Gli stomi nastro-Peel: Un metodo migliore per la preparazione del campione di cellule di guardia
15 luglio 2018
Questo protocollo descrive un metodo di preparazione arricchite stomatica cellule di guardia che è utile per gli studi biologici fisiologici e altri.
L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di preparare cellule di guardia di stomi arricchiti di alta qualità per analisi fisiologiche, biochimiche e molecolari, come la trascrittomica, la proteomica e la metabolomica. Ciao, mi chiamo Sheldon Lawrence. Sono uno studente laureato nel laboratorio del Dr.Chen presso il Dipartimento di Biologia dell'Università della Florida.
Oggi ti mostrerò come isolare le cellule di guardia dal tessuto fogliare delle piante che sono materiale utile per studiare sia la fisiologia che la biologia degli stomi. Questo metodo è considerato un nuovo metodo per isolare le celle di guardia. Consente specificamente l'arricchimento di cellule di guardia intatte e fornisce campioni affidabili per lo studio dei processi di segnalazione delle cellule degli stomi.
L'applicazione di questo metodo può estendersi alle piante di Brassicaceae e ad altre specie vegetali con solo piccole modifiche al protocollo. La dimostrazione è importante in quanto il passo principale per arricchire le celle di guardia può rivelarsi impegnativo. Per iniziare, seleziona piante mature di Arabidopsis di cinque settimane.
Rimuovere con cura una foglia con un bisturi, tagliando la foglia alla base. Prendi due pezzi di scotch e metti la foglia asportata tra di loro. Applicare delicatamente una pressione su entrambi i lati assicurandosi che l'estremità dei pezzi di nastro non aderisca.
Questo può essere fatto inserendo un dito tra di loro. Rimuovi delicatamente i due pezzi di nastro adesivo l'uno dall'altro e fai galleggiare immediatamente la buccia prelevata dal lato aassiale della foglia nel tampone di apertura degli stomi. Dopo che tutte le bucce sono state raccolte, metterle alla luce.
Lasciateli lì per due ore. Prelevare diversi peeling e posizionarli su vetrini da microscopio. Utilizzando un microscopio ottico, regolare le lenti per visualizzare le celle di protezione e assicurarsi che siano aperte.
Mettere le bucce in 50 ml di soluzione enzimatica per la digestione della parete cellulare. Galleggiare e incubare a 26 gradi Celsius. Dopo 20 minuti, rimuovere le bucce dalla soluzione enzimatica e sciacquare brevemente due volte con acqua deionizzata e metterle nel tampone di apertura degli stomi freschi.
Macinare le bucce in un mortaio con azoto liquido, con un pestello. Quindi eseguire l'estrazione del fenolo come descritto nel testo. Dopo aver macinato le bucce in un mortaio con un pestello, trasferire l'estratto, insieme alle bucce, in una provetta da centrifuga Oak Ridge, e agitare su uno shaker per un'ora a quattro gradi Celsius.
Precipitare le proteine estratte dal fenolo aggiungendo cinque volumi di acetato di ammonio ghiacciato da 0,1 mol in metanolo al 100%. Dopo aver fatto precipitare la proteina per una notte a 20 gradi Celsius, raccogliere la proteina mediante centrifugazione ed eseguire i lavaggi dei pellet come descritto nel testo. Risospendere il pellet in un millilitro di acetone freddo e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga da due millilitri.
Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante di acetone e asciugare il pellet per dieci minuti. Sciogliere il campione proteico in un tampone di dissoluzione. Dopo il vortice e la centrifugazione, raccogliere il surnatante e misurare la concentrazione proteica.
Esegui un gel SDS-PAGE. Visualizza le bande proteiche separate e osserva la qualità relativa delle proteine. Questa è un'immagine rappresentativa delle cellule di guardia dell'Arabidopsis prima e dopo la digestione enzimatica del mesofillo e delle cellule epidermiche.
La vitalità delle cellule di guardia prima e dopo la rimozione del mesofillo e delle cellule epidermiche può essere osservata utilizzando il diacetato di fluoresceina, che misura l'attività enzimatica e l'integrità della membrana cellulare. Come puoi vedere, le cellule di guardia sono ancora vitali dopo il peeling e la digestione enzimatica. Questo esempio illustra il movimento degli stomi di Arabidopsis in risposta al trattamento con ABA.
Le cellule di guardia rispondono al trattamento e l'apertura degli stomi diminuisce di oltre il 50% dopo 30 minuti di trattamento con ABA. Ecco un corso temporale del movimento degli stomi. Inoltre, viene mostrata un'immagine rappresentativa dell'apertura degli stomi in ogni punto temporale.
Il rilevamento, la separazione e l'abbondanza relativa delle proteine sono osservati da SDS-PAGE. Le bande sono chiare e distinte. Sono incluse quattro repliche biologiche per enfatizzare la riproducibilità dell'estrazione delle proteine da questo metodo.
Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo cercato di correlare i cambiamenti molecolari delle cellule di guardia in tempo reale con il movimento degli stomi. Una volta padroneggiato, un campione proteico da cellule di guardia degli stomi può essere preparato in poche ore e può essere utilizzato in più esperimenti. È importante ricordare di non infliggere una grande quantità di danni alle celle di guardia durante la sbucciatura e la manipolazione.
Seguendo questo metodo, altre tecniche possono essere applicate per studiare la segnalazione delle cellule di guardia, come la marcatura isobarica per studiare la risposta redux delle proteine nelle piante in condizioni normali e di stress. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare e arricchire le cellule di guardia intatte e vitali, nonché estrarre proteine di alta qualità appropriate per gli studi a valle.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo innovativo per isolare ed arricchire cellule di guardia stomatali integre a partire dal tessuto fogliare delle piante. Queste cellule di guardia arricchite sono preziose per analisi fisiologiche, biochimiche e molecolari, inclusi studi sui processi di segnalazione cellulare negli stomi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Fisiologia vegetale
- Biologia cellulare
- Analisi biochimica
Sfondo
- Le cellule di guardia svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione degli scambi gassosi nelle piante.
- Comprendere la funzione delle cellule di guardia è essenziale per lo studio delle risposte delle piante ai cambiamenti ambientali.
- I metodi attuali per l'isolamento delle cellule di guardia potrebbero non produrre campioni di alta qualità.
- Questo protocollo mira a migliorare il processo di isolamento per ottenere risultati di ricerca migliori.
Scopo dello studio
- Per preparare cellule di guardia stomatali arricchite di alta qualità.
- Per facilitare studi fisiologici e biochimici degli stomi.
- Per fornire campioni affidabili per diverse analisi biologiche.
Metodi Utilizzati
- Isolamento delle cellule di guardia dal tessuto fogliare della pianta.
- Arricchimento delle cellule di guardia integre per l'analisi.
- Applicazione di tecniche innovative per migliorare la qualità del campione.
- Preparazione per studi transcriptomici, proteomici e metabolomici.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di cellule di guardia di alta qualità.
- Maggiore affidabilità dei campioni per studi fisiologici.
- Migliore comprensione dei processi di segnalazione stomatica.
- Potenziale per applicazioni più ampie nella ricerca in biologia vegetale.
Conclusioni
- Questo metodo rappresenta un notevole progresso nell'isolamento delle cellule di guardia.
- Le cellule di guardia arricchite possono portare a nuove intuizioni nella fisiologia vegetale.
- Studi futuri potranno sfruttare questo protocollo per svariate analisi biologiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo affronta la sfida dell'isolamento di cellule di guardia vegetali integre per l'analisi molecolare, consentendo un'estrazione affidabile delle proteine e la valutazione della vitalità. Supporta la riduzione del rischio meccanicistica nella validazione degli obiettivi fornendo campioni arricchiti per lo studio delle vie di segnalazione associate al movimento stomatrico. L'approccio migliora la sicurezza predittiva nei modelli preclinici producendo dati biochimici riproducibili da sistemi vegetali fisiologicamente rilevanti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'analisi dei meccanismi di segnalazione nelle cellule di guardia mediante campioni proteici arricchiti.
- Valore operativo: Consente l'isolamento affidabile di cellule di guardia integre utilizzando materiali facilmente reperibili, come il nastro adesivo Scotch.
- Valore scientifico: Supporta la validazione funzionale di bersagli coinvolti nella risposta stomatica all'acido abscissico (ABA).
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera output quantitativi di proteine mediante SDS-PAGE per l'analisi comparativa tra diverse condizioni.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità del campione con quattro repliche biologiche illustrate nel protocollo.
- Valore scientifico: Favorisce la standardizzazione del saggio attraverso un arricchimento costante delle cellule di guardia e la misurazione della vitalità mediante diacetato di fluoresceina (FDA).
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega le modifiche molecolari nelle cellule di guardia agli esiti fenotipici del movimento stomatico in seguito a trattamento con ABA.
- Valore operativo: Consente l'analisi in corso temporale della riduzione dell'apertura stomatica (>50% dopo 30 minuti di ABA) per il profilo cinetico.
- Valore scientifico: Supporta la modellizzazione di sistemi rilevanti per le malattie collegando il segnale cellulare alle risposte fisiologiche in Arabidopsis.
Pipeline e integrazione del flusso di lavoro
Il metodo si inserisce nei flussi di lavoro delle prime fasi di scoperta, supportando la validazione del bersaglio attraverso l'analisi biochimica delle cellule guardiane arricchite, prima delle fasi di identificazione dei composti promettenti.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui percorsi di segnalazione delle cellule di guardia mediante estrazione proteica e saggi di vitalità.
- Screening: Fornisce campioni proteici riproducibili adatti ad applicazioni proteomiche successive, come l'etichettatura isobarica.
- Analisi: Permette la misurazione quantitativa dell'abbondanza proteica e della chiarezza della separazione tramite visualizzazione di gel SDS-PAGE.
- Ricerca traslazionale: Collega i dati molecolari ai fenotipi di movimento degli stomi, promuovendo la continuità preclinica nei modelli di risposta allo stress nelle piante.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una tecnica scalabile ed economica per l'arricchimento ripetuto delle cellule di guardia in diversi esperimenti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica negli studi sulla segnalazione delle cellule di guardia.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la riproducibilità grazie a semplici passaggi di distacco con nastro e digestione enzimatica.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione nella validazione degli obiettivi fornendo letture biochimiche affidabili.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio degli obiettivi in base alle risposte funzionali delle cellule di guardia a stimoli come l'ABA.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione dei tessuti vegetali e nella visualizzazione microscopica delle cellule di guardia.
- Necessita di attrezzature di laboratorio standard, tra cui centrifuga, mortaio e pestello, e apparecchiatura per elettroforesi SDS-PAGE.
- Richiede coerenza tra i diversi gruppi di lavoro riguardo ai tempi di raccolta delle lamine epidermiche e alle condizioni di incubazione enzimatica.
- Comporta considerazioni di adattamento per specie vegetali diverse da Arabidopsis, come indicato per le Brassicaceae.
- Include limitazioni pratiche, come evitare danni eccessivi durante il prelievo della lamina per mantenere l'integrità cellulare.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:02
Title
1:19
Preparation of Enriched Stomata
3:14
Protein Extraction and SDS-PAGE Separation
6:14
Results: Stomata Tape-Peel Allows for the Preparation of High Quality Enriched Stomata Suitable for Conducting Physiological, Biochemical and Molecular Assays
7:38
Conclusion
