Rapida In Vivo valutazione della funzionalità di generazione i linfociti T citotossici di adiuvante per lo sviluppo di vaccini

L'obiettivo generale di questo esperimento è determinare la capacità degli adiuvanti di interesse di generare linfociti T citotossici monitorando la proliferazione di cellule T CD8 CD8 OT1 CD8 colorate con CFSE trasferite in modo adottivo nei linfonodi drenanti e nella milza di animali riceventi immunizzati. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della vaccinologia come la potenza di un adiuvante per generare una risposta cellulare di citotossicità. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile determinare non solo la capacità CTL di un adiuvante, ma anche se questa è locale o sistemica e si può farlo solo in quattro giorni.

A dimostrare la procedura sarà un tecnico del nostro laboratorio, Elena Reinhard. Per isolare le cellule T CD8 positive 1,1 positive della coscia da topi OT1, prelevare prima la milza e i linfonodi inguinale, ascellare e cervicale secondo i protocolli standard posizionando tutti gli organi in un colino a rete di pori da 100 micrometri in una piastra di Petri da 60 millimetri contenente da tre a cinque millilitri di terreno completo su ghiaccio per topo mentre vengono raccolti. Non raccogliere in grandi milze o linfonodi OT1 perché le cellule T di questi tessuti linfatici possono essere leucemiche e proliferano anche senza stimolazione, confondendo i risultati del test.

Quando tutti gli organi sono stati prelevati da ciascun animale donatore, utilizzare uno stantuffo a siringa per schiacciare i campioni attraverso il filtro a rete e trasferire le singole sospensioni risultanti in un tubo conico da 15 millilitri per topo. Pellettizzare le celle mediante centrifugazione, seguita da un lavaggio per centrifugazione in 10 millilitri di PBS freddo. Lisi il pellet di globuli rossi in un millilitro di tampone di cloruro di ammonio per provetta su ghiaccio.

Dopo 90 secondi, lavare le cellule in altri 10 millilitri di PBS e risospendere le cellule in un millilitro di PBS più il 5% di FBS per provetta. Quindi utilizzare un kit selettivo negativo per isolare le cellule T CD8 positive secondo i protocolli standard di isolamento delle biglie magnetiche e contare il numero di cellule T CD8 positive ordinate con biglie magnetiche. Successivamente, diluire le cellule T da uno a cinque per 10 fino alla settima cellula per millilitro di concentrazione di PBS in singole provette coniche da 15 millilitri e colorare ogni campione di cellule con cinque micromolari di CFSE per sette minuti a 37 gradi Celsius e al riparo dalla luce.

Al termine dell'incubazione, spegnere la reazione di colorazione con un volume uguale di FBS e riportare le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius per altri sette minuti. Al termine della seconda incubazione, lavare le cellule due volte in 10 millilitri di PBS per lavaggio e risospendere le cellule in volumi di PBS da tre a cinque per 10-7-7 cellule per millilitro. Per il trasferimento adottivo delle cellule T OT1 marcate con CFSE, caricare le cellule in una siringa da un millilitro dotata di un ago calibro 25 per campione di cellule sperimentali e immobilizzare il primo topo ricevente in un sistema di contenzione.

Quindi, quando le vene della coda si sono vasodilatate, erogare 100 microlitri di cellule attraverso la vena della coda laterale o dorsale. Per l'immunizzazione degli animali trasferiti in modo adottivo, radere il pelo sopra il gluteo superficiale del topo trapiantato con cellule T OT1 e utilizzare un ago calibro 25 per iniettare per via sottocutanea 50 microlitri di OVA privo di endotossine nell'area rasata. È importante utilizzare OAV privi di endotossine perché tracce di endotossina nell'OAV possono portarti a risultati falsi.

Quarantotto ore dopo l'immunizzazione, prelevare i linfonodi inguinali e la milza da ciascun animale ricevente secondo protocolli standard e generare sospensioni individuali di singole cellule per ogni campione di linfonodi e milza come appena dimostrato. Raccogliere le celle mediante centrifugazione e risospendere i pellet in 100 microlitri di PBS per campione. Per colorare i campioni per l'analisi citofluorimetrica, incubare le cellule con 100 microlitri di cocktail master di anticorpi primari coniugati con fluoroforo per 30 minuti a quattro gradi Celsius.

Al termine dell'incubazione, lavare le cellule due volte in 10 millilitri di PBS e risospendere i campioni in 0,5-1 millilitro di PBS per provetta. Filtrate le cellule attraverso filtri da 70 a 100 micrometri in provette di analisi per citometria a flusso da cinque millimetri e acquisite i singoli controlli di compensazione della colorazione e i campioni nel citometro a flusso. Per eseguire il gate dei campioni, aprire un grafico dell'altezza di dispersione diretta rispetto all'area di dispersione diretta e un grafico e un gate dell'area di dispersione laterale rispetto all'area di dispersione laterale per escludere i doppietti.

Generare un grafico FITC rispetto all'autofluorescenza per discriminare la popolazione di cellule colorate con CSFE reale dalle cellule ad alta autofluorescenza. Gate queste cellule colorate con CSFE OT1 come le popolazioni che si estendono principalmente sull'asse FITC. Per distinguere le cellule derivate da animali donatori da quelli riceventi, portare la coscia 1,1 più CD90 0,1 più CD8 più cellule T e re-gate della popolazione CD8 plus per escludere le cellule T CD4 plus.

Quindi visualizzare questa popolazione di cellule T CD8 proliferate in un istogramma in base alla loro espressione CSFE e portare le popolazioni proliferate da un'intensità di 10 alla seconda fino all'intensità della popolazione di controllo indivisa. Acquisire almeno 5.000 eventi per i controlli di compensazione e 10.000 eventi per ogni campione ad una velocità di analisi di flusso bassa o media. In questo esperimento, due gruppi di topi sono stati vaccinati con uno dei due diversi adiuvanti.

I topi a cui è stato iniettato OVA più il secondo adiuvante hanno mostrato una maggiore capacità di generazione di cellule T citotossiche localmente nei linfonodi drenanti rispetto ai topi iniettati con il primo adiuvante più OVA, OVA da solo o il vaccino di controllo PBS. Al contrario, nei topi iniettati con il secondo adiuvante più OVA non hanno generato una risposta citotossica delle cellule T in un compartimento sistemico, mentre le cellule T CD8 positive isolate dalla milza dei topi adiuvanti uno più OVA hanno dimostrato livelli più elevati di proliferazione rispetto alle cellule T CD8 positive spleniche isolate dal solo OVA, dal controllo PBS e dagli animali vaccinati con adiuvante due più OVA. Una volta padroneggiata, questa tecnica ti permetterà di determinare la capacità CTL di una molecola adiuvante utilizzando l'antigene OVA in soli quattro giorni di lavoro.

Dopo aver eseguito questa tecnica, sarai in grado di applicare ulteriormente tutte le altre tecniche alle cellule T isolate e quindi di fenotipizzare il profilo delle citochine o il profilo metabolico della risposta CTL del tuo adiuvante.