Name: Usando oócitos de camundongo para avaliar a função de genes humanos durante a meiose I (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Aprenda a avaliar a função de genes humanos durante a meiose I utilizando oócitos de camundongo como modelo. Este método permite investigar predisposições genéticas para aneuploidia materna em estudos de biologia reprodutiva.

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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de pesquisa da sociedade americana de medicina reprodutiva e do Charles e Johanna Busch Memorial Fund na Rutgers, Universidade do estado de NJ para Konzen A.L.N. foi apoiada por uma concessão do N.I.H (F31 HD0989597).

1. molecular clonagem
<ol><li>Obter a sequência de código completo do gene de interesse e o plasmídeo em vitro transcrição (pIVT) vetor11. Nota: Clones de cDNA completos estão comercialmente disponíveis a partir de vários fornecedores ou podem ser gerados através da reação em cadeia da polimerase transcrição reversa (RT-PCR). Centro Nacional para recursos on-line Biotechnology Information (NCBI) fornece sequências de transcrição de genes do nucleotídeo e sequência expressa com a tag bancos de dados (EST). Para facilidade de proteína, visualização e análise dos níveis de expressão, fusão de proteína verde fluorescente (Gfp) ou outra marca fluorescente apropriada podem ser desejados na estratégia de clonagem.</li>
	<li>Usando uma estratégia de clonagem validada, inserir a sequência de codificação do gene de interesse para a região de clonagem múltipla de pIVT. Uma descrição detalhada da clonagem molecular e as etapas necessárias foram anteriormente descrito 12. Nota: Se um produto do gene de fusão é para ser gerado, certifique-se de que a clonagem é no quadro de leitura.</li>
	<li>Sequenciar a construção usando primeiras demão de globina para garantir a inserção do gene correto, fusão de em-frame adequada, e que foram criadas sem mutações de ponto induzida pela polimerase. Nota: Se não houver equipamentos de sequenciamento de DNA de Sanger, muitas empresas oferecem baixo custos opções de sequenciamento de DNA.</li>
	<li>Mutagenize DNA se gerando polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) ou inserções/exclusões (PUNTUAIS). Mutagênese do DNA é descrito em etapas 1.5-1.7 abaixo. Para construções de tipo selvagem, prossiga com a etapa de linearização 1.7.</li>
	<li>Projetar primers mutagênese e completar a reação de PCR de mutagênese para gerar mutante construção de acordo com o protocolo do fabricante. Mediada por PCR mutagenesis local-dirigido tem sido descrito anteriormente 13. Além disso, muitas empresas oferecem kits de mutagenesis local-dirigido que incluem protocolos.</li>
	<li>Transforme mutagenized DNA bacteriano hospedeiro. Isolar e purificar o plasmídeo. Nota: Muitas empresas fazem kits que podem ser usados para isolar e purificar o Plasmídeo facilmente. Segui o protocolo de fabricantes em conformidade. Se usando uma estirpe bacteriana gram-negativa, tais como Escherichia coli, é recomendável usar um kit que remove endotoxinas.</li>
	<li>Sequenciar o DNA isolado de transformants bacteriana usando sequenciamento de DNA de Sanger padrão para confirmar a introdução do SNP ou INDEL desejado.</li>
	<li>Linearizar produtos finais usando digestão única enzima de restrição do DNA purificado. Nota: O vetor pIVT contém vários single-enzima cortar sites listados no mapa do plasmídeo na Addgene 14.</li>
	<li>Certifique-se de que o produto é linear através de eletroforese em gel de agarose. A metodologia de eletroforese em gel de agarose foi anteriormente definido 14. Nota: Para todas as etapas restantes, use materiais livre de RNase e pontas de pipeta de barreira (filtro) para garantir uma produção estável, de alta qualidade do RNA.</li>
	<li>Purificar o produto digerido usando um protocolo de limpeza de DNA ou kit de validado e eluir em água de RNase/DNase-livre 30 µ l. Nota: Rotação de sílica-matriz kits baseada na coluna são recomendados para a alta qualidade, purificado de DNA. Segui o protocolo de fabricantes em conformidade.</li>
	<li>
Em vitro transcrever DNA utilizando polymerase T7, seguindo o protocolo do fabricante.</li>
	<li>Purificar e eluir RNA em 30 µ l de água livre de RNase/DNase usando um kit de purificação baseada na coluna de ácidos nucleicos de rotação sílica-matriz seguindo o protocolo do fabricante.</li>
	<li>Execute a desnaturação electroforese do gel do agarose usando formaldeído para confirmar o tamanho do produto final do RNA. Ver etapas 1.13-1,22 abaixo 14. (Figura 1).</li>
	<li>Preparar o gel por aquecimento de 1 g agarose em 72 mL água até dissolver e, em seguida, fixe a 60 ° C.</li>
	<li>Prepare-se 10 X MOPS executando tampão adicionando MOPS 0,4 M (pH 7,0), acetato de sódio 0,1 M e 0,01 M EDTA.</li>
	<li>Adicione 10 mL de 10 X MOPS executando o buffer e 18 mL de formol 37% (12,3 M) para a solução de agarose refrigerado.</li>
	<li>O gel derramando a solução de agarose em um recipiente de formar gele de casta. Use um pente grande o suficiente para acomodar 10 µ l. Depois de gel tem conjunto e é firme ao toque, retire com cuidado o pente.</li>
	<li>Montar o gel no tanque de electroforese e adicionar suficiente 1 X MOPS executando reserva, garantindo que o gel está completamente coberto.</li>
	<li>Prepare a amostra de RNA adicionando 1 µ g de RNA para 0,5 volumes X de corante de carregamento que contenham formaldeído.</li>
	<li>Brometo de etídio adicione solução de RNA em uma concentração de 10 µ g/mL.</li>
	<li>Desnature a solução de amostra de RNA em 70 ° C por 5 min.</li>
	<li>Usando-se estéril, 10 µ l filtro dicas, carregar 5 µ l de marcador de peso molecular e 5 µ l de RNA amostra em separado poços do gel e electrophorese em 5 V/cm até que a tintura tem migrado pelo menos dois terços do comprimento do gel.</li>
	<li>Visualize o RNA no gel um iluminador de trans de UV. Certifique-se do que RNA é o tamanho correto, comparando com o marcador de peso molecular.</li>
	<li>Para medir a concentração e a pureza do RNA, transferi 1,2 µ l de RNA purified usando estéril 10 µ l filtro dicas em um espectrofotômetro UV. Observe que o RNA de alta qualidade deve ter relações de absorvância de A260/280 (1.8-2.2) e 260/230 (> 1.7) respectivamente.</li>
	<li>Usando o RNA purified restante de 10 µ l filtro dicas, alíquotas estéril 0,5 µ l centrifugar os tubos (3-5 µ l/tubo). Armazenar os tubos a-80 ° C até que esteja pronto para o microinjection. Nota: Uma concentração final de injeção de 500 ng / µ l é um ponto de partida ideal. Recomenda-se diluir o RNA 1:2 em RNase H20 antes da microinjeção para reduzir a viscosidade do RNA em pipeta de microinjeção de grátis.</li>
</ol>2. cinetócoro Microtubule-acessório de ensaio
<ol><li>Divida oócitos em grupos iguais para o microinjection. Nota: Coleção de oócito, transferência, microinjeção e maturação meiose tem sido descrito em detalhes em Júpiter anteriormente 15.</li>
	<li>Microinjeção de um grupo com mRNA experimental e o outro grupo (s) com o controle WT e PBS ou Gfp mRNA. Nota: 500 ng / µ l é a concentração de injeção recomendada para começar com 10. Um picoinjector pode ser usado para controlar quantidades de injeção. Recomenda-se um volume de injeção de 5-10 pL 15.</li>
	<li>Utilizando uma mão ou boca aparelho pipetagem operado, onde o vidro Pipetar abertura é ligeiramente maior que o diâmetro de um oócito (100-150 µm), oócitos de transferência em uma gota de 100 µ l do meio de cultura livre de milrinona em uma placa de Petri coberto de embrião óleo mineral de qualidade e incube-os oócitos para 7 h a 37 ° C em 5% C02 para permitir a maturação suficiente para metáfase da meiose eu (-se) 15.</li>
	<li>Após a incubação, usando o mesmo aparelho de pipeta como acima, transferência de oócitos em um prato de cultura do centro-bem órgão contendo 700 µ l de meio de coleção mídia essencial mínimo pre-refrigerados (MEM) no centro bem e 500 µ l H20 no anel exterior e Coloque o prato no gelo por 7 min. Nota: É aconselhável pre-chill mídia MEM e centro bem pratos de cultura órgão a-20 ° C durante pelo menos 20 min antes do tratamento de ovócitos.</li>
	<li>Corrigi os oócitos por transferi-los usando o aparato da pipeta em um poço de uma placa de vidro desobstruído local contendo 400 µ l de 2% paraformaldeído em 1X PBS por 20 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Mesmo usando Pipetar aparelhos, transferência de oócitos em outro poço num prato local contendo 400 solução de bloqueio µ l (PBS + 0,3% BSA + 0,01% Tween-20 + 0,02% NaN3) e loja a 4 ° C até que esteja pronto para processar por imunocoloração. Nota: para armazenar oócitos a 4 ° C, tampa de vidro placa local com parafilm para evitar a evaporação.</li>
	<li>Usando o mesmo aparelho de pipeta, oócitos de transferência para um novo poço em um ponto da placa contendo solução de permeabilização 400 µ l (PBS + 0,3% BSA + 0,1% TritonX-100 + 0,02% NaN3) e incubam a temperatura ambiente por 20 min. de oócitos de transferência rapidamente através de três gotas de 400 µ l obstrui a solução para remover os resíduos de detergente. Nota: Uma placa de vidro desobstruído 9-poço local funciona bem para mover grupos através de vários tratamentos em um único prato (etapas 2.4-2.5).</li>
	<li>Execute os demais procedimentos de imunocitoquímica em uma câmara umidificada, protegido da luz em temperatura ambiente. Uso um recipiente de plástico de tamanho médio forrada com toalhas de papel húmido e cubra com papel alumínio.</li>
	<li>Usando o aparelho de pipeta, transferência de oócitos para 30 µ l obstrui a solução sobre a tampa de uma placa de 96 poços e lugar dentro da câmara umidificada por 10 min. Nota: Gotas são colocadas nos circulares recuos na placa.</li>
	<li>Para rotular centrómeros e o eixo, usando o aparato de pipeta, transferência de oócitos para 30 µ l obstrui a solução contendo o antígeno anti-DNA (ACA, crista) (01:30) e antiacetilado tubulina (1: 1000) e incube pelo menos 1 h.</li>
	<li>Enxágue oócitos por transferência através de gotas de três 30 µ l de obstrui a solução durante 10 minutos cada.</li>
	<li>Usando o aparelho de pipeta, transferência de oócitos para um 30 µ l gota de solução de bloqueio contendo anticorpos secundários cortesia para os anticorpos usados acima (anti-humano IgG 1: 200, 1: 200 do anti-rato IgG) e incube por 1h.</li>
	<li>Repita as etapas de lavagem 3, 10-min em 30 µ l obstrui a solução conforme descrito na etapa 2.11.</li>
	<li>Transferência de oócitos, usando o aparelho de pipeta, em 3-5 µ l montagem médio contendo DAPI (5,9 µ g / µ l) sobre uma lâmina de vidro de microscópio.</li>
	<li>Coloque 4 gotas pequenas (tamanho de uma cabeça de alfinete) de vaselina nos cantos da lamínula para evitar o esmagamento de oócitos.</li>
	<li>Coloque delicadamente o lado de vaselina deslizamento da tampa para baixo para o slide.</li>
	<li>Selo da lamela bordas com esmalte transparente e deixe para secar por 5 min.</li>
	<li>Armazenar slides a 4 ° C, protegido da luz, até o processamento através de microscopia confocal. Nota: Certifique-se o índice de refração do meio de montagem e lamela, correspondências os objectivos do microscópio a ser utilizados. Montagem de recomendados materiais anteriormente tem sido descrito 15.</li>
	<li>Imagem de oócitos usando um objectivo de x 40-63 em um microscópio confocal, capturando pequenos passos (≤ 1 µm) no plano z, otimizado para o objetivo do trabalho e a imagem toda a região do fuso da metafase. Nota: Certifique-se de todos os 3 canais com base em anticorpos secundários específicos utilizados na etapa 2.11 de imagem. Imagem média ≥ 4 e um zoom de 3 é ideal para a resolução adequada. Um tamanho de passo 1 µm fornece visualização clara dos microtúbulos e cinetócoros em oócitos de rato. O procedimento para a captura de imagem irá variar de microscópio para microscópio. Por favor, consulte o guia de usuário confocal de fabricantes para etapas específicas sobre como definir configurações de microscópio.</li>
	<li>Identifica o status de acessório de cinetócoro-microtubule usando software de imagem seguindo passos 2.21-2,23 abaixo. Nota: As seguintes etapas descrevem esse procedimento usando o software para download gratuito de imagem J (NIH), no entanto, o software alternativo de imagens pode ser usado. Status de acessório tipos anteriormente foram definidas 16 .</li>
	<li>Abrir imagem arrastando o arquivo para a barra de ferramentas imagem J.</li>
	<li>O z-série aberto, certifique-se de todos os canais visíveis (DNA, cinetócoro e eixo), clicando em "mesclar canais", disponível no menu drop-down "imagem", "cor" na guia sub.</li>
	<li>Utilizando o toggle na parte inferior da imagem, percorrer cada fatia-z e determinar a penhora de microtubule cinetócoro. Acessório de detalhadas descrições foram previamente descrito 16
</li>
</ol>3. ensaio de desafio de alinhamento de cromossomo
<ol><li>Usando o aparelho de pipeta, conforme descrito na etapa 2.3, transferência de oócitos em uma gota de 100 µ l do meio de cultura livre de milrinona sob óleo e incubar oócitos para 7 h permitir a maturação suficiente para metáfase da meiose eu (-se) como descrito anteriormente na etapa 2.3 17 . Nota: Procedimentos de coleção, microinjeção e maturação do oócito foram descritos anteriormente, 15. Consulte o protocolo de ensaio do apego em passos 2.1-2.2 para controles e para as concentrações de microinjeção de RNA.</li>
	<li>Usando o mesmo aparelho de pipeta, transferência de oócitos para uma cultura de centro-bem órgão prato contendo meio de cultura de 700 µ l contendo monastrol [100 µM] no centro bem e 400 µ l H20 no anel circundante e incubam a 37 ° C por 2 h.</li>
	<li>Lavar monastrol pela transferência de oócitos, usando o aparato de pipeta como acima, através de três gotas de meio de cultura CZB de 100 µ l e depois transferir os oócitos para um prato de cultura centro-bem órgão novo contendo 700 µ l meio de cultura + MG132 [5 µM] para 3h no centro anel. Adicione 400 µ l H20 para o anel exterior.</li>
	<li>Corrigi os oócitos transferindo-os, usando o aparelho de pipeta, num poço de uma placa de ponto de vidro transparente contendo 400 paraformaldeído µ l 2% em PBS por 20 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Após a fixação, transferência de oócitos, usando o aparelho de pipeta, em um novo poço de uma placa de ponto de vidro transparente contendo 400 µ l solução de bloqueio e loja a 4 ° C até processados por imunocoloração. Nota: para armazenar oócitos a 4 ° C, tampa de vidro placa local com parafilm para evitar a evaporação.</li>
	<li>Permeabilize e rotular oócitos através de imunocitoquímica, conforme descrito nas etapas 2.6-2.16.</li>
	<li>Oócitos usando um objectivo de x 40-63 em um microscópio confocal, captura de imagem < 1 µm passos no plano z certificando-se de toda a região do fuso da metafase da imagem.</li>
	<li>Para identificar o alinhamento do cromossomo status de abrir arquivos de imagem usando o software de imagem. Nota: As seguintes etapas descrevem esse procedimento usando o software para download gratuito de imagem J (NIH), no entanto, o software alternativo de imagens pode ser usado.</li>
	<li>Arraste a imagem no painel de controle de imagem J.</li>
	<li>O z-série aberto, use a ferramenta de ponto (disponível clicando no ícone de ferramenta do ponto na barra de controle de imagem J) para marcar pontos no final de cada polo do fuso em seu respectivo z-fatia colocando a ferramenta sobre o polo do eixo da imagem e clicando na imagem. Adicione estes pontos para a região de Gerenciador de interesse (ROI) pressionando Command + t no teclado.</li>
	<li>Determine as coordenadas específicas para cada uma das posições definidas na etapa 3.10 destacando o ponto específico no Gerenciador de ROI e clicando no botão de medida. Isto proporcionará um resultados contendo a tabela x e y coordenadas para cada ponto. Estes serão os pontos X1, Y1 e X1, Y2, respectivamente.</li>
	<li>Em seguida, determine a coordenada Z de verdade. Isto é feito multiplicando o número de fatia da z-fatia específica na z-pilha na qual foi identificado o polo do eixo (ou seja, fatia #2 de 6) cada ponto individual está em, a espessura da pilha (ou seja, 1 µm) (exemplo: cortar 2 x 1 µm = 2). Estes serão os pontos Z1 e Z2, respectivamente.</li>
	<li>Determinar o comprimento do fuso, usando a equação do teorema de Pitágoras (a2 + b2 = c2) usando o definidos anteriormente x, y e z as coordenadas da escadaria 3.11-3.13. Para cada eixo, o comprimento final é igual a: √((x1-x2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2)</li>
	<li>Determine a midzone do eixo. Isto é calculado como a metade do comprimento do fuso. Usando a ferramenta de linha de imagem J, clicando no ícone de linha na barra de ferramentas imagem J, desenhe uma linha que vai de um polo do eixo do midzone do eixo. O comprimento será exibido na barra de ferramentas imagem J.</li>
	<li>Determine o status de alinhamento do cromossomo, avaliando a distância de cromossomo do midzone eixo usando a ferramenta de medição da linha. Usando a ferramenta de linha disponível clicando no ícone de linha na barra de ferramentas imagem J, desenhe uma linha de midzone do eixo para o cromossomo. O comprimento será exibido na barra de ferramentas imagem J. Maiores que 4 µm de midzone do eixo de cromossomos são considerados desalinhada 18.</li>
</ol>

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<li>Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+spindle+assembly+mechanisms+with+monastrol%2C+a+small+molecule+inhibitor+of+the+mitotic+kinesin%2C+Eg5%5BTitle%5D)+AND+%22Eg5.+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin, Eg5.</a> Eg5. J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).</li>
<li>Jones, K. T., Lane, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+causes+of+aneuploidy+in+mammalian+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs.</a> Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).</li>
<li>Fellmeth, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+characterization+of+three+Aurora+kinase+C+splice+variants+found+in+human+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes.</a> Mol Hum Reprod. 21 (8), 633-644 (2015).</li>
<li>Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+cold-stable+kinetochore+fiber+in+metaphase+PtK1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells.</a> Chromosoma. 84 (1), 145-158 (1981).</li>
<li>Brunet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetochore+fibers+are+not+involved+in+the+formation+of+the+first+meiotic+spindle+in+mouse+oocytes%2C+but+control+the+exit+from+the+first+meiotic+M+phase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase.</a> J Cell Biol. 146 (1), 1-12 (1999).</li>
<li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+and+transcriptional+activation+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Devido a rápida e crescente identificação do humanas variantes genéticas associadas com a doença, é essencial que os sistemas são estabelecidos para avaliar seu significado biológico. Compreensão da função das proteínas na meiose humana coloca desafios específicos porque oócitos humanos são preciosos e raras e humana de esperma não é passíveis de manipulação genética. Oócitos mouse são um sistema de modelo mamíferos valioso para avaliar o gene humano meiótica função 10,<sup class="xref"...

Infertilidade é uma condição que afeta 10-15% da população humana da idade reprodutiva 1, dos quais quase metade procura tratamento médico 2. Embora a etiologia da infertilidade é diversa e em muitos casos multifatoriais, a anomalia genética mais comum em seres humanos é embrionário aneuploidia 3. Aneuploidia é definida como o desvio (ganho ou perda) do número correto de cromossomos em uma célula. O fenômeno de aneuploidia em embriões humanos é comum e aumenta com a idade materna avançada, 4,5. Quatro ensaios controlados randomizados evidenciaram o benefício da seleção de embriões (euploid) apenas cromossomicamente normais para transferência uterina porque esta estratégia resultou na implantação de aumento de taxas, menores taxas de aborto e um menor tempo para alcançar a gravidez 6,7,8,9. Portanto, compreender a etiologia da aneuploidia humana pode ter implicações importantes na reprodução assistida.
Embora o teste genético pré-implantação para aneuploidies é benéfica em tratamentos de infertilidade, continua a faltar uma compreensão completa de como originou aneuploidies. É amplamente aceito que existe uma correlação positiva de aneuploidies meióticas (originou-se durante a produção de gametas) e a idade materna, no entanto, algumas taxas de aneuploidia embrionário presente mulheres que desviam a taxa média para sua idade determinada 4. Estes casos sugerem que idade sozinha nem sempre é preditiva do risco de gerar um embrião aneuploid. Outros fatores podem desempenhar um papel no aumento do risco de aneuploidia embrionária, tais como variantes do gene.
Um aspecto fundamental de investigar o potencial de contribuição de uma variante do gene de aneuploidia durante a meiose oócito é projetar um sistema para avaliar rapidamente a função do gene meiótica. Devido a restrições éticas e acesso limitado, é impraticável para realizar esses experimentos usando ovos humanos. Estas questões podem ser contornadas usando oócitos de rato, e aqui uma série de ensaios para avaliar a função do gene humano durante a meiose são descritos. Por microinjecting a codificação do RNA mensageiro (mRNA) para a variante do gene de interesse, a localização da proteína humana no ovo do mouse pode ser visualizada e usada para determinar se a expressão ectópica da proteína humana tipo selvagem e mutante resulta em qualquer alterações fenotípicas que poderiam levar à aneuploidia. Estes fenótipos incluem um aumento no microtúbulos que anexar para o inadequado à irmã cinetócoro e a incapacidade de apoiar o alinhamento de cromossomos em metáfase da meiose I. importante, este protocolo pode ser usado para investigar tanto ganho e perda de função variantes genéticas através do estabelecimento de condições experimentais específicas para desafiar os principais eventos na meiose oócito tais como eixo de alinhamento edifício e cromossomo 10.

<table><tbody><tr><td>Tubo de PCR Seal-Rite de 0,2 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1602-4300</td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0313</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0243</td><td></td></tr><tr><td>6X DNA loading Dye</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Placa de ponto de vidro de 9 poços</td><td>Thomas Scientific</td><td>7812G17</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-fluor-568 conjugado anti-rato IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21050</td><td>diluição 1:200</td></tr><tr><td>Alexa-fluor-633 conjugado anti-humano IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21091</td><td>diluição 1:200</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>VWR</td><td>AA0356</td><td></td></tr><tr><td>Tabela antivibração</td><td>Technical Manufacturing Corp</td><td></td><td>qualquer modelo padrão</td></tr><tr><td>Anti-Tubulina acetilada anticorpo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7451</td><td>1:100</td></tr><tr><td>diution Anti-centromérico (CREST) anticorpo</td><td>Anticorpos Incorporados</td><td>15-234</td><td>1:30 diluição&nbsp;</td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta de barreira (filtro)</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM12635</td><td>Certifique-se de que são compatíveis com sua marca de pipetadores. Estes são compatíveis com pipetadores da marca Eppendorf.&nbsp;</td></tr><tr><td>Meios de cultura desidratados BD Difco: LB Agar, Miller (Luria Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0445-07-6</td><td></td></tr><tr><td>Meios de cultura desidratados BD Difco: LB Broth, Miller (Luria Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0446-07-5</td><td></td></tr><tr><td>Tubo capilar</td><td>Sutter</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de órgãos Center Well</td><td>VWR</td><td>25381-141</td><td></td></tr><tr><td>Tanque</td><td></td> de CO2<td></td><td>Para incubadora</td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Zeiss</td><td></td><td>qualquer modelo padrão</td></tr><tr><td>Centrífuga (Com capacidade de resfriamento)</td><td>Thomas Scientific</td><td></td><td>qualquer modelo padrão&nbsp;</td></tr><tr><td>Vidro de Cobertura 11 x 22 mm</td><td>Thomas Scientific</td><td>6663F10</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas</td> A espessura do <td>Thomas Scientific</td><td>6663-F10</td><td>variará para microscópios específicos</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DEPC H20</td><td>Life Technologies</td><td>AM9922</td><td></td></tr><tr><td>Banho Seco Digital</td><td>Thermo Scientific</td><td>888700001</td><td></td></tr><tr><td>Fácil A alta enzima de clonagem de fidelidade</td><td>Agilent</td><td>600400</td><td>Para clonagem de DNA&nbsp;</td></tr><tr><td>Enzimas para linearização de pIVT</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td>NdeI ou KasI podem ser usadas</td></tr><tr><td>Brometo de Etídio</td><td>Thermo Scientific</td><td>155585011</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Fluorescente&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Qualquer microscópio fluorescente pode ser usado</td></tr><tr><td>Formaldeído (37%)</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>9311</td><td></td></tr><tr><td>Corante de carregamento de RNA de formaldeído Lâminas de</td> microscópio fosco <td>Ambion</td><td>8552</td><td></td></tr><tr><td>(descarregadas) 25X75 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-3</td><td></td></tr><tr><td>Clones</td><td></td><td></td> de cDNA de comprimento total <td>Pode ser obtido de qualquer fornecedor que forneça leitura aberta clones de quadro</td></tr><tr><td>Aparelho de eletroforese em gel</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>qualquer modelo padrão</td></tr><tr><td>Pipetas de Vidro Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-200</td><td></td></tr><tr><td>Globin Forward Primer para pIVT Construct</td><td></td><td></td><td>5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'.&nbsp; Pode ser comprado de qualquer empresa que gere oligonucelotídeos personalizados</td></tr><tr><td>Globin Reverse Primer para pIVT Construct</td><td></td><td></td><td>5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Pode ser comprado de qualquer empresa que gere oligonucelotídeos personalizados</td></tr><tr><td>Segurando pipetas</td><td>Eppendorf</td><td>930001015</td><td>Vacutip</td></tr><tr><td>Câmara Umidificada</td><td></td><td></td><td>Tupperware pode ser usado</td></tr><tr><td>Illustra Ready-To-Go Grânulos RT-PCR</td><td>GE Life Sciences</td><td>27925901</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td></td><td></td><td>qualquer modelo padrão com tecnologia de CO2 e camisa de água</td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Instrumentos</td><td></td> Nikon <td>Qualquer modelo padrão</td></tr><tr><td>Image J (NIH) Software</td><td>NIH</td><td></td><td>Image Analysis Software</td></tr><tr><td>Tampa de placa de 96 poços</td><td>Nalgene Nunc International</td><td>263339</td><td></td></tr><tr><td>Tubo microcentrifgue de baixa adesão de 0,5 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1405-2600</td><td></td></tr><tr><td>MacVector&nbsp;</td><td>Software de análise de sequência</td> <td>MacVector</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Selleckchem</td><td>S2619</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Marcadores de RNA Millenium-Formaldeído&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM7151</td><td></td></tr><tr><td>Milrinona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4659</td><td>Ressuspensão em DMSO a 2,5mM</td></tr><tr><td>Óleo Mineral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td>Usado apenas Monastrol</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8515</td><td>Resuspenso em DMSO a 100 mM</td></tr><tr><td>Bocal</td><td>Biodiseno</td><td>MP-001-Y</td><td></td></tr><tr><td>N2 tanque</td><td></td><td></td><td>para a tabela antivibração</td></tr><tr><td>Nail Polish; Limpar</td><td></td><td></td><td>Qualquer esmalte transparente pode ser usado</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro UV-Vis Microvolume NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>qualquer modelo padrão</td></tr><tr><td>NorthernMax 10X Gel Desnaturante Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>AM8676</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax 10X Running buffer</td><td>Life Technologies</td><td>AM8671</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Running buffer</td><td>Thermo Scnentific</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Prato para Cultura de Órgãos 60x15mm</td><td>Life Technologies</td><td>08-772-12</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Polysciences, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termociclador PCR</td> 577773 Placa de Petri <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4484075</td><td></td></tr><tr><td>139 mm</td> Placa de Petri <td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>501V</td><td></td></tr><tr><td>35 mm</td> Placa de Petri <td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>121V</td><td></td></tr><tr><td>60 mm</td><td>Falcon BD</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Picoinjetor</td><td>XenoWorks Digital Microinjetor</td><td></td><td>qualquer modelo padrão</td></tr><tr><td>Extrator de pipetas</td><td>Flaming-Brown Extrator de micropipetas</td><td>Modelo P-1000</td><td></td></tr><tr><td>plasmídeo pIVT</td><td>AddGene</td><td>32374</td><td>Vetor vazio adequado para a expressão de oócitos.</td></tr><tr><td>Gonadotrofina de Soro de Égua Grávida</td><td>Lee BioSolutions</td><td>493-10</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>purificação de até 20 uL de DNA plasmídico</td></tr><tr><td>QIAquick PCR kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Quikchange II site directed mutagenesis kit</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>200523</td><td>kit de mutagênese para inserções e exclusões</td></tr><tr><td>Quikchange lightning kit de mutagênese dirigida em vários locais</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>210512</td><td>kit de mutagênese para mudanças de local único</td></tr><tr><td>Tesoura (ponta fina)</td> <td>Ferramentas de ciência fina</td><td>14393</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura (ponta média)</td> <td>Ferramentas de ciência fina</td><td>WP114225</td><td></td></tr><tr><td>tubo de microcentrífuga Seal-Rite 1,5 mL</td><td>Aquecedor</td><td></td> de slides USA Scientific 1615-5500 <td></td></tr><tr><td></td><td>qualquer modelo padrão</td>Espectrofotômetro (Nanodrop)<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Estereomicroscópio</td><td></td> Thermo Fisher Scientific ND-ONE-W <td></td></tr><tr><td></td><td>qualquer modelo padrão</td>Eficiência de Subclonagem DH5a Células Competentes Seringa 18265017 Thermo Fisher Scientifc BD Bioscienes 309623 1 ml, 27G(1/2)T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202L T7 mMessage Machine de alto rendimento <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> kit de transcrição de RNA com tampa</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>x-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td> Pinça <td>274348</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>(Ponta fina - Tamanho 5)</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>SN.743.12.1</td><td></td></tr><tr><td>Água Destilada UltraPure Dnase/Rnase-Free</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de Etídio UltraPuro 10mg/mL</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>UVP UV/White lite transiluminador</td><td>Fisher Scientific</td><td>UV95041501</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Montagem Média</td><td>Vector</td><td>Laboratories H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

usando oócitos de camundongo para avaliar a função de genes humanos durante a meiose i

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Aneuploidia embrionária é a genética das principais causas de infertilidade em seres humanos. A maioria destes eventos se originam durante a meiose feminina, e embora positivamente correlacionada com a idade materna, idade sozinha nem sempre é preditiva do risco de gerar um embrião aneuploid. Portanto, variantes do gene podem contabilizar segregação do cromossomo incorreta durante a ovogênese. Dado que o acesso aos oócitos humanos é limitado para fins de pesquisa, uma série de ensaios foram desenvolvidos para estudar a função do gene humano durante a meiose I usando oócitos de rato. Primeiro, o RNA mensageiro (mRNA) do gene e variante do gene de interesse são injetadas em oócitos de rato prendi prófase. Após permitir tempo para expressão, oócitos sincronicamente são liberados na maturação meiose para completar a meiose eu. Marcando o mRNA com uma sequência de um repórter fluorescente, tais como a proteína verde fluorescente (Gfp), a localização da proteína humana pode ser avaliada para além das alterações fenotípicas. Por exemplo, ganho ou perda de função pode ser investigada através do estabelecimento de condições experimentais que desafiam o produto do gene para corrigir erros meióticos. Embora este sistema é vantajoso em investigar a função da proteína humana durante a ovogênese, adequada interpretação dos resultados deve ser realizada, dado que a expressão da proteína não está em níveis endógenos e, se não for controlada por (ou seja batido para fora ou para baixo), homologs murino também estão presentes no sistema.

Após in vitro transcrição RNA de alta qualidade terão uma relação A260/A280 (1.8-2.2) e um ≥1.7 de relação A260/A230 quando medido utilizando um espectrofotômetro. A imagem na Figura 1 mostra a migração do in vitro-produzido RNA em um gel de agarose a desnaturação, após eletroforese. Uma banda que é manchada no padrão ou uma amostra que tem várias faixas de tamanhos pode indicar a contaminação ou degradação da amostra. Em alternativa, várias...

Como as variantes genéticas associadas a doenças humanas começam a tornar-se descoberto, está se tornando cada vez mais importante desenvolver sistemas com os quais rapidamente avaliar o significado biológico dessas variantes identificadas. Este protocolo descreve métodos para avaliar a função do gene humano durante a meiose feminina eu usando oócitos de rato.

Usando oócitos de camundongo para avaliar a função de genes humanos durante a meiose I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

O objetivo geral desta série de ensaios é investigar a função do gene humano durante a meiose I usando oócitos de camundongos. Esses métodos podem ajudar a responder a questões-chave no campo reprodutivo humano, como se há uma predisposição genética para a aneuploidia materna. A principal vantagem dessa técnica é que ela usa oócitos de camundongos como modelo para a meiose de mamíferos, o que é útil devido à inacessibilidade de óvulos humanos para estudos de função gênica.Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando sequenciamos os exomas de mulheres que haviam sido submetidas a tratamentos de fertilização in vitro e cujas taxas de aneuploidia embrionária não podiam ser explicadas pela idade materna. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de análise de imagem são difíceis de aprender e a definição de parâmetros de análise rigorosos é fundamental para o rigor e a reprodutibilidade. Inserir, utilizando uma estratégia de clonagem validada, a sequência codificante completa do gene de interesse na região de clonagem múltipla do vector de transcrição in vitro.Mutagenizar o DNA se gerar polimorfismos de nucleotídeo único ou inserções e deleções, conforme des

using-mouse-oocytes-to-assess-human-gene-function-during-meiosis-i

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Este protocolo ilustra a técnica para extrair óvulos ou embriões em estágio inicial fertilizado do oviduto de camundongos. A capacidade de identificar o infindibulum e inserir uma agulha na extremidade sem corte, é essencial a correta execução do procedimento.

Recuperação de oócitos de camundongos

Ovócitos são propensas a aneuploidia devido a erros na segregação cromossômica durante a maturação meiótica. Aneuplóides ovos pode causar infertilidade, abortos espontâneos ou transtornos de desenvolvimento como a síndrome de Down. Aqui, descrevemos métodos para introduzir materiais de escolha em oócitos e métodos para estudar e avaliar a maturação meiótica ploidia.

Avaliação do mouse microinjeção de oócitos, maturação e ploidia

Aqui, apresentamos um protocolo para esgotamento específico mRNA mediado por siRNA seguido por análise de imunofluorescência para avaliar a formação do fuso meiótico e organização em oócitos de camundongos. Este protocolo é adequado para in vitro esgotamento das transcrições e avaliação funcional dos diferentes fuso e / ou fatores associados à MTOC em oócitos.

Meiotic Avaliação de fuso em oócitos mouse por silenciamento mediado por siRNA

Apresentamos protocolos para coleta, preparação e imagem de oócitos maduros de Drosophila. Esses métodos permitem a visualização do comportamento cromossômico e da montagem e função do fuso durante a meiose.

Técnicas de imagem Prometáfase e Metaphase da meiose I em Fixed<em&gt; Drosophila</em&gt; oócitos

Oogénese nos mamíferos é conhecido por ser propenso a erro, especialmente devido à missegregation do cromossomo. Este manuscrito descreve métodos de preparação de cromatina espalhado para prófase rato, metáfase I e II-encenado oócitos. Estas técnicas fundamentais permitem o estudo de proteínas da cromatina-limite e a morfologia do cromossomo durante a ovogênese mamífera.

Preparações de espalhamento de cromatina para a análise da progressão de oócitos de camundongo da prófase para a metáfase II

Apresenta-se um protocolo otimizado que permite a depleção de centros organizadores de microtúbulos citoplasmáticos em ovócitos de camundongos durante a metáfase I utilizando um laser de femtossegundos no infravermelho próximo.

Ablação a Laser Multifóton de Centros Organizadores de Microtúbulos Citoplasmáticos em Oócitos de Camundongos

O erro na segregação cromossômica é uma característica comum nos ovócitos. Portanto, estudar o ponto de verificação de montagem do fuso dá pistas importantes sobre os mecanismos necessários para produzir ovos saudáveis. O presente protocolo descreve três ensaios complementares para avaliar a integridade do ponto de verificação da montagem do fuso em ovócitos de rato.

Avaliação da Integridade do Ponto de Verificação da Montagem do Fuso em Oócitos de Rato

A manutenção da integridade do genoma do ovócito é necessária para garantir a fidelidade genética no embrião resultante. Aqui, apresentamos um protocolo preciso para detectar quebras de fita dupla de DNA em células germinativas femininas de mamíferos.

Detecção de quebras de fita dupla de DNA em ovócitos de camundongos

Este protocolo fornece uma estrutura experimental para documentar o impacto físico do citoesqueleto na forma nuclear e nas organelas sem membrana interna no sistema oócito de camundongos. A estrutura pode ser adaptada para uso em outros tipos de células e contextos.

Capturando a agitação baseada no citoesqueleto do núcleo do ovócito de camundongo em escalas espaciais

Erros meióticos nas sinapses e recombinação são comuns aos oócitos de mamíferos. A análise rigorosa das proteínas envolvidas nesses processos é essencial para entender como e por que a oogênese geralmente dá errado. As técnicas apresentadas aqui permitem o monitoramento abrangente da recombinação e sinapses para avaliar a qualidade do oócito em camundongos.

Preparação de Spreads Cromossômicos Meióticos de Oócitos de Camundongos para Avaliação de Sinapse e Recombinação

Aprenda a avaliar a função de genes humanos durante a meiose I utilizando oócitos de camundongo como modelo. Este método permite investigar predisposições genéticas para aneuploidia materna em estudos de biologia reprodutiva.

Usando oócitos de camundongo para avaliar a função de genes humanos durante a meiose I

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