Name: Usando i Oocytes del Mouse per valutare la funzione del Gene umano durante la meiosi I (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Scopri come valutare la funzione del gene umano durante la meiosi I utilizzando ovociti di topo. Questo metodo permette di studiare le predisposizioni genetiche all'aneuploidia materna in modo rapido e riproducibile.

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Questo lavoro è stato supportato da un Grant di ricerca della American Society for Reproductive Medicine e da Charles e Johanna Busch Memorial Fund presso la Rutgers, The State University di NJ per K.S. A.L.N. era sostenuta da una sovvenzione del N.I.H. (F31 HD0989597).

1. molecolare clonazione
<ol><li>Ottenere la figura intera sequenza di codificazione del gene di interesse e la trascrizione in vitro plasmide (pIVT) vector11. Nota: Cloni di cDNA integrale sono disponibili in commercio da vari fornitori o possono essere generati tramite reazione a catena della polimerasi d'inversione della trascrizione (RT-PCR). Centro nazionale per la risorsa online Biotechnology Information (NCBI) fornisce sequenze di trascrizione per i geni dal Nucleotide e sequenza espressa contrassegnati database (EST). Per facilità di proteina nella strategia di clonazione si potrebbe desiderare la visualizzazione e l'analisi dei livelli di espressione, fusione di proteina fluorescente verde (Gfp) o un altro tag fluorescente adatto.</li>
	<li>Utilizzando una strategia di clonazione convalidata, inserire la sequenza di codificazione del gene di interesse della regione di clonazione più di pIVT. Una descrizione dettagliata della clonazione molecolare e i passaggi necessari sono stati precedentemente descritto 12. Nota: Se un prodotto di fusione del gene deve essere generato, essere sicuri che la clonazione è nel telaio della lettura corretta.</li>
	<li>Sequenza del costrutto utilizzando primers globina affinché il gene corretto inserimento, corretto in-struttura fusion, e che nessuna mutazione di punto della polimerasi-indotto sono stata creata. Nota: Se l'attrezzatura di sequenziamento Sanger DNA non è disponibile, molte aziende offrono opzioni di sequenziamento del DNA a basso costo.</li>
	<li>Mutagenizzare DNA se generando polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) o inserzioni/delezioni (INDELS). Mutagenesi di DNA è descritto in passaggi 1.5-1.7 sotto. Per i costrutti di tipo selvatico, procedere con il passo di linearizzazione 1.7.</li>
	<li>Disegnare primers di mutagenesi e completare la reazione di PCR di mutagenesi per generare la costruzione del mutante secondo il protocollo del produttore. PCR-mediata di mutagenesi sito-diretta è stato descritto in precedenza 13. Inoltre, molte aziende offrono kit di mutagenesi sito-diretta, che comprendono protocolli.</li>
	<li>Trasformare mutagenized DNA batterico host. Isolare e purificare il plasmide. Nota: Molte aziende fanno kit che può essere utilizzato facilmente isolare e purificare il DNA del plasmide. Seguire il protocollo di produttori di conseguenza. Se si utilizza un ceppo batterico gram-negativo come e. coli, si consiglia di utilizzare un kit che rimuove le endotossine.</li>
	<li>Sequenza del DNA isolato da batteriche trasformanti utilizzando standard sequenziamento Sanger per confermare introduzione di SNP o INDEL desiderato.</li>
	<li>Linearizzare prodotti finali mediante digestione singolo enzima di restrizione del DNA purificato. Nota: Il vettore pIVT contiene più single-enzima tagliata siti elencati nella mappa del plasmide su Addgene 14.</li>
	<li>Assicurarsi che il prodotto sia lineare tramite l'elettroforesi del gel dell'agarosi. La metodologia per l'elettroforesi del gel dell'agarosi precedentemente è stata definita 14. Nota: Per tutti i passaggi rimanenti, utilizzare barriera (filtro) dispensare consigli e materiali RNasi-free per garantire una produzione di alta qualità stabile del RNA.</li>
	<li>Purificare il prodotto digerito utilizzando un protocollo di pulizia del DNA o kit convalidato ed eluire in acqua privo di RNAsi e dnasi di 30 µ l. Nota: Rotazione di silice-matrice kit a base di colonna sono raccomandati per l'alta qualità, purificato del DNA. Seguire il protocollo di produttori di conseguenza.</li>
	<li>
In vitro trascrivere DNA usando T7 polimerasi seguendo il protocollo del produttore.</li>
	<li>Purificare ed eluire RNA in 30 µ l di acqua gratuita di RNAsi/dnasi utilizzando un kit di purificazione basata sulla colonna dell'acido nucleico di spin di silice-matrice seguendo il protocollo del produttore.</li>
	<li>Eseguire Denaturare Elettroforesi del gel di agarosio utilizzo di formaldeide per confermare il formato finale del prodotto di RNA. Vedere i passaggi 1.13-1.22 sotto il 14. (Figura 1).</li>
	<li>Preparare il gel di riscaldamento 1 g agarosio in 72 mL acqua fino a completa dissoluzione, poi raffreddare a 60 ° C.</li>
	<li>Preparare 10 X MOPS tampone di corsa aggiungendo 0,4 M MOPS (pH 7.0), acetato di sodio 0.1 M ed EDTA 0,01 M.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di 10 X MOPS in esecuzione buffer e 18 mL di formaldeide al 37% (12,3 M) per la soluzione di agarosio raffreddato.</li>
	<li>Casta il gel versando la soluzione di agarosio in un contenitore di gelificanti. Utilizzare un pettine grande abbastanza per ospitare 10 µ l. Dopo gel è impostata ed è sodo al tatto, rimuovere delicatamente il pettine.</li>
	<li>Assemblare il gel nel serbatoio dell'elettroforesi e aggiungere abbastanza 1 tampone in esecuzione X MOPS, assicurando il gel è completamente coperto.</li>
	<li>Preparare campione di RNA mediante l'aggiunta di 1 µ g di RNA a 0,5 volumi X della tintura di caricamento contenenti formaldeide.</li>
	<li>Aggiungere il bromuro di etidio alla soluzione di RNA ad una concentrazione di 10 µ g/mL.</li>
	<li>Denaturare soluzione di campione di RNA a 70 ° C per 5 min.</li>
	<li>Utilizzando sterile, 10 µ l filtro consigli, caricare 5 µ l di marcatore di peso molecolare e 5 µ l di RNA dei campioni in pozzetti separati del gel ed elettroforesi a 5 V/cm fino a quando il colorante è migrato almeno i due terzi della lunghezza del gel.</li>
	<li>Visualizzare il RNA nel gel su un illuminatore di trans UV. Garantire che RNA è la dimensione corretta confrontando il marker di peso molecolare.</li>
	<li>Per misurare la concentrazione e la purezza del RNA, trasferire 1,2 µ l di RNA purificato utilizzando sterile 10 µ l filtro consigli su uno spettrofotometro di UV. Si noti che il RNA di alta qualità deve avere rapporti di assorbanza di A260/280 (1.8-2.2) e 260/230 (> 1.7) rispettivamente.</li>
	<li>Utilizzando 10 µ l filtro consigli, aliquotare il rimanente RNA purificato nelle provette di sterile 0,5 µ l centrifuga (3-5 µ l/tubo). Archivio tubi a-80 ° C fino al momento per il microinjection. Nota: Una concentrazione di iniezione finale di 500 ng / µ l è un punto di partenza ottimo. Si consiglia di diluire RNA 1:2 in RNasi free H20 prima microiniezione per ridurre la viscosità di RNA in pipetta microiniezione.</li>
</ol>2. cinetocore-Microtubule allegato Assay
<ol><li>Dividere gli ovociti in gruppi uguali per il microinjection. Nota: Raccolta degli ovociti, trasferimento, microiniezione e maturazione meiotica è stata descritta in dettaglio in Giove precedentemente 15.</li>
	<li>Microinject un gruppo con mRNA sperimentale e il o i gruppi con il controllo WT e PBS o Gfp mRNA. Nota: 500 ng / µ l è la concentrazione di iniezione consigliati per iniziare con 10. Un picoinjector può essere utilizzato per controllare la quantità di iniezione. Un volume di iniezione di 5-10 pL è consigliato 15.</li>
	<li>Usando una mano o bocca apparato pipettaggio azionato dove il vetro pipetta apertura è leggermente più grande del diametro di un ovocita (100-150 µm), trasferimento ovociti in una goccia di 100 µ l di terreno di coltura privo di milrinone in una capsula Petri coperto in embrione qualità olio minerale e incubare gli ovociti per 7 h a 37 ° C in 5% C02 per consentire la maturazione sufficiente alla metafase della meiosi ho (ho incontrato) 15.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, utilizzando la stessa apparecchiatura di pipetta come sopra, trasferire gli ovociti in un piatto di cultura centro-pozzo organo contenente 700 µ l del mezzo di raccolta di pre-refrigerati media essenziale minimo (MEM) nel centro ben e 500 µ l di H20 nell'anello esterno e piatto posto sul ghiaccio per 7 min. Nota: Si consiglia di pre-chill media MEM e centrare bene piatti di cultura di organo a-20 ° C per almeno 20 minuti prima del trattamento degli ovociti.</li>
	<li>Difficoltà gli ovociti trasferendoli utilizzando l'apparato di pipetta in un pozzetto di una piastra di vetro trasparente posto contenente 400 µ l di 2% paraformaldeide in 1X PBS per 20 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Utilizzando la stessa pipetta apparato, trasferire gli ovociti in un altro pozzo su un piatto posto contenente 400 µ l di soluzione bloccante (PBS + 0,3% BSA + 0.01% Tween-20 + 0,02% NaN3) e store a 4 ° C fino al momento di elaborare per immunostaining. Nota: per la memorizzazione di ovociti a 4 ° C, vetro di copertura piatto posto con parafilm per evitare l'evaporazione.</li>
	<li>Con la stessa pipetta apparecchiatura, ovociti di trasferimento ad un nuovo pozzo in un luogo piatto contenente soluzione di permeabilizzazione 400 µ l (PBS + 0,3% BSA + 0,1% TritonX-100 + 0,02% NaN3) e incubare a temperatura ambiente per un minimo di 20 ovociti trasferimento rapidamente attraverso tre gocce di 400 µ l blocco soluzione per rimuovere eventuali residui di detersivo. Nota: Un piatto di vetro trasparente 9-pozzo posto funziona bene per lo spostamento di gruppi attraverso trattamenti multipli su un singolo piatto (passaggi 2.4-2.5).</li>
	<li>Eseguire le restanti procedure di immunocitochimica in una camera umidificata, al riparo dalla luce a temperatura ambiente. Utilizzare un contenitore di plastica medie foderato con tovaglioli di carta umidi e coprire con foglio di alluminio.</li>
	<li>Utilizzando l'apparato di pipetta, trasferire gli ovociti a 30 µ l blocco soluzione sul coperchio di una piastra a 96 pozzetti e posto all'interno della camera umidificata per 10 min. Nota: Gocce vengono inseriti nella circolare indentions sulla piastra.</li>
	<li>Per etichettare i centromeri e mandrino, utilizzando l'apparato di pipetta, trasferimento ovociti in 30 µ l blocco soluzione contenente antigene anti-centromeriche (ACA, Crest) (01:30) e anti-acetilato tubulina (1: 1000) e incubare per almeno 1 h.</li>
	<li>Risciacquare gli ovociti trasferendo attraverso gocce tre 30 µ l di soluzione per 10 minuti ciascuno, di blocco.</li>
	<li>Utilizzando l'apparato di pipetta, trasferimento ovociti per un 30 µ l goccia di soluzione bloccante contenente anticorpi secondari gratuiti agli anticorpi utilizzati sopra (anti-human IgG 1: 200, 1: 200 IgG anti-topo) e incubare per 1 h.</li>
	<li>Ripetere i passaggi di risciacquo 10 min 3, in 30 µ l soluzione di blocco come descritto al punto 2.11.</li>
	<li>Trasferire gli ovociti, utilizzando l'apparato di pipetta, in 3-5 µ l montaggio medio contenente DAPI (5,9 µ g / µ l) su un vetrino per microscopio.</li>
	<li>Posto 4 piccole gocce (dimensioni di una testa di spillo) di gelatina di petrolio sugli angoli dei vetrini coprioggetto antischiacciamento degli ovociti.</li>
	<li>Delicatamente posizionare il lato di gelatina di petrolio di vetrini coprioggetto sulla diapositiva.</li>
	<li>Guarnizione vetrino coprioggetti bordi con chiaro smalto per unghie e lasciare per asciugare per 5 min.</li>
	<li>Archiviare le diapositive a 4 ° C, al riparo dalla luce, fino al trattamento tramite microscopia confocale. Nota: Assicurarsi che l'indice di rifrazione del mezzo di montaggio e il vetrino coprioggetti, partite i microscopio obiettivi utilizzati. Consigliata per il montaggio materiali precedentemente sono stati descritti 15.</li>
	<li>Immagine utilizzando un obiettivo x 40-63 su un microscopio confocale, catturando piccoli passi di ovociti (≤ 1 µm) nel piano z, ottimizzato per il lavoro obiettivo e l'immagine l'intera regione del mandrino metafase. Nota: Assicurarsi che tutti i 3 canali basati su specifici anticorpi secondari utilizzati nel passaggio 2.11 di immagine. Immagine in media ≥ 4 e uno zoom di 3 è ideali per un'adeguata risoluzione. Una dimensione di passaggio 1 µm offre una visualizzazione chiara dei microtubuli e cinetocori in oocytes del mouse. La procedura per l'acquisizione immagine varierà da un microscopio. Consultare la Guida utente confocale produttore per istruzioni specifiche su come configurare le impostazioni di microscopio.</li>
	<li>Identificare microtubulo-cinetocore allegato stato utilizzando il software di imaging seguendo passaggi 2,21-2.23 qui sotto. Nota: I passaggi seguenti descrivono questa procedura utilizzando il software scaricabile gratuitamente Image J (NIH), tuttavia, può essere utilizzato software di imaging alternativo. Lo stato di attaccamento tipi precedentemente sono stati definiti 16 .</li>
	<li>Apri immagine trascinando file nella barra degli strumenti immagine J.</li>
	<li>Aperto di z-serie, rendere tutti i canali visibili (DNA, cinetocore e mandrino) cliccando su "canali di Unione", disponibile nel menu a discesa "immagine", sotto la scheda di sub "colore".</li>
	<li>Utilizzando l'interruttore nella parte inferiore dell'immagine, spostare attraverso ogni fetta z e determinare allegato microtubule cinetocore. Allegato dettagliata descrizioni sono stati precedentemente descritti 16
</li>
</ol>3. cromosoma allineamento Challenge test
<ol><li>Utilizzando l'apparato di pipetta come descritto al punto 2.3, trasferire gli ovociti in una goccia di 100 µ l di terreno di coltura privo di milrinone sott'olio e incubare gli ovociti per 7 h per consentire sufficiente maturazione alla metafase della meiosi ho (ho incontrato) come precedentemente descritto nel passaggio 2.3 17 . Nota: Le procedure di raccolta, microiniezione e maturazione degli ovociti sono state delineate in precedenza 15. Riferisca al protocollo del saggio allegato nei passaggi 2.1-2.2 per i controlli e per le concentrazioni di microiniezione di RNA.</li>
	<li>Con la stessa pipetta apparecchiatura, trasferimento ovociti ad una cultura centro-pozzo organo piatto contenente 700 µ l di coltura contenente monastrol [100 µM] in centro ben e 400 µ l H20 nell'anello circostante e incubare a 37 ° C per 2 h.</li>
	<li>Sciacquare monastrol trasferendo gli ovociti, utilizzando l'apparato di pipetta come sopra, attraverso tre gocce di 100 µ l di CZB coltura e quindi trasferire gli ovociti per un nuovo piatto di cultura centro-pozzo organo contenente 700 µ l terreno di coltura + MG132 [5 µM] per 3 h al centro anello. Aggiungere 400 µ l H20 anello esterno.</li>
	<li>Difficoltà gli ovociti trasferendoli, utilizzando l'apparato di pipetta, in un pozzetto di una piastra di vetro trasparente posto contenente 400 µ l 2% paraformaldeide in PBS per 20 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Dopo la fissazione, trasferire gli ovociti, utilizzando l'apparato di pipetta, in un nuovo pozzetto di una piastra di vetro trasparente posto contenente 400 µ l soluzione bloccante e conservare a 4 ° C fino a elaborati per immunostaining. Nota: per la memorizzazione di ovociti a 4 ° C, vetro di copertura piatto posto con parafilm per evitare l'evaporazione.</li>
	<li>Permeabilize ed etichettare gli ovociti tramite immunocitochimica, come descritto nei passaggi 2.6-2.16.</li>
	<li>Immagine di ovociti utilizzando un obiettivo x 40-63 su un microscopio confocale, catturando < 1 µm passi nel piano z assicurandosi di tutta la regione del mandrino metafase di immagine.</li>
	<li>Per identificare l'allineamento del cromosoma stato aprire file di immagine utilizzando il software di imaging. Nota: I passaggi seguenti descrivono questa procedura utilizzando il software scaricabile gratuitamente Image J (NIH), tuttavia, può essere utilizzato software di imaging alternativo.</li>
	<li>Trascinare l'immagine nel pannello di controllo di immagine di J.</li>
	<li>Aperto di z-serie, utilizzare lo strumento punto (disponibile facendo clic sull'icona dello strumento punto sulla barra di controllo immagine J) per segnare punti alla fine di ciascun polo dell'alberino nei loro rispettivo fetta z posizionando lo strumento sopra il palo del mandrino nell'immagine e cliccando sull'immagine. Aggiungere questi punti nella regione di interesse (ROI) manager premendo comando + t sulla tastiera.</li>
	<li>Determinare le coordinate specifiche per ciascuna delle posizioni impostate al punto 3.10 mettendo in evidenza il punto specifico in gestione ROI e facendo clic sul pulsante di misura. Ciò fornirà un risultati contenenti tabella coordinate x e y per ogni punto. Questi saranno i punti X1, Y1 e X1, Y2, rispettivamente.</li>
	<li>Successivamente, determinare la coordinata Z true. Questo viene fatto moltiplicando il numero di slice della z-fetta specifico nello z-stack in cui è stato identificato il polo dell'alberino (cioè fetta #2 di 6) che ogni singolo punto è dallo spessore dello stack (cioè 1 µm) (esempio: affettare 2 x 1 µm = 2). Questi saranno i punti Z1 e Z2, rispettivamente.</li>
	<li>Determinare la lunghezza del mandrino usando l'equazione del teorema di Pitagora (a2 + b2 = c2) utilizzando il precedentemente definito coordinate x, y e z da passaggi 3.11-3.13. Per ogni mandrino lunghezza finale è uguale a: √((X1-X2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2)</li>
	<li>Determinare la fosforila mandrino. È calcolato come metà della lunghezza del mandrino. Utilizzando lo strumento di riga di immagine J, facendo clic sull'icona linea nella barra degli strumenti immagine J, disegnare una linea che va da un polo di mandrino a fosforila il mandrino. La lunghezza verrà visualizzata sulla barra degli strumenti immagine J.</li>
	<li>Determinare lo stato di allineamento del cromosoma valutando la distanza del cromosoma dalla fosforila mandrino utilizzando lo strumento di misurazione di linea. Utilizzando lo strumento della riga disponibile facendo clic sull'icona linea nella barra degli strumenti immagine J, disegnare una linea da fosforila il mandrino al cromosoma. La lunghezza verrà visualizzata sulla barra degli strumenti immagine J. Maggiore di 4 µm da fosforila il mandrino di cromosomi sono considerati non allineati 18.</li>
</ol>

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<li>Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+maturation+involves+compartmentalization+and+opposing+changes+of+cAMP+levels+in+follicular+somatic+and+germ+cells%3A+studies+using+selective+phosphodiesterase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: studies using selective phosphodiesterase inhibitors.</a> Dev Biol. 178 (2), 393-402 (1996).</li>
<li>Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+spindle+assembly+mechanisms+with+monastrol%2C+a+small+molecule+inhibitor+of+the+mitotic+kinesin%2C+Eg5%5BTitle%5D)+AND+%22Eg5.+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin, Eg5.</a> Eg5. J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).</li>
<li>Jones, K. T., Lane, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+causes+of+aneuploidy+in+mammalian+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs.</a> Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).</li>
<li>Fellmeth, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+characterization+of+three+Aurora+kinase+C+splice+variants+found+in+human+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes.</a> Mol Hum Reprod. 21 (8), 633-644 (2015).</li>
<li>Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+cold-stable+kinetochore+fiber+in+metaphase+PtK1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells.</a> Chromosoma. 84 (1), 145-158 (1981).</li>
<li>Brunet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetochore+fibers+are+not+involved+in+the+formation+of+the+first+meiotic+spindle+in+mouse+oocytes%2C+but+control+the+exit+from+the+first+meiotic+M+phase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase.</a> J Cell Biol. 146 (1), 1-12 (1999).</li>
<li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+and+transcriptional+activation+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

A causa l'identificazione rapida e crescente di varianti genetiche umane associati alla malattia, è essenziale che i sistemi sono stabiliti per valutare il loro significato biologico. Capire la funzione della proteina in meiosi umana pone sfide particolari perché ovociti umani sono preziosi e raro e umano dello sperma non è suscettibile di manipolazione genetica. Oocytes del mouse sono un sistema di modello mammifero prezioso per la valutazione umana del gene meiotica funzione 10,<sup c...

La sterilità è una condizione che colpisce il 10-15% della popolazione umana dell'età riproduttiva 1, da cui quasi metà Cerca cure mediche 2. Anche se l'eziologia dell'infertilità è vario e in molti casi multifattoriali, l'anomalia genetica più comune in esseri umani è aneuploide embrionali 3. Aneuploide è definita come la deviazione (guadagno o perdita) del numero corretto di cromosomi in una cella. Il fenomeno di aneuploide in embrioni umani è comune e aumenta con l'età materna avanzata 4,5. Quattro studi controllati randomizzati hanno evidenziato i benefici della selezione solo cromosomicamente normali (euploide) degli embrioni per il trasferimento uterino perché questa strategia ha provocato l'impianto aumento tariffe, tassi più bassi di aborto spontaneo e tempi più brevi per raggiungimento di gravidanza 6,7,8,9. Di conseguenza, capire l'eziologia di aneuploide umana possono avere importanti implicazioni nella riproduzione assistita.
Anche se la prova genetica preimpianto per aneuploidie è vantaggiosa in trattamenti di sterilità, manca ancora una conoscenza approfondita di come origine degli aneuploidi. È ampiamente accettato che esiste una correlazione positiva di aneuploidie meiotiche (originati durante la produzione di gameti) e l'età materna, tuttavia, alcuni tassi di aneuploide embrionali presenti donne che si discostano dal tasso medio per loro era dato 4. Questi casi suggeriscono che la sola età non è sempre predittivi del rischio di generare un embrione aneuploide. Altri fattori possono svolgere un ruolo nell'aumento del rischio di aneuploidia embrionale, come varianti del gene.
Un aspetto fondamentale di studiare il potenziale contributo di una variante del gene di aneuploide durante la meiosi ovocitaria è quello di progettare un sistema per valutare rapidamente la funzione del gene meiotica. A causa di limitazioni di carattere etici e accesso limitato, è poco pratico per eseguire questi esperimenti utilizzando ovuli umani. Questi problemi possono essere aggirati utilizzando oocytes del mouse, e qui una serie di saggi per valutare la funzione del gene umano durante la meiosi io sono descritti. Da microinjecting del RNA messaggero (mRNA) che codifica per la variante del gene di interesse, la localizzazione della proteina umana nell'uovo del mouse può essere visualizzata e utilizzata per determinare se l'espressione ectopica della proteina wild-type e mutanti umana risultati in qualsiasi alterazioni fenotipiche che potrebbero portare a aneuploide. Questi fenotipi comprendono un aumento in microtubuli che si attaccano all'improprio alla sorella cinetocore e l'incapacità di sostenere allineamento cromosomi in metafase della meiosi I. d'importanza, questo protocollo può essere usato per studiare il guadagno e la perdita della funzione varianti genetiche attraverso la definizione di specifiche condizioni sperimentali per sfidare gli eventi chiave nella meiosi ovocitaria come mandrino allineamento edificio e del cromosoma 10.

<table><tbody><tr><td>Provetta PCR Seal-Rite da 0,2 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1602-4300</td><td></td></tr><tr><td>Scala DNA da 1 kb</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0313</td><td></td></tr><tr><td>Scala DNA da 100 bp</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0243</td><td></td></tr><tr><td>Colorante con caricamento DNA</td><td>6X Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Piastra spot in vetro a 9 pozzetti</td><td>Thomas Scientific</td><td>7812G17</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Albumina da siero bovino&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-fluor-568 coniugato anti-topo IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21050</td><td>diluizione 1:200</td></tr><tr><td>Alexa-fluor-633 coniugato anti-umano</td><td>IgG Thermo Scientific</td><td>A21091</td><td>diluizione 1:200</td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>VWR</td><td>AA0356</td><td></td></tr><tr><td>Tabella antivibrante</td><td>Technical Manufacturing Corp</td><td></td><td>qualsiasi modello standard</td></tr><tr><td>Anti-Acetillina anticorpo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7451</td><td>diluizione 1:100</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-centromerico (CREST)</td><td>Anticorpi incorportati</td><td>15-234</td><td>diluizione 1:30&nbsp;</td></tr><tr><td>Barriera (filtro) Puntali per pipette</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM12635</td><td>Assicurati che siano compatibili con la tua marca di pipettatori. Questi sono compatibili con i pipettatori del marchio Eppendorf.</td></tr><tr><td>Terreni di coltura disidratati BD Difco: LB Agar, Miller (Luria Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0445-07-6</td><td></td></tr><tr><td>Terreni di coltura disidratati BD Difco: LB Broth, Miller (Luria Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0446-07-5</td><td></td></tr><tr><td>Tubo capillare</td><td>Sutter</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per coltura d'organo Center Well</td><td>VWR</td><td>25381-141</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoio</td><td></td> di CO2<td></td><td>Per incubatore</td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Zeiss</td><td></td><td>qualsiasi modello standard</td></tr><tr><td>Centrifuga (con capacità di raffreddamento)</td><td>Thomas Scientific</td><td></td><td>qualsiasi modello standard&nbsp;</td></tr><tr><td>Vetro di copertura 11 x 22 mm</td><td>Thomas Scientific</td><td>6663F10</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>Thomas Scientific</td><td>6663-F10</td><td>lo spessore varia per particolari microscopi</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DEPC H20</td><td>Life Technologies</td><td>AM9922</td><td></td></tr><tr><td>Bagno a secco digitale</td><td>Thermo Scientific</td><td>888700001</td><td></td></tr><tr><td>Easy A high enzima di clonazione fedeltà</td><td>Agilent</td><td>600400</td><td>Per la clonazione del DNA&nbsp;</td></tr><tr><td>Enzimi per la linearizzazione di pIVT</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td>NdeI o KasI possono essere utilizzati</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td> a fluorescenza 155585011 <td></td><td>al bromuro di etidio</td></tr><tr><td>.</td><td></td><td></td><td>Qualsiasi microscopio fluorescente può essere utilizzato</td></tr><tr><td>Formaldeide (37%)</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>9311</td><td></td></tr><tr><td>Colorante di caricamento dell'RNA di formaldeide</td><td>Ambion</td><td>8552</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio smerigliati (non caricati) 25X75 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-3</td><td></td></tr><tr><td>Cloni</td><td></td><td></td> di cDNA a lunghezza intera <td>Può essere ottenuto da qualsiasi fornitore che fornisca una lettura aperta cloni di telaio</td></tr><tr><td>Apparecchio per elettroforesi su gel</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>qualsiasi modello standard</td></tr><tr><td>Glass Pasteur Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-200</td><td></td></tr><tr><td>Globin Forward Primer per pIVT Construct</td><td></td><td></td><td>5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'.&nbsp; Può essere acquistato da qualsiasi azienda che genera oligonucelotidi personalizzati</td></tr><tr><td>Primer inverso globina per pIVT Construct</td><td></td><td></td><td>5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Può essere acquistato da qualsiasi azienda che genera oligonucelotidi personalizzati</td></tr><tr><td>Holding pipette</td><td>Eppendorf</td><td>930001015</td><td>Vacutip</td></tr><tr><td>Humidified Chamber Tupperware</td><td></td><td></td><td>può essere utilizzato</td></tr><tr><td>Illustra Ready-To-Go Perle RT-PCR Incubatore</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> 27925901 GE Life Sciences <td>qualsiasi modello standard con tecnologia CO2 e camicia d'acqua</td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Strumenti Nikon</td><td></td><td>Qualsiasi modello standard</td></tr><tr><td>Software Image J (NIH) Software</td> di <td>analisi delle immagini</td><td>NIH</td><td></td></tr><tr><td>Coperchio della piastra a 96 pozzetti</td><td>Nalgene Nunc International</td><td>263339</td><td></td></tr><tr><td>Provetta microcentrica da 0,5 mL a bassa adesione</td><td>USA Scientific</td><td>1405-2600</td><td></td></tr><tr><td>MacVector&nbsp;</td><td>MacVector</td><td></td><td>Software di analisi di sequenze</td></tr><tr><td>MG132</td><td>Selleckchem</td><td>S2619</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Marcatori RNA del millennio-Formaldeide&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM7151</td><td></td></tr><tr><td>Milrinone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4659</td><td>Risospensione in DMSO a 2,5 mM</td></tr><tr><td>di olio minerale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td>Usato solo</td></tr><tr><td>Monastrol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8515</td><td>Risospensione in DMSO a 100</td></tr><tr><td>mM Boccaglio</td><td>Biodiseno</td><td>MP-001-Y</td><td></td></tr><tr><td>Atomizzatore</td><td></td> <td>N2</td><td>per tavolo antivibrante</td></tr><tr><td>Smalto per unghie; Trasparente</td><td></td><td></td><td>È possibile utilizzare qualsiasi smalto trasparente</td></tr><tr><td>Spettrofotometro UV-Vis NanoDrop Microvolume</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>qualsiasi modello standard</td></tr><tr><td>NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>AM8676</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax 10X Running buffer</td><td>Life Technologies</td><td>AM8671</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Running buffer</td><td>Thermo Scnentific</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per coltura d'organo 60x15mm</td><td>Life Technologies</td><td>08-772-12</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Polysciences, Inc.</td><td></td><td></td>577773</tr><tr><td>PCR Termociclatore</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4484075</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri 139 mm</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>501V</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri 35 mm</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>121V</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri 60 mm</td><td>Falcon BD</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Picoinjector</td><td>Microiniettore</td><td></td> digitale XenoWorks <td>qualsiasi modello standard</td></tr><tr><td>Estrattore per pipette</td><td>Flaming-Brown Estrattore per micropipette</td><td>Modello P-1000</td><td></td></tr><tr><td>plasmide pIVT</td><td>AddGene</td><td>32374</td><td>Vettore vuoto adatto per l'espressione degli ovociti.</td></tr><tr><td>Gonadotropina sierica cavalla incinta</td><td>Lee BioSolutions</td><td>493-10</td><td></td></tr><tr><td>Kit QIAprep Spin Miniprep Purificazione</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>fino a 20 uL di DNA plasmidico</td></tr><tr><td>Kit di purificazione PCR QIAquick Qiagen</td><td></td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Kit di mutagenesi diretta al sito Quikchange II</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>Kit di</td><td>mutagenesi 200523 per inserimenti e delezioni Kit di mutagenesi</td></tr><tr><td>diretta multisito Quikchange lightning</td><td>Agilent&nbsp;</td><td></td><td>Kit di mutagenesi 210512 per modifiche di un singolo sito</td></tr><tr><td>Forbici (punta fine)</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>14393</td><td></td></tr><tr><td>Forbici (punta media)</td><td>Strumenti per la scienza</td><td>WP114225</td><td></td></tr><tr><td>Seal-Rite 1,5 mL provetta per microcentrifuga</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Scaldavetrini</td><td></td><td></td><td>qualsiasi modello standard</td></tr><tr><td>Spettrofotometro (Nanodrop)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Stereomicroscopio</td> ND-ONE-W <td></td></tr><tr><td></td><td>qualsiasi modello standard</td>Efficienza di subclonaggio DH5a Cellule competenti Siringa da 18265017 Thermo Fisher Scientifc BD Bioscienes 309623 1 ml, 27G(1/2)T4 DNA Ligasi New England Biolabs M0202L T7 mMessage Machine ad alto rendimento <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> kit di trascrizione di RNA con cappuccio</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>x-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Pinzetta Sigma-Aldrich</td><td>274348</td><td></td></tr><tr><td>(punta fine - Misura 5)</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>SN.743.12.1</td><td></td></tr><tr><td>Acqua distillata ultrapura senza DNASI/RNASI</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>UVP UV/White lite transilluminatore</td><td>Fisher</td><td>Scientific UV95041501</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Montaggio Medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

usando i oocytes del mouse per valutare la funzione del gene umano durante la meiosi i

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

L'aneuploidia embrionale è la principale causa genetica di infertilità nell'uomo. La maggior parte di questi eventi hanno origine durante la meiosi femminile, e seppur correlata positivamente con l'età materna, età da solo non è sempre predittivi del rischio di generare un embrione aneuploide. Pertanto, le varianti del gene potrebbero rappresentare segregazione del cromosoma non corretto durante l'oogenesi. Dato che l'accesso di ovociti umani è limitato per scopi di ricerca, una serie di saggi sono stati sviluppati per studio di funzione del gene umano durante la meiosi I usando i oocytes del mouse. In primo luogo, RNA messaggero (mRNA) del gene e la variante del gene di interesse vengono microiniettati nei oocytes del mouse mi-arrestato profase. Dopo dando il tempo di espressione, gli ovociti vengono rilasciati in modo sincrono nella maturazione meiotica per completare la meiosi I. Contrassegnando il mRNA con una sequenza di un reporter fluorescente, come ad esempio la proteina fluorescente verde (Gfp), la localizzazione della proteina umana può essere valutata oltre le alterazioni fenotipiche. Ad esempio, guadagno o perdita di funzione può essere indagata attraverso la definizione di condizioni sperimentali che sfidano il prodotto del gene per correggere errori meiotic. Anche se questo sistema è vantaggioso nelle indagini di funzione della proteina umana durante l'oogenesi, un'adeguata interpretazione dei risultati dovrebbe essere intrapreso dato che l'espressione della proteina non è ai livelli endogeni e, se non controllato per (cioè bussato fuori o verso il basso), omologhi murini sono anche presenti nel sistema.

Dopo in vitro trascrizione RNA di alta qualità avrà un rapporto A260/A280 di (1.8-2.2) e un ≥1.7 di rapporto A260/A230 quando misurata con uno spettrofotometro. L'immagine nella Figura 1 Mostra la migrazione di in vitro-prodotto RNA su un gel di agarosio denaturante dopo elettroforesi. Una band che è spalmata in modello o un campione che ha bande di dimensioni multiple può indicare contaminazione o degradazione del campione. In alternativa, ...

Come le varianti genetiche associate con la malattia umana cominciano a diventare scoperto, sta diventando sempre più importante sviluppare sistemi con cui valutare rapidamente il significato biologico di quelle varianti identificate. Questo protocollo descrive i metodi per valutare la funzione del gene umano durante la meiosi femminile che usando i oocytes del mouse.

Usando i Oocytes del Mouse per valutare la funzione del Gene umano durante la meiosi I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

L'obiettivo generale di questa serie di saggi è quello di studiare la funzione genica umana durante la Meiosi I utilizzando ovociti di topo. Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo riproduttivo umano, come ad esempio se esiste una predisposizione genetica all'aneuploidia materna. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza ovociti di topo come modello per la meiosi dei mammiferi, il che è utile data l'inaccessibilità degli ovuli umani per gli studi sulla funzione genica.L'idea di questo metodo è nata quando abbiamo sequenziato gli esomi di donne che si erano sottoposte a trattamenti di fecondazione in vitro e i cui tassi di aneuploidia embrionale non potevano essere spiegati con l'età materna. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le fasi di analisi delle immagini sono difficili da apprendere e la definizione di parametri di analisi rigorosi è fondamentale per il rigore e la riproducibilità. Utilizzando una strategia di clonazione convalidata, inserire la sequenza codificante a lunghezza intera del gene di interesse nella regione di clonazione multipla del vettore di trascrizione in vitro.Mutagenizzare il DNA se s

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Questo protocollo illustra la tecnica per l'estrazione di ovociti o di embrioni fecondati in fase iniziale dalla ovidotto di topi. La capacità di identificare i infindibulum e inserire un ago senza punta fine in esso è essenziale per eseguire correttamente la procedura.

Recupero degli ovociti mouse

Ovociti sono inclini a aneuploidia a causa di errori nella segregazione dei cromosomi durante la maturazione meiotica. Uova aneuploidi può causare infertilità, aborti o disturbi dello sviluppo, come la sindrome di Down. Qui, descriviamo i metodi per introdurre materiali di scelta in ovociti e metodi per lo studio maturazione meiotica e valutare ploidia.

Microiniezione degli ovociti mouse, Maturazione e Ploidia valutazione

Qui, vi presentiamo un protocollo per le specifiche esaurimento mRNA siRNA-mediata seguita da analisi di immunofluorescenza per valutare il montaggio fuso meiotico e l'organizzazione in ovociti di topo. Questo protocollo è adatto a deplezione di trascritti in vitro e valutazione funzionale diverso mandrino e / o fattori MTOC associati in oociti.

Meiotic mandrino valutazione in mouse Ovociti mettendo a tacere siRNA-mediata

Presentiamo protocolli per la raccolta, la preparazione e l'imaging di ovociti maturi di Drosophila. Questi metodi consentono la visualizzazione del comportamento cromosomico e dell'assemblaggio e della funzione del fuso durante la meiosi.

Tecniche di Imaging Prometafase e metafase della meiosi I nel fisso<em&gt; Drosophila</em&gt; ovociti

Oogenesi nei mammiferi sono noto per essere soggetta a errori, particolarmente dovuto malsegregazione di cromosoma. Questo manoscritto descrive metodi di preparazione di cromatina diffusa per profase mouse, metafase I e II-messa in scena di ovociti. Queste tecniche fondamentali consentono per lo studio della cromatina-proteine e morfologia del cromosoma in tutto mammiferi oogenesi.

Cromatina diffusa i preparativi per l'analisi della progressione di ovocita Mouse dalla profase alla metafase II

Viene presentato un protocollo ottimizzato che consente l'esaurimento dei centri di organizzazione dei microtubuli citoplasmatici negli ovociti di topo durante la metafase I utilizzando un laser a femtosecondi nel vicino infrarosso.

Ablazione laser multi-fotone di centri di organizzazione di microtubuli citoplasmatici in ovociti di topo

L'errore nella segregazione cromosomica è una caratteristica comune negli ovociti. Pertanto, lo studio del punto di controllo dell'assemblaggio del fuso fornisce importanti indizi sui meccanismi necessari per produrre uova sane. Il presente protocollo descrive tre saggi complementari per valutare l'integrità del checkpoint di assemblaggio del fuso negli ovociti di topo.

Valutazione dell'integrità del checkpoint dell'assemblaggio del mandrino negli ovociti di topo

Mantenere l'integrità del genoma dell'ovocita è necessario per garantire la fedeltà genetica nell'embrione risultante. Qui, presentiamo un protocollo accurato per rilevare le rotture del doppio filamento del DNA nelle cellule germinali femminili dei mammiferi.

Rilevamento di rotture a doppio filamento di DNA in ovociti di topo

Questo protocollo fornisce un quadro sperimentale per documentare l'impatto fisico del citoscheletro sulla forma nucleare e sugli organelli interni privi di membrana nel sistema ovocitario di topo. Il framework può essere adattato per l'uso in altri tipi di cellule e contesti.

Cattura dell'agitazione basata sul citoscheletro del nucleo dell'ovocita di topo su scale spaziali

Gli errori meiotici nelle sinapsi e nella ricombinazione sono comuni agli ovociti dei mammiferi. Un'analisi rigorosa delle proteine coinvolte in questi processi è essenziale per capire come e perché l'oogenesi spesso va male. Le tecniche qui presentate consentono un monitoraggio completo della ricombinazione e delle sinapsi per valutare la qualità degli ovociti nei topi.

Preparazione di diffusioni cromosomiche meiotiche da ovociti di topo per la valutazione della sinapsi e della ricombinazione

Scopri come valutare la funzione del gene umano durante la meiosi I utilizzando ovociti di topo. Questo metodo permette di studiare le predisposizioni genetiche all'aneuploidia materna in modo rapido e riproducibile.

Usando i Oocytes del Mouse per valutare la funzione del Gene umano durante la meiosi I

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