Isolamento di cellule deciduali umane primarie dalle membrane fetali del termine intempestivo della placenta
30 aprile 2018
Questo protocollo viene illustrato un metodo per l'isolamento di cellule deciduali umane primarie raccolti da membrane fetali di placente di termine che possono essere utilizzate per una varietà di applicazioni (cioè immunocitochimica, citometria a flusso, ecc.) con l'obiettivo per studiare il ruolo delle diverse popolazioni cellulari in complicazioni di gravidanza.
L'obiettivo generale di questo protocollo di isolamento cellulare è quello di sviluppare un metodo per isolare le cellule deciduali primarie con una vitalità cellulare finale ad alto rendimento. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della riproduzione umana, come il ruolo delle latifoglie nell'impianto di blastocisti e nell'inizio del travaglio. Può anche fornire informazioni su varie patologie legate alla gravidanza.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un metodo efficace in termini di tempo e costi per l'isolamento di cellule deciduali primarie con rese finali ad alta vitalità. Per iniziare, lasciare cinque provette da 50 millilitri su una griglia e due flaconi di HBSS e HBSS nella cappa aspirante. Quindi pipettare 25 millilitri di HBSS nella provetta opportunamente etichettata.
Quindi, stendere i pannolini sovrapposti nella cappa aspirante. Quindi, estrarre il termine placenta dal contenitore e posizionarlo nella cappa aspirante. Posizionare la placenta sul pannolino con il lato materno rivolto verso l'alto.
Se la placenta è con il lato materno rivolto verso il basso, usa un pannolino aggiuntivo per capovolgere la placenta. Cerca il punto di rottura della membrana e pratica delle incisioni usando forbici e pinze per consentire alla membrana di aprirsi e adagiarsi sulla superficie della cappa aspirante. Quindi utilizzare un raschietto cellulare per raschiare delicatamente il tessuto deciduale dal corion.
Trasferire il tessuto in una provetta da 50 millilitri contenente 25 millilitri di HBSS Ricordate di raccogliere anche piccoli coaguli di sangue, poiché anche questi contengono alcune cellule deciduali. Agitare delicatamente la provetta da 50 millilitri per lavare il tessuto raccolto, quindi passare il tessuto attraverso un setaccio metallico da 250 micrometri. Ripetere il processo di lavaggio due volte con HBSS seguito da due lavaggi con HBSS in tubi nuovi.
La contaminazione da chorion è facilmente visibile grazie alla sua forma filiforme e al colore più chiaro e può essere rimossa dopo il lavaggio. Dopo il lavaggio, porre il tessuto in una provetta sterile da 50 millilitri contenente 20 millilitri di soluzione di digestione enzimatica per digerire l'intera decidua ottenuta dall'intera membrana fetale a termine. Utilizzare un film di paraffina per sigillare il tappo del tubo.
Quindi incubare la provetta a 37 gradi Celsius in un bagno d'acqua agitante. Impostare il timer su 20 minuti. Una volta terminata l'incubazione, rimuovere il film di paraffina.
Utilizzare etanolo al 70% per sterilizzare la superficie del tubo contenente il tessuto digerito e posizionarlo sotto la cappa aspirante. Agitare brevemente il tubo. Successivamente, passare la sospensione cellulare attraverso un setaccio metallico in un nuovo contenitore sterile per campioni.
Diluire la sospensione cellulare con un volume uguale di terreno di coltura per fermare la reazione enzimatica. Trasferire la sospensione cellulare in un nuovo tubo da 50 millilitri. Quindi centrifugare le celle a 420 G per 11 minuti a quattro gradi Celsius.
Se necessario, mettere il tessuto rimanente non digerito in una nuova provetta da 50 millilitri contenente 20 millilitri di soluzione fresca di digestione enzimatica e ripetere il processo di digestione. Se la digestione viene eseguita una seconda volta, lasciare il primo tubo con la sospensione cellulare sul ghiaccio. Una volta completata la seconda digestione, combinare entrambe le sospensioni cellulari.
Dopo la centrifugazione, aspirare con cura il surnatante. Potrebbe essere necessaria una pipetta manuale per rimuovere il surnatante. Quindi, risospendere il pellet della cella nel tampone di lavaggio.
Dopo aver lavato le celle, ripetere il processo di centrifugazione. Al termine del processo di centrifugazione, aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di tampone di lavaggio e 35 millilitri di tampone di lisi eritrocitaria. Per lisare i globuli rossi, agitare brevemente la provetta all'inizio e alla fine dell'incubazione.
Quindi, incubare la sospensione cellulare su ghiaccio per 20 minuti. Dopo l'incubazione, ripetere il processo di centrifugazione. Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 40 millilitri di tampone di lavaggio, quindi passare le celle attraverso un filtro di nylon da 70 micrometri per escludere i grumi di cellule.
Ripetere il processo di centrifugazione. Aspirare il surnatante una volta terminata la centrifugazione. Quindi risospendere il pellet cellulare in 10 millilitri di terreno di coltura.
Contare il numero di cellule con un emocitometro utilizzando il metodo di esclusione del colorante blu di tripano. Al fine di determinare la composizione del tipo di cellula della popolazione cellulare deciduale, è stata sviluppata una strategia di gating con citometria a flusso con imaging multicolore. L'analisi mostra l'esclusione di doppietti cellulari e detriti cellulari utilizzando il gating seriale.
Una volta ottenuta una popolazione di singole cellule priva di detriti, la vitalità cellulare viene determinata utilizzando un colorante di vitalità fissabile. L'analisi dimostra l'80% di vitalità della popolazione totale di cellule deciduali, indicata dal gating blu. Successivamente, le cellule deciduali isolate vengono colorate con anticorpi monoclonali di topo coniugati con fluorofori.
Questo per analizzare la presenza di marcatori cellulari stromali, immunitari, epiteliali e trofoblastici e del colorante di vitalità. Questi marcatori determineranno i tipi di cellule deciduali. Le immagini fluorescenti della citometria a flusso dimostrano una cellula colorata positivamente per tutti e quattro i marcatori e il colorante di vitalità.
Questi marcatori vengono quindi utilizzati per determinare la percentuale di ciascun tipo di cellula nella popolazione di cellule deciduali. È interessante notare che le cellule stromali Vimentina positive costituiscono la più alta popolazione di cellule, mentre non ci sono praticamente cellule del trofoblasto. Questi risultati dimostrano la purezza e l'elevata vitalità delle cellule deciduali umane primarie isolate.
Qui, i dot plot ottenuti mostrano il gating per le popolazioni di tipi cellulari positivi. I controlli fluorescenti meno uno vengono utilizzati per controllare con precisione le vere popolazioni cellulari deciduali positive. Successivamente, le immagini di microscopia confocale a disco rotante catturate vengono utilizzate per convalidare i risultati della citofluorimetria dimostrando che la popolazione di cellule deciduali è composta principalmente da cellule stromali Vimentina positive senza contaminazione cellulare del trofoblasto.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in tre ore. Seguendo questa procedura, le cellule deciduali possono essere analizzate in vari modi per esaminare l'espressione genica e proteica, il che può aiutarci a comprendere meglio i cambiamenti cellulari che si verificano nelle complicanze della gravidanza.
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Panoramica
Questo protocollo illustra un metodo per isolare cellule deciduali primarie umane dalle membrane fetali di placenti a termine. Questa tecnica è applicabile a vari studi relativi a complicanze della gravidanza.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Riproduzione umana
- Biologia cellulare
- Complicanze della gravidanza
Sfondo
- Le cellule deciduali svolgono un ruolo cruciale nell’impianto del blastociste.
- La comprensione di queste cellule può fornire informazioni sull’avvio del parto.
- Questo metodo mira a migliorare la vitalità cellulare e il rendimento.
- Permette di affrontare domande fondamentali in tema di salute riproduttiva.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo ad alto rendimento per l'isolamento di cellule deciduali primarie.
- Facilitare la ricerca sulle patologie correlate alla gravidanza.
- Migliorare la comprensione delle funzioni delle cellule deciduali.
Metodi Utilizzati
- Isolamento di cellule da placenti a termine.
- Utilizzo di HBSS per la preparazione delle cellule.
- Applicazione di immunocitochimica e citometria a flusso.
- Protocolli economici e rapidi per la valutazione della vitalità cellulare.
Risultati principali
- Elevata resa e vitalità delle cellule deciduali isolate.
- Applicazione riuscita in diverse configurazioni sperimentali.
- Conoscenze acquisite sul ruolo delle cellule deciduali nella gravidanza.
- Potenzialità per ulteriori ricerche sulle complicanze della gravidanza.
Conclusioni
- Questo metodo è efficace per l'isolamento di cellule deciduali primarie.
- Apre nuove prospettive per la ricerca nella riproduzione umana.
- Studi futuri potranno sfruttare questa tecnica per ottenere approfondimenti più dettagliati.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento di cellule deciduali primarie umane permette un'analisi meccanicistica delle interazioni stromali-immunitarie fondamentali per il successo dell'impianto e per il tempo del parto. Questo metodo supporta l'identificazione degli obiettivi terapeutici nel campo della riproduzione fornendo un sistema umano fisiologicamente rilevante per valutare la modulazione delle cellule stromali e le vie di reclutamento dei leucociti. Preparazioni ad alto rendimento e a bassa contaminazione facilitano lo screening riproducibile di composti mirati alla deciduazione o a cascate infiammatorie associate al parto pretermine e alla preeclampsia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente la validazione funzionale di bersagli stromali e immunitari coinvolti nel rimodellamento deciduale e nella segnalazione delle citochine.
- Valore operativo: Fornisce un sistema purificato di cellule primarie con una composizione definita di cellule stromali (55-60%) e leucociti (35%) per studi sull'interazione con i bersagli.
- Valore predittivo: Permette la verifica di ipotesi riguardo ai percorsi che regolano la ricettività del blastocisti e l'inizio del travaglio, utilizzando tessuto umano ottenuto da gravidanze a termine.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera cellule deciduali vitali (80% di vitalità) adatte all'immunofenotipizzazione multiplex e a saggi funzionali.
- Valore operativo: Permette la preparazione standardizzata di cellule stromali e immunitarie deciduali per lo screening ad alto contenuto di modulatori della deciduazione.
- Prontezza del saggio: Produce una sospensione cellulare con basso contenuto di contaminanti (<1% epiteliali, 0,01% trofoblasti), ideale per il rilevamento finale basato sulla citometria a flusso.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega la scoperta alla valutazione preclinica fornendo cellule deciduali umane di termine per modellare stati patofisiologici.
- Valore operativo: Permette l'analisi dose-risposta di composti mirati alla secrezione da parte delle cellule deciduali di fattori ormonali e infiammatori.
- Continuità traslazionale: Consente l'esame del contributo specifico di determinati tipi cellulari alle complicanze della gravidanza, come la preeclampsia e la restrizione della crescita intrauterina.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta in cui la validazione dell'obiettivo richiede cellule stromali e immunitarie umane primarie in un contesto di tessuto riproduttivo, consentendo il passaggio dall'individuazione dell'obiettivo alla riduzione del rischio meccanicistico.
- Biologia della scoperta: Supporta l'analisi della comunicazione crociata tra cellule stromali deciduali e cellule immunitarie nei percorsi di impianto e parto.
- Screening: Fornisce cellule primarie vitali e standardizzate per lo sviluppo di saggi mirati alla funzione delle cellule deciduali.
- Analisi: Consente letture multiparametriche mediante citometria a flusso per valutare la vitalità cellulare, il fenotipo e gli stati di attivazione.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati meccanicistici ottenuti con cellule deciduali isolate ai fenotipi clinici dei disturbi della gravidanza.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un protocollo di isolamento scalabile per un uso ripetuto in progetti di scoperta e preclinici nel campo della salute femminile.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi utilizzando cellule deciduali umane primarie con una composizione stromale e immunitaria definita.
- Valore operativo: Offre un processo di isolamento efficace in termini di tempo e costi, con resa elevata e minima contaminazione da corion.
- Valore strategico: Riduce il rischio biologico nelle terapie riproduttive consentendo una valutazione precoce degli effetti dell'obiettivo sulla funzione delle cellule deciduali.
- Impatto sul portafoglio: Informa le decisioni di avanzamento o interruzione nei percorsi di salute femminile attraverso la riduzione del rischio meccanicistico di obiettivi stromali e immunitari.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione di tessuti primari, digestione enzimatica e citometria a flusso.
- Dipende dall'accesso a tessuto placentare a termine e a infrastrutture sterili per colture cellulari.
- Necessita della standardizzazione dei passaggi di lavaggio, setacciatura e lisi per garantire coerenza tra le diverse isolazioni.
- L'adattamento a stadi gestazionali precoci può richiedere un'ottimizzazione dei tempi di digestione e della manipolazione del tessuto.
- È limitato dalla variabilità tra donatori e dalla necessità di un immediato processamento dopo il parto per mantenere la vitalità cellulare.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
0:42
Collection of Decidual Tissue from Term Placental Membranes
1:57
Washing and Enzymatic Digestion of the Decidual Tissue
3:56
Generation of Single Cell Suspension
5:22
Results: Use of Flow Cytometry and Immunocytochemistry to Isolate the Primary Human Decidual Cells
7:11
Conclusion
