acqua per favorire l'assorbimento da parte delle radici. Seleziona piantine di agrumi, piante nuove o di circa 3,5 anni per iniettare il dsRNA utilizzando il rubinetto dello stelo, noto anche come metodo delle iniezioni del tronco. Avvolgere la punta di rame di ciascun iniettore da quattro a sei volte con una striscia di pellicola per soffitto larga 0,6 centimetri per evitare perdite vicino alla punta.

Successivamente, riempi gli iniettori del tronco dell'albero con sei millilitri di soluzione di dsRNA diluita con DNA, acqua priva di RNA. Praticare dei fori nelle piante di agrumi utilizzando una punta da trapano da 10 millilitri e fare attenzione a non superare i due centimetri, ovvero circa la metà del diametro del gambo. Quindi, iniettare la soluzione nel tronco dell'albero e lasciare l'iniettore nel tronco per sei-10 ore per consentire l'assorbimento della soluzione di dsRNA.

Lascia che gli insetti si nutrano delle talee degli alberi trattati a 3, 10 e 30 giorni dopo il trattamento. Versare 30 grammi di argilla assorbente in un tubo conico da 50 millilitri fino alla tacca di 35 millilitri. Versare 20 millilitri di soluzione di dsRNA diluita in DNA, acqua priva di RNA nel tubo per bagnare tutto l'assorbente.

Tappare il tubo conico, inclinare il tubo per rimuovere l'aria, posizionare il tubo in posizione verticale e lasciarlo riposare per uno o due minuti mentre le particelle di argilla assorbono la soluzione. Aggiungi abbastanza argilla imbevuta di dsRNA nella miscela di terreno per riempire un vaso da un gallone. Mescola e gira il terreno a mano per mescolare accuratamente l'argilla imbevuta di dsRNA nel terreno.

Usa il terreno per rinvasare le piantine selezionate per il trattamento con dsRNA. Innaffia il terreno con 200 millilitri di acqua naturale, senza dsRNA, dopo 30 minuti a un'ora. Seguire con 100 millilitri di acqua naturale.

Dopo 24 ore, metti la pianta su un normale programma di irrigazione. Testare da quattro a sei foglie delle piante in vaso trattate con assorbenti di argilla e dsRNA ogni mese, dopo il trattamento per il dsRNA, raccogliendo le foglie più apicali della nuova crescita delle piante. La QPCR di segmenti di fagiolini immersi in dsRNA sintetizzato in vitro, specifico per la cimice marmorata bruna, o mRNA BMSB, ha indicato il successo dell'induzione di RNAi poiché l'espressione dei bersagli JHAMT e Vg è stata significativamente ridotta in vivo.

Questo metodo di somministrazione è efficace anche su un altro parassita emittero, la cimice arlecchino. Come indicato dai loro escrementi di colore verde. Dopo aver visto queste dimostrazioni visive, dovresti avere una buona comprensione di come fornire RNA a doppio filamento agli insetti attraverso l'ingestione orale per indurre insetti RNAi in vivo.

I progressi compiuti nella tecnologia dei nucelotide RNAi continuano ad espandere le capacità dei ricercatori di modulare l'RNA, l'espressione genica e i livelli di proteine in un'ampia gamma di organismi viventi. Questo va dalle piante, agli insetti e ai microrganismi più difficili. Quindi, mentre il costo di produzione dell'RNA a doppio filamento continua a diminuire e i metodi di somministrazione e stabilità continuano a migliorare, il futuro delle tecnologie RNAi continuerà ad essere utilizzato per risolvere problemi emergenti e complessi.