Name: Gli stomi nastro-Peel: Un metodo migliore per la preparazione del campione di cellule di guardia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Impara a isolare cellule di guardia intatte dal tessuto fogliare per studi fisiologici e biochimici. Questo metodo migliora l'arricchimento cellulare e fornisce campioni affidabili per analisi molecolari.

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Ringraziamo Daniel Chen dalla Digital Video produzione Team di Buchholz High School per assistenza nell'editing del video. Questa ricerca su cellule di guardia stomatica, proteomica e metabolomica in laboratorio Chen è stata sostenuta da sovvenzioni dal US National Science Foundation (0818051, 1158000 e 1412547). Wenwen Kong è supportato dal Consiglio di borsa di studio di Cina. Dr. Qiuying Pang è supportato dalla Cina Scholarship Council e la Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (31570396).

1. coltivazione di piante
<ol><li>Germinare i semi in miscela di impregnazione. Crescere le piante in una camera di crescita con un'intensità luminosa di 140 µmol fotoni m− 2 s − 1 e un fotoperiodo di luce 8 h a 22 ° C e h 16 scuro a 18 ° C per 2 settimane.</li>
	<li>Trapiantare le piantine di simili dimensioni singolarmente in vasi di diametro 4" contenente il terreno e crescere per un ulteriore 3 settimane nelle stesse condizioni descritte al punto 1.1. Nota: Acqua piante con acqua del rubinetto due volte a settimana per mantenere il terreno umido.</li>
</ol>2. preparazione di stomi arricchiti
<ol><li>Rimuovere le foglie delle piante di a. thaliana 5 - settimana-vecchi individuali con un bisturi.</li>
	<li>Collegare ogni foglia a due pezzi di nastro adesivo Scotch trasparente, con un unico pezzo aderendo al lato abbagliai (inferiore) e l'altro pezzo aderendo al lato adassiale (superiore) della foglia. Lasciare il nastro sulla foglia per 5 s.</li>
	<li>Delicato peeling apart i due pezzi di nastri utilizzando il dito indice e il pollice di ogni mano per separare il lato abbagliai con pavimentazione e cellule di guardia e il lato adassiale con cellule del mesofillo.</li>
	<li>Posto le bucce dal lato abbagliai delle foglie in 60 mL di stomi apertura del buffer (50 mM KCl, 10mm MES-KOH, regolata a pH 6.2 con 1m KOH) in dimensioni 40 mm × 12 mm Petri piatti come sono stati raccolti.<ol>
<li>Ripetere i passaggi precedenti fino a quando tutte le bucce di esempio vengono raccolti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posizionare le capsule di Petri contenente le bucce nella camera di crescita in condizioni di luce indicato al punto 1.1. Lasciare le bucce sotto la luce per 2 h aprire completamente gli stomi.</li>
	<li>Bucce di posto in un 150 mm x 20 mm di Petri contenente 50 mL di parete cellulare digerendo miscela di enzimi (0,7% cellulasi R-10, 0.025% macerozyme R-10, 0,1% (p/v) polivinilpirrolidone-40 e albumina di siero bovino di 0.25% (p/v) in soluzione basica di 55% (sorbitolo 0,55 M, 0.5 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, acido ascorbico 0,5 mM, 10 µM KH2PO4, 5mm 4-morpholineethanesulfonic acido (MES) a pH 5.7 regolato con 1m KOH).</li>
	<li>Agitare le bucce su un agitatore reciproco in una capsula di Petri a 50 rpm per 20 min.</li>
	<li>Rimuovere bucce da enzima soluzione con una pinzetta dopo 20 min. trasferire le bucce a una dimensione 150 x 20 mm piastra Petri contenente 50 mL di acqua.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta di trasferimento, sciacquare bucce per 15 s due volte con 10 mL di acqua per rimuovere qualsiasi soluzione enzimatica residua.</li>
	<li>Utilizzare una pinzetta per posizionare le bucce in una capsula di Petri dimensioni 150 x 20 mm con 50 mL di stomi freschi apertura del buffer come utilizzata nel passaggio 2.4. Incubare per 1 h in condizioni di luce indicato nel passaggio 1.1 per consentire gli stomi recuperare.</li>
</ol>3. l'acido abscissico (ABA) trattamento e analisi del movimento di stomi
<ol><li>In una capsula Petri dimensioni 150 x 20 mm. Incubare le bucce di stomi arricchito a 30° C per 15 min in 50 mL di tampone apertura stomatica o in 50 mL di tampone apertura stomatica con una concentrazione finale di 10 µM ABA per il tempo di trattamento appropriato.</li>
	<li>Bucce di posto su un agitatore a 50 giri/min per 5, 15 e 30 min. Dopo ogni intervallo di tempo rimuovere una buccia con le pinzette e seguire la procedura di imaging in fase 3.3.</li>
	<li>Acquisire le immagini degli stomi prima del trattamento ABA e nei vari punti di tempo dopo il trattamento ABA con un microscopio ottico.<ol>
<li>Prendete una buccia e posto su un vetrino per microscopio.</li>
		<li>Porre il vetrino sul palco di microscopio e regolare la fase, in modo che l'immagine della buccia può essere visualizzato.</li>
		<li>Regolare la multa e messa a fuoco il microscopio per ottenere un'immagine chiara delle cellule guardia del corso.</li>
		<li>Prendere diverse immagini di multipli stomi a 40 ingrandimenti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Misura 60 aperture stomatica usando ImageJ8.</li>
	<li>Calcolare l'errore standard e il significato a un valore di p < 0,05 di 60 misurazioni di apertura stomatica.</li>
</ol>4. proteine estrazione e separazione di SDS-Page
<ol><li>Macinare le bucce per 15 s in abbastanza azoto liquido per coprire le bucce con un refrigerate mortaio e pestello.</li>
	<li>Per ogni 50 bucce, aggiungere 3 mL di fenolo saturato di Tris (pH 8,8) e 3 mL di tampone di estrazione della proteina (0,9 M saccarosio, 0.1 M Tris-HCl, EDTA 0,01 M, 0,4% 2-mercaptoetanolo, 10 µ l di inibitore di proteasi e fosfatasi 1 mM) con una pipetta nel mortaio e poi macinare le bucce per addi 5 minuti di tradizionali in una cappa aspirante.</li>
	<li>L'estratto usando una pipetta di trasferimento e le bucce con pinzette metalliche per un Oakridge tubo centrifugo e agitano su un agitatore a 50 giri/min per 1 h a 4 ° C.</li>
	<li>Rimuovere le bucce dal tubo Oakridge centrifuga e centrifugare l'estratto a 5.000 x g per 10 min. Quindi trasferire la fase fenolica superiore ad un nuovo tubo pulito micro-centrifuga usando una pipetta.</li>
	<li>Precipitato il fenolo estratte proteine aggiungendo 5 volumi di acetato di ammonio 0.1 M ghiacciata in metanolo al 100%. Vortex brevemente e incubare per una notte a-20 ° C.</li>
	<li>Centrifugare a 20.000 x g a 4 ° C per 20 min, decantare il supernatante versando lentamente fuori dal tubo e conservare il pellet di proteina nel tubo.</li>
	<li>Lavare la pallina di proteine due volte con acetato di ammonio 0.1 M in metanolo e poi due volte con 80% di acetone e una volta con 100% di acetone freddo. Nota: Lavaggi sono fatto aggiungendo 10 mL di reagente specificato al tubo della proteina. Agitare su un agitatore a 50 rpm per 5 min, seguita da centrifugazione a 15.000 x g a 4 ° C per 10 min. Poi versare il reagente fuori dal tubo mantenendo solo il pellet di proteina.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di acetone freddo 100% per il pellet e risospendere pipettando lentamente su e giù.</li>
	<li>Sospensione della proteina di trasferimento tramite pipetta a una micro-centrifuga 2 mL poi Centrifugare a 20.000 x g a 4 ° C per 5 min.</li>
	<li>Rimuovere l'acetone di decantazione e dal tubo e asciugare il pellet in cappa per 10 min.</li>
	<li>Sciogliere la proteina in una provetta da micro-centrifuga con 200 µ l di tampone di dissoluzione (8m urea, 0,5% SDS, 30 mM Tris-HCl a pH 8,5) e vortex per 30 min. centrifuga a 20.000 x g a 15 ° C per 20 min e raccogliere il surnatante in un nuovo tubo.</li>
	<li>Quantificare la concentrazione nella proteina seguendo il protocollo di quantificazione della proteina9.</li>
	<li>Utilizzare campioni della proteina per la separazione delle proteine mediante elettroforesi in gel seguendo il protocollo n.10.</li>
</ol>

<ol><li>Acharya, B., Assmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone+interactions+in+stomatal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hormone interactions in stomatal function.</a> Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).</li>
<li>Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. <a target="_blank" href="https://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.arplant.52.1.627">Guard cell signal transduction.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).</li>
<li>Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guard+Cell+Purification+and+RNA+Isolation+Suitable+for+High-Throughput+Transcriptional+Analysis+of+Cell-Type+Responses+to+Biotic+Stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).</li>
<li>Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1046/j.0028-646X.2001.00329.x">Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts.</a> New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).</li>
<li>Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+Dependence+Of+K%2B+Channels+In+Guard-Cell+Protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).</li>
<li>Wu, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tape-Arabidopsis+Sandwich+-+a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant Methods. 5, 10(2009).</li>
<li>Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+targeting+of+proteins+in+Arabidopsis+leaf+mesophyll%2C+epidermal+and+vascular+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 6, (2015).</li>
<li>Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Agnew, B., Murray, D., Patton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+solid-phase+fluorescence-based+protein+assay+for+quantitation+of+protein+electrophoresis+samples+containing+detergents%2C+chaotropes%2C+dyes%2C+and+reducing+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).</li>
<li>He, F. <a target="_blank" href="https://bio-protocol.org/bio101/e80">Laemmli-SDS-PAGE.</a> Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).</li>
<li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac0262560">Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895).</a> Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).</li>
<li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+labeling+by+iTRAQ%3A+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li>
</ol>

Conflitti di interesse non dichiarati.

Cellule di guardia sono un sistema modello per studiare i meccanismi di trasduzione del segnale nelle piante ed è importante garantire che la preparazione dei campioni utilizzati nello studio è il più appropriato per rispondere alle domande biologiche. Nonostante il crescente interesse in cellule di guardia all'interno della comunità di ricerca di pianta, non esiste un metodo universale su come preparare stomatica cellule di guardia che permettesse sia il movimento stomatica e fisiologia così come i cambiamenti molecolar...

Gli stomi giocano un ruolo importante nella fisiologia complessiva e fitness delle piante. Queste strutture specifiche di pianta molto piccola sono formate da due cellule epidermiche specializzate, conosciute come cellule di guardia e si trovano più abbondantemente sulla superficie abbagliai delle foglie. Gli stomi sono necessari per lo scambio di gas tra la pianta e l'atmosfera, nonché il controllo della perdita di acqua attraverso la traspirazione. Cellule di guardia regolare apertura stomi attraverso l'integrazione di diversi esterni (ad es., luce, umidità, contatto agente patogeno, livelli di anidride carbonica) e interni (ad es., ormoni endogeni) stimoli1,2. Negli ultimi 20 anni, questo tipo di cella è diventato un sistema modello per studiare i processi negli impianti di segnalazione delle cellule. Queste cellule costituiscono una piccola frazione delle cellule totali in una foglia; così, per studiare il loro cellulare unico, proprietà biochimiche e molecolari in maniera singola cellula, è necessario isolarli dagli altri tipi di cella foglia. In passato, gli studi delle cellule di guardia hanno coinvolto spesso la preparazione di cellule di guardia protoplasti (GCP)3,4,5. Questo in genere richiede l'utilizzo di grandi quantità di enzimi degradanti della parete cellulare e/o rottura meccanica tramite fusione e ha dimostrato di essere costoso e richiede tempo, come in genere occorrono molte ore per preparare un campione GCP, spesso volte con poca resa. Ancora più importante, poiché le cellule di guardia fungono da coppie complete di regolare apertura stomi, l'uso di GCP può essere visto come un sistema artificiale per studiare segnalazione delle cellule di guardia.
Qui, abbiamo sviluppato un metodo per preparare gli stomi in cui cellule intatte di guardia sono arricchite e mantenere risposte fisiologiche agli stimoli. Questo metodo è stato ispirato da un metodo che è stato usato per isolare mesofillo cellula protoplasti6,7. Nel nostro metodo, gli stomi sono preparati utilizzando chiaro nastro Scotch per separare prima la maggioranza delle cellule del mesofillo attaccato allo strato adassiale della foglia dallo strato abbagliai contenente la pavimentazione e le cellule di guardia. Questo viene fatto da un pezzo di nastro per ogni lato della foglia di apposizione e sbucciarle apart. Le cellule dallo strato abbagliai sono ammessi per recuperare sotto la luce in un buffer di stomi-apertura. Successivamente le cellule restanti di pavimentazione vengono rimossi utilizzando una piccola quantità di parete cellulare, enzimi, lasciando dietro di sé delle cellule di guardia che si arricchiscono sul nastro degradativi.
In questo semplice metodo, stomatica cellule di guardia sia valide e reattivo può rapidamente e in modo efficiente preparatevi, prendere meno di un'ora per ottenere cellule di guardia stomatica arricchite da 50 bucce con un costo minimo. Il metodo qui impone meno danni per le cellule della pianta rispetto ai metodi precedenti dove sono preparati i protoplasti. Inoltre, materiali raccolti da questa quantità di proteina auspicabile resa metodo. La cosa più importante, perché la foglia non è sottoposto a fusione o tempi di digestione lunga e cellule di guardia rimangono intatte, i risultati degli studi sarà più strettamente pertinenti a quella di biologia naturale di una cella di guardia. Con questo metodo, stomatici movimenti possono essere correlati in tempo reale con i cambiamenti a livello molecolare. Così, le conoscenze acquisite dagli studi utilizzando questo metodo di preparazione sarebbe importante per una comprensione più completa di segnalazione delle cellule di guardia.
Abbiamo usato la pianta Arabidopsis thaliana come modello; Tuttavia questo protocollo può essere applicato all'arricchimento delle cellule di guardia stomatica in altre specie di piante quali Brassica napus con piccole modifiche nel tempo di digestione. Come un proof of concept, abbiamo dimostrato che cellule di guardia stomatica arricchite tramite questo metodo sono vitali e sensible a reagire agli stimoli come mostrato dalla fluoresceina diacetato (FDA) analisi e studi che utilizzano l'ormone vegetale l'acido abscissico (ABA), rispettivamente. Inoltre, abbiamo dimostrato che le proteine di alta qualità possono essere isolate da queste cellule di guardia. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato di questo processo.

Piuma chirurgica del <table><tbody><tr><td>bisturi in acciaio inossidabile</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp; </td><td></td>NC9999403</tr><tr><td>Scotch Tape (3M)</td><td>ULINE</td><td>S-9781</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR455701</td><td></td></tr><tr><td>Cellulasi (Onozuka R-10)&nbsp;</td><td>Fornitore verificato - Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td><td>21560003-3</td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme R-10</td><td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td><td>21560003-4</td><td></td></tr><tr><td>DM6000B Microscopio&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di Inibitori della Proteasi e della Fosfatasi</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>&nbsp; </td><td></td>PI78443</tr><tr><td>Oak Ridge Provette per centrifuga PPCO ad alta velocità</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3119-0030</td><td></td></tr><tr><td>Kit di quantificazione delle proteine EZQ</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R33200</td><td></td></tr><tr><td>Diacetato di fluoresceina (FDA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F1303</td><td></td></tr><tr><td>Acido abscissico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4906</td><td></td></tr><tr><td>Metro Mix 500</td><td>BWI Aziende&nbsp;</td><td>TX-500</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Tampone per campioni</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Safe Comassie (G-250)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0786</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga (2mL)</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>dell'Istituto Nazionale di Sanità</td><td></td><td></td>del software</tr><tr><td>ImageJ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4017-1EA</td><td></td></tr><tr><td>12% Mini-PROTEAN TGX Gel prefabbricato</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1043</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr></tbody></table>

gli stomi nastro-peel: un metodo migliore per la preparazione del campione di cellule di guardia

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

Lo studio delle cellule di guardia è essenziale per la conoscenza dei contributi specifici di questo tipo di cella alla funzione generale delle piante. Tuttavia, è spesso difficile isolare e così loro studio spesso rappresenta una sfida.
Questo studio stabilisce un metodo di arricchimento stomatica delle cellule di guardia. Il protocollo utilizza nastro Scotch per isolare cellule di guardia ed estrarre le proteine dalle cellule. Questo metodo migliora l'integrità e il rendimento della cella di guardia durante l'isolamento e fornisce un campione affidabile per lo studio dei processi di segnalazione delle cellule e come essi correlare ai fenotipi movimento stomatica. In questo metodo, le foglie delle piante erano divise tra i due porzioni di nastro e pelate a pezzi per rimuovere il lato abbagliai. Questo protocollo è stato applicato al tessuto di foglia di Arabidopsis per isolare cellule di guardia. Le cellule sono state trattate con diacetato di fluoresceina (FDA) per determinare la vitalità e l'acido abscissico (ABA) per valutare il movimento di stomi in risposta all'ABA. In conclusione, il presente protocollo si rivela utile per la preparazione di cellule di guardia stomatica arricchite e isolare proteine. La qualità delle cellule e proteine ottenute qui enable fisiologico e altri studi biologici.

Un'immagine rappresentativa di Arabidopsis cellule di guardia prima e dopo la digestione del mesofillo e cellule epidermiche è illustrata nella Figura 1. Attuabilità delle cellule di guardia prima e dopo la rimozione del mesofillo e cellule epidermiche possono essere osservate utilizzando FDA per misurare l'attività enzimatica e l'integrità della membrana delle cellule (Figura 1B e 1D). La fi...

Questo protocollo descrive un metodo di preparazione arricchite stomatica cellule di guardia che è utile per gli studi biologici fisiologici e altri.

Gli stomi nastro-Peel: Un metodo migliore per la preparazione del campione di cellule di guardia

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di preparare cellule di guardia di stomi arricchiti di alta qualità per analisi fisiologiche, biochimiche e molecolari, come la trascrittomica, la proteomica e la metabolomica. Ciao, mi chiamo Sheldon Lawrence. Sono uno studente laureato nel laboratorio del Dr.Chen presso il Dipartimento di Biologia dell'Università della Florida.Oggi ti mostrerò come isolare le cellule di guardia dal tessuto fogliare delle piante che sono materiale utile per studiare sia la fisiologia che la biologia degli stomi. Questo metodo è considerato un nuovo metodo per isolare le celle di guardia. Consente specificamente l'arricchimento di cellule di guardia intatte e fornisce campioni affidabili per lo studio dei processi di segnalazione delle cellule degli stomi.L'applicazione di questo metodo può estendersi alle piante di Brassicaceae e ad altre specie vegetali con solo piccole modifiche al protocollo. La dimostrazione è importante in quanto il passo principale per arricchire le celle di guardia può rivelarsi impegnativo. Per iniziare, seleziona piante mature di Arabidopsis di cinque settimane.Rimuovere con cura una foglia con un bisturi, tagliando la foglia alla base. Prendi due pezzi di scotch e metti la foglia asportata tra di loro. Applicare delicatamente una pressione su entrambi i lati assicurandosi che l'estremità dei pezzi di nastro non aderisca.Questo può essere fatto inserendo un dito tra di loro. Rimuovi delicatamente i due pezzi di nastro adesivo l'uno dall'altro e fai galleggiare immediatamente la buccia prelevata dal lato aassiale della foglia nel tampone di apertura degli stomi. Dopo che tutte le bucce sono state raccolte, metterle alla luce.Lasciateli lì per due ore. Prelevare diversi peeling e posizionarli su vetrini da microscopio. Utilizzando un microscopio ottico, regolare le lenti per visualizzare le celle di protezione e assicurarsi che siano aperte.Mettere le bucce in 50 ml di soluzione enzimatica per la digestione della parete cellulare. Galleggiare e incubare a 26 gradi Celsius. Dopo 20 minuti, rimuovere le bucce dalla soluzione enzimatica e sciacquare brevemente due volte con acqua deionizzata e metterle nel tampone di apertura degli stomi freschi.Macinare le bucce in un mortaio con azoto liquido, con un pestello. Quindi eseguire l'estrazione del fenolo come descritto nel testo. Dopo aver macinato le bucce in un mortaio con un pestello, trasferire l'estratto, insieme alle bucce, in una provetta da centrifuga Oak Ridge, e agitare su uno shaker per un'ora a quattro gradi Celsius.Precipitare le proteine estratte dal fenolo aggiungendo cinque volumi di acetato di ammonio ghiacciato da 0,1 mol in metanolo al 100%. Dopo aver fatto precipitare la proteina per una notte a 20 gradi Celsius, raccogliere la proteina mediante centrifugazione ed eseguire i lavaggi dei pellet come descritto nel testo. Risospendere il pellet in un millilitro di acetone freddo e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga da due millilitri.Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante di acetone e asciugare il pellet per dieci minuti. Sciogliere il campione proteico in un tampone di dissoluzione. Dopo il vortice e la centrifugazione, raccogliere il surnatante e misurare la concentrazione proteica.Esegui un gel SDS-PAGE. Visualizza le bande proteiche separate e osserva la qualità relativa delle proteine. Questa è un'immagine rappresentativa delle cellule di guardia dell'Arabidopsis prima e dopo la digestione enzimatica del mesofillo e delle cellule epidermiche.La vitalità delle cellule di guardia prima e dopo la rimozione del mesofillo e delle cellule epidermiche può essere osservata utilizzando il diacetato di fluoresceina, che misura l'attività enzimatica e l'integrità della membrana cellulare. Come puoi vedere, le cellule di guardia sono ancora vitali dopo il peeling e la digestione enzimatica. Questo esempio illustra il movimento degli stomi di Arabidopsis in risposta al trattamento con ABA.Le cellule di guardia rispondono al trattamento e l'apertura degli stomi diminuisce di oltre il 50% dopo 30 minuti di trattamento con ABA. Ecco un corso temporale del movimento degli stomi. Inoltre, viene mostrata un'immagine rappresentativa dell'apertura degli stomi in ogni punto temporale.Il rilevamento, la separazione e l'abbondanza relativa delle proteine sono osservati da SDS-PAGE. Le bande sono chiare e distinte. Sono incluse quattro repliche biologiche per enfatizzare la riproducibilità dell'estrazione delle proteine da questo metodo.Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo cercato di correlare i cambiamenti molecolari delle cellule di guardia in tempo reale con il movimento degli stomi. Una volta padroneggiato, un campione proteico da cellule di guardia degli stomi può essere preparato in poche ore e può essere utilizzato in più esperimenti. È importante ricordare di non infliggere una grande quantità di danni alle celle di guardia durante la sbucciatura e la manipolazione.Seguendo questo metodo, altre tecniche possono essere applicate per studiare la segnalazione delle cellule di guardia, come la marcatura isobarica per studiare la risposta redux delle proteine nelle piante in condizioni normali e di stress. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare e arricchire le cellule di guardia intatte e vitali, nonché estrarre proteine di alta qualità appropriate per gli studi a valle.

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L'orologio circadiano regola circa un terzo del trascrittoma di Arabidopsis, ma la percentuale di geni che alimentano di nuovo nel cronometraggio rimane sconosciuto. Qui visualizziamo un metodo per valutare rapidamente fenotipi circadiani in qualsiasi linea mutante di Arabidopsis utilizzando immagini luminescenti di un reporter circadiano transitoriamente espresso in protoplasti.

Analisi Rapida di fenotipi circadiani in Arabidopsis protoplasti transfettate con un luminescenti Clock Reporter

I metodi esistenti per la modifica delle piante hanno un'applicabilità limitata. La nuova tecnologia derivata dai peptidi qui proposta promette semplicità ed efficienza nell'introduzione di proteine o geni esogeni nei compartimenti intracellulari desiderati di piante intatte.

Peptide di derivazione Metodo di Trasporto geni e proteine ​​Attraverso cellulari e barriere organelli in Piante

Qui presentiamo un protocollo di cattura di interazione applicato ai protoplasti a foglia di Arabidopsis thaliana . Questo metodo si basa fondamentalmente sulla creazione di reticolazione UV in vivo e consente l'isolamento e l'identificazione delle proteine ​​legate alla mRNA da un ambiente fisiologico.

Cattura di Interactome mRNA da protoplasti vegetali

In questo protocollo, abbiamo descritte le tecniche per la corretta dissezione di Arabidopsis fiori e silique, alcune tecniche di base di schiarimento e selezionato le procedure per intero-monta le osservazioni delle strutture riproduttive di colorazione.

Intero-monta schiarimento e colorazione delle silique e organi del fiore di Arabidopsis

L'obiettivo del presente protocollo è illustrare come indurre cluster stomi nei cotiledoni di Arabidopsis thaliana piantine dal trattamento ad immersione con una soluzione di media contenenti zucchero e come osservare strutture intracellulari quali cloroplasti e microtubuli nelle cellule di guardia in cluster utilizzando confocale microscopia laser.

Un sistema di induzione per cluster stomi da trattamento di immersione di soluzione di zucchero nei semenzali di Arabidopsis thaliana

Questo articolo descrive due metodi di fenotipizzazione senza l'uso di peeling epidermici per caratterizzare i geni che controllano lo sviluppo stomatico. Il primo metodo dimostra come analizzare un fenotipo stomatico utilizzando un'epidermide vegetale colorata con O-colorata con toluidina blu. Il secondo metodo descrive come identificare i ligandi stomatici e monitorare le loro attività biologiche.

Identificazione dei geni coinvolti nello sviluppo stomatale tramite punteggio del fenotipo epidermico

Qui, presentiamo un metodo semplice per l'osservazione diretta e la misurazione automatizzata delle risposte stomatiche all'invasione batterica in Arabidopsis thaliana. Questo metodo sfrutta un dispositivo di imaging stomatico portatile, insieme a una pipeline di analisi delle immagini progettata per le immagini delle foglie catturate dal dispositivo.

Osservazione diretta e misurazione automatizzata delle risposte stomatiche a Pseudomonas syringae pv. pomodoro DC3000 in Arabidopsis thaliana

Questo protocollo presenta un metodo comparativo per valutare i tratti stomatici ed epidermici in due specie distinte utilizzando peeling epidermici, tecniche di clearing e analisi delle immagini assistite dall'IA. L'obiettivo è permettere la quantificazione ad alta produttività e riproducibile delle strutture cellulari alla base della funzione stomatica per applicazioni agricole e ricerche vegetali su larga scala.

Caratterizzazione dei tratti stomatici ed epidermici tramite peel, clearing e analisi delle immagini basate su IA

Impara a isolare cellule di guardia intatte dal tessuto fogliare per studi fisiologici e biochimici. Questo metodo migliora l'arricchimento cellulare e fornisce campioni affidabili per analisi molecolari.

Gli stomi nastro-Peel: Un metodo migliore per la preparazione del campione di cellule di guardia

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