Usando i Oocytes del Mouse per valutare la funzione del Gene umano durante la meiosi I

L'obiettivo generale di questa serie di saggi è quello di studiare la funzione genica umana durante la Meiosi I utilizzando ovociti di topo. Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo riproduttivo umano, come ad esempio se esiste una predisposizione genetica all'aneuploidia materna. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza ovociti di topo come modello per la meiosi dei mammiferi, il che è utile data l'inaccessibilità degli ovuli umani per gli studi sulla funzione genica.

L'idea di questo metodo è nata quando abbiamo sequenziato gli esomi di donne che si erano sottoposte a trattamenti di fecondazione in vitro e i cui tassi di aneuploidia embrionale non potevano essere spiegati con l'età materna. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le fasi di analisi delle immagini sono difficili da apprendere e la definizione di parametri di analisi rigorosi è fondamentale per il rigore e la riproducibilità. Utilizzando una strategia di clonazione convalidata, inserire la sequenza codificante a lunghezza intera del gene di interesse nella regione di clonazione multipla del vettore di trascrizione in vitro.

Mutagenizzare il DNA se si generano polimorfismi a singolo nucleotide o inserzioni e delezioni, come descritto nel protocollo di testo. Successivamente, trasformare il DNA mutagenizzato in un ospite batterico. Utilizzare un kit per isolare e purificare il plasmide, seguendo le istruzioni del produttore.

Quindi, linearizzare i prodotti finali utilizzando la digestione con un singolo enzima di restrizione del DNA purificato. Purificare il prodotto digerito utilizzando un protocollo di purificazione del DNA convalidato o un kit. Ed eluire in 30 microlitri di acqua priva di RNasi/DNasi.

In vitro, trascrivere il DNA utilizzando la polimerasi T7 seguendo il protocollo del produttore. Infine, purificare ed eluire l'RNA in 30 microlitri di acqua priva di RNasi/DNasi utilizzando un kit di purificazione degli acidi nucleici basato su colonna di spin a matrice di silice seguendo il protocollo del produttore. Dividere gli ovociti in gruppi uguali per la microiniezione.

Microiniettare un gruppo con mRNA sperimentale e l'altro gruppo con NPB di controllo wild-type o mRNA GFP. Utilizzando un apparecchio di pipettaggio manuale o orale in cui l'apertura della pipetta di vetro è leggermente più grande del diametro di un ovocita, trasferire gli ovociti in una goccia da 100 microlitri di terreno di coltura privo di milrinone in una capsula di Petri ricoperta di olio minerale di qualità embrionale. Quindi, incubare gli ovociti per sette ore a 37 gradi Celsius in CO2 al 5% per consentire una maturazione sufficiente alla metafase della meiosi I.Dopo l'incubazione, utilizzare lo stesso apparecchio pipettato per trasferire gli ovociti in una capsula di coltura d'organo a pozzetto centrale contenente 700 microlitri di terreno di raccolta MEM pre-raffreddato nel pozzetto centrale e 500 microlitri di acqua nell'anello esterno.

Mettere il piatto sul ghiaccio per sette minuti. Fissare gli ovociti trasferendoli in un pozzetto di una lastra di vetro trasparente contenente 400 microlitri di paraformaldeide al 2% in 1x PBS. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.

Dopo l'immunocolorazione, come descritto nel protocollo di testo, visualizzare gli ovociti utilizzando un obiettivo da 40 a 63x su un microscopio confocale. Cattura piccoli passi nel piano Z ottimizzato per l'obiettivo di lavoro e visualizza l'intera regione del mandrino in metafase. Per identificare lo stato di collegamento del microtubulo cinetocoro, aprire prima l'immagine trascinando il file nella barra degli strumenti di ImageJ.

Nella serie Z aperta, vai al menu a discesa dell'immagine e, nella sottoscheda Colore, fai clic su Unisci canali per rendere visibili tutti i canali. È fondamentale che l'analista abbia familiarità con il tipo di attacchi ai cinetocori possibili negli ovociti di topo. La qualità dell'immagine influenzerà notevolmente la tua capacità di analizzare correttamente questi dati.

Utilizzando l'interruttore nella parte inferiore dell'immagine, spostarsi attraverso ogni sezione Z e determinare l'attacco dei microtubuli cinetocore. Utilizzando lo stesso pipettatore, trasferire gli ovociti in una goccia da 100 microlitri di terreno di coltura privo di milrinone sotto olio. Incubare gli ovociti per sette ore per consentire una maturazione sufficiente alla metafase della meiosi I come prima.

Quindi, trasferire gli ovociti in una capsula di coltura per organi a pozzetto centrale contenente 700 microlitri di terreno di coltura contenente monastrolo nel pozzetto centrale e 400 microlitri di acqua nell'anello circostante. Incubare a 37 gradi Celsius per due ore. Sciacquare il monastrolo trasferendo gli ovociti attraverso tre gocce da 100 microlitri di terreno di coltura CZB.

Quindi trasferire gli ovociti in una nuova piastra di coltura per organi a pozzetto centrale contenente 700 microlitri di terreno di coltura più un inibitore del proteasoma nell'anello centrale. Aggiungere 400 microlitri di acqua all'anello esterno e incubare per tre ore. Successivamente, fissare gli ovociti trasferendoli in un pozzetto di una lastra di vetro trasparente contenente 400 microlitri di paraformaldeide al 2% in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente.

Visualizzare gli ovociti utilizzando un obiettivo da 40 a 63x su un microscopio confocale, catturando passi inferiori a un micron nel piano Z e assicurandosi di visualizzare l'intera regione del fuso di metafase. Per identificare lo stato di allineamento dei cromosomi, aprire i file immagine utilizzando il software di imaging. Quindi trascinare l'immagine nel pannello di controllo ImageJ.

Nella serie Z aperta, utilizzare lo strumento punto per contrassegnare i punti all'estremità di ciascun polo del mandrino nella rispettiva sezione Z posizionando l'utensile sopra il polo del mandrino nell'immagine e facendo clic sull'immagine. Aggiungi questi punti al ROI Manager premendo contemporaneamente il pulsante di comando e il pulsante T sulla tastiera. Determina le coordinate specifiche per ciascuna delle posizioni impostate evidenziando il punto specifico nel ROI Manager e facendo clic sul pulsante Misura.

Questo fornirà una tabella dei risultati contenente le coordinate X e Y per ogni punto, che sono rispettivamente i punti X1, Y1 e X1, Y2. Quindi, determina la vera coordinata Z. Questo viene fatto moltiplicando il numero di fette della specifica fetta Z nella pila Z in cui il polo del mandrino è stato identificato per lo spessore della pila.

Questi saranno rispettivamente i punti Z1 e Z2. Determinare la lunghezza del mandrino utilizzando l'equazione del teorema di Pitagora con le coordinate X, Y e Z precedentemente definite. Quindi, determinare la zona centrale del mandrino.

Questo è calcolato come 1/2 della lunghezza del mandrino. Fare clic sull'icona della linea nella barra degli strumenti di ImageJ e tracciare una linea che va da un polo del mandrino alla zona centrale del mandrino. La lunghezza verrà visualizzata sulla barra degli strumenti di ImageJ.

La definizione di rigorosi parametri di allineamento cromosomico consente un'analisi quantitativa robusta, importante per la riproducibilità dei dati. Determinare lo stato di allineamento cromosomico valutando la distanza cromosomica dalla zona mediana del mandrino utilizzando lo strumento di misurazione della linea. Fare clic sull'icona della linea nella barra degli strumenti di ImageJ e tracciare una linea dalla zona mediana del mandrino al cromosoma.

La lunghezza verrà visualizzata sulla barra degli strumenti di ImageJ. I cromosomi superiori a quattro micron dalla zona mediana del fuso sono considerati non allineati. Dopo che gli ovociti sono stati sottoposti a immunocolorazione e imaging, è possibile valutare i corretti attacchi dei cinetocore dei microtubuli.

In un normale attacco, ogni coppia di cinetocore sorella del bivalente è attaccata ai microtubuli del fuso da poli opposti. Si possono osservare fino a tre diversi tipi di attacchi anomali. Un esempio si verifica quando non ci sono microtubuli a contatto con il cinetocore.

In alternativa, i microtubuli possono legarsi in modo errato, producendo attacchi sintelici o merotelici. Gli attacchi sintelici si formano con entrambe le coppie di cinetocori gemelli attaccati a microtubuli che emanano da un singolo polo. Gli attacchi meroteli si verificano quando i cinetocori fratelli in coppia sono attaccati a poli opposti.

Dopo che gli ovociti si sono ripresi dal disallineamento indotto, la capacità dei cromosomi di riallinearsi viene valutata mediante imaging. In questo esempio, un cromosoma bivalente è considerato disallineato poiché si trova a più di quattro micron dalla zona mediana del fuso. Quando si sceglie quale test è appropriato per valutare la funzione delle varianti geniche, è importante ricordare che le varianti genetiche umane in studio sono sovraespresse e che gli omologhi endogeni dei topi potrebbero dover essere esauriti allo stesso tempo.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come CRISPR-Cas9 per creare ceppi di topo umanizzati per rispondere a ulteriori domande, come capire come la variante genetica influenza la qualità degli ovuli e degli embrioni e se influisce sulla salute riproduttiva dell'individuo. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della genetica riproduttiva per esplorare altri fattori causali dell'aneuploidia materna nell'uomo. L'identificazione genica potrebbe fornire una potente diagnostica e una base per gli studi sulla correzione delle aneuploidie.

Grazie per aver guardato. Buona fortuna con i tuoi esperimenti.