Name: Magnetico-Activated Cell Sorting strategie per isolare e purificare Synovial cellule staminali mesenchimali liquido derivato da un modello di coniglio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Scopri un protocollo semplice ed economico per isolare e purificare cellule staminali mesenchimali dal liquido sinoviale di conigli usando il MACS. Questo metodo migliora l'efficienza della purificazione cellulare per applicazioni cliniche.

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Questo studio è stato sostenuto finanziariamente dalle seguenti sovvenzioni: il Natural Science Foundation della Cina (n. 81572198; N. 81772394); il fondo per la costruzione di alto livello disciplina medica della Università di Shenzhen (No. 2016031638); il fondamento di ricerca medica della provincia del Guangdong, Cina (No. A2016314); Scienza di Shenzhen e progetti tecnologici (No. JCYJ20170306092215436; No. JCYJ20170412150609690; No. JCYJ20170413161800287; No. SGLH20161209105517753; No. JCYJ20160301111338144).

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità degli orientamenti regionali del comitato etico, e tutte le procedure di animali sono state approvate dal istituzionale Animal Care e di utilizzo Comitato di Shenzhen secondo persone Hospital, Università di Shenzhen.
1. isolare e cultura rbSF-MSCs
<ol><li>
Preparativi per la procedura di animale
	<ol>
<li>Preparare scheletricamente maturo femmina Nuova Zelanda conigli bianchi per la raccolta di rbSF-MSCs. eseguire un esame clinico dei conigli un giorno prima della procedura di anestesia e artrocentesi. Nota: gli esami fisici dovrebbe includere peso (2.0-2.5 kg), sesso (donna) e la temperatura corporea, frequenza respiratoria e frequenza cardiaca. Intervalli di parametro per conigli clinicamente sani sono 30-50 min per tasso di respirazione, 220-280 min per la frequenza cardiaca e 38-39 ° C per la temperatura corporea.</li>
		<li>Veloce gli animali per 6 ore prima dell'anestesia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazioni e procedura per l'anestesia degli animali
	<ol>
<li>Trattenere il coniglio con una gabbia (Vedi Tabella materiali) e poi iniettare 3% di sodio pentobarbital nella vena marginale dell'orecchio ad una dose di 1 mL/kg per l'anestesia generale.</li>
		<li>Posto il coniglio in una confortevole posizione dorsale-recumbent.</li>
		<li>Monitorare la frequenza respiratoria, frequenza cardiaca e temperatura corporea del coniglio durante l'anestesia.</li>
		<li>Usare pomata oftalmologico sui suoi occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.</li>
		<li>Valutare la profondità dell'anestesia seguito classificazione14 di Guedel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione per MSCs isolamento e coltivazione
	<ol>
<li>Per coltivare rbSF-MSCs, preparare 500 mL di terreno di coltura commerciale (Vedi Tabella materiali) completati con supplemento di 10% delle imprese (Vedi Tabella materiali), 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% penicillina-streptomicina.</li>
		<li>Incubare il terreno di coltura a 37 ° C in un bagno d'acqua.</li>
		<li>Preparare 500 mL di soluzione salina tampone fosfato (PBS) per isolamento delle cellule e cellula lavaggio.</li>
		<li>Preparare 100 mL di soluzione salina isotonica per la procedura di artrocentesi cavità del ginocchio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Raccolta di liquido sinoviale articolare dal ginocchio del coniglio
	<ol>
<li>Selezionare un'area di circa 5 x 5 cm di dimensioni intorno al ginocchio e radere i peli di coniglio da questa zona utilizzando un rasoio elettrico di sicurezza.</li>
		<li>In alternativa, disinfettare il sito di procedura 3 x con povidone iodio soluzione e 75% di etanolo. Quindi, applicare teli sterili dopo l'area è completamente asciugato.</li>
		<li>Iniettare 1-2 mL di soluzione salina isotonica, utilizzando una siringa ipodermica sterile (2 mL), in cavità articolare del ginocchio dallo spazio articolare laterale, spostare il ginocchio x 3-4 e poi succhiare tutto il fluido sinoviale a temperatura ambiente.</li>
		<li>Filtrare il fluido sinoviale attraverso un colino di cella di nylon µm 40 per rimuovere eventuali detriti all'interno di 4 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cultura di rbSF-MSCs
	<ol>
<li>Raccogliere il filtrato del fluido in provette centrifuga da 50 mL e centrifugare a 1.500 giri/min per 10 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Eliminare il supernatante dopo la centrifugazione, lavare la pallina con PBS, risospendere il pellet con il terreno di coltura completo e poi piastra il mezzo in piastre da 100 mm.</li>
		<li>Incubare le piastre a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente 5% CO2.</li>
		<li>Dopo 48 h, ricostituire i piatti con medium fresco per rimuovere eventuali cellule non aderenti. Sostituire il mezzo due volte a settimana per 2 settimane come passaggio 0 (P0). Nota: Ci dovrebbe essere circa 1 x 104 cellule aderenti. Cellule/ml praticabile in SF sono circa 2 x 102/ml.</li>
		<li>Dopo 14 giorni che seguono la placcatura iniziale, molte colonie dovrebbero avere formato in piastre di coltura. Selezionare le colonie più grandi di 2 mm di diametro. Mark, dove si trovano le colonie selezionate tracciando loro circonferenza sul fondo piatto.</li>
		<li>Scartare le colonie < 2 mm di larghezza, utilizzando raschietti di cella. Digerire le colonie selezionate con circa 5 µ l di 0,25% tripsina, utilizzando una bomboletta di clonazione e trasferire le colonie un nuovo piatto come passaggio 1 (P1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Post-operatorio cura degli animali
	<ol>
<li>Seguire le procedure operative istituzionali standard per il monitoraggio post-operatorio e recupero dall'anestesia.</li>
		<li>Monitorare i segni vitali del coniglio ogni 10 min fino a quando ha riacquistato coscienza. Infine, è possibile trasferire l'animale cosciente alla gabbia. Non restituiscono un coniglio che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali, finché non ha completamente recuperato.</li>
		<li>Post-operazione, disinfettare il sito con 0,1% povidone iodio, 2 volte al giorno per 3 giorni.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. CD90-positivo magnetico attivato cella ordinamento (MACS) del rbSF-MSCs e coltura primaria
<ol><li>
Preparazione del campione
	<ol>
<li>Quando le cellule raggiungono intorno 80% confluency, aspirare il mezzo e quindi aggiungere 1-2 mL di 0,25% tripsina-EDTA ad ogni piatto.</li>
		<li>Incubare i piatti per 2-3 minuti consentire il distacco delle cellule.</li>
		<li>Una volta che le cellule sono staccate, aggiungere una pari quantità di terreno di coltura per inattivare la tripsina.</li>
		<li>Passare la sospensione cellulare attraverso un colino di cella di 40 µm, raccogliere il filtrato in una provetta da 15 mL e poi girare giù le cellule a 600 × g per 10 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Risospendere il pellet cellulare in Mac con il buffer (PBS, pH 7,2, 0,5% di albumina di siero bovino e 2 mM EDTA) e poi contare il numero di cellulare.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Etichette magnetiche Nota: Ordinare il rbSF-MSCs con una cella magnetico attivato l'ordinamento kit contenente colonne, uno stand e separatori (Vedi Tabella materiali).<ol>
<li>Determinare il numero di cellulare utilizzando un emocitometro.</li>
		<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 300 × g per 10 min a 4 ° C. Completamente aspirare il supernatante.</li>
		<li>Aggiungere 80 µ l di tampone di risospensione per 107 cellule totali.</li>
		<li>Per 107 cellule totali, aggiungere 20 µ l di microsfere coniugate con un anticorpo monoclonale di CD90 anti-coniglio.</li>
		<li>Mescolare le biglie magnetiche e le cellule in modo uniforme nei tubi, poi li Incubare a 4 ° C per 15 min al buio.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di tampone per 107 cellule al tubo e poi lo Centrifugare a 300 × g per 10 min a 4 ° C per lavare le cellule. Eliminare il supernatante dopo la centrifugazione.</li>
		<li>Risospendere il pellet in 500 µ l di tampone per 107 cellule.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Separazione magnetica
	<ol>
<li>Sistemare la colonna con le ali di colonna alla parte anteriore nel campo magnetico del separatore magnetico.</li>
		<li>Lavare la colonna Separatore magnetico (MS) con 500 µ l di buffer per 107 cellule.</li>
		<li>Trasferire la sospensione singola cella nella colonna. Lasciare che le celle negative passano attraverso il campo magnetico per eliminare queste cellule senza etichetta.</li>
		<li>Lavare la colonna 1-2x con 500 µ l di buffer per 107 cellule e scartare il flusso continuo.</li>
		<li>Trasferire la colonna in una provetta da centrifuga (15 mL).</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di tampone per 107 cellule alla colonna e poi immediatamente spingere lo stantuffo nella colonna per scovare le cellule magneticamente con etichetta.</li>
		<li>Ripetere la procedura di cui sopra con un secondo MS Column per aumentare la purezza del CD90+ cellule, che possono arricchire la frazione eluita.</li>
		<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 300 × g per 10 min, aspirare il supernatante e risospendere le con terreno di coltura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cultura del CD90+ rbSF-MSCs
	<ol>
<li>Inoculare le cellule in piastre da 100 mm dopo l'ordinamento magnetico delle cellule attivate.</li>
		<li>Incubare le piastre a 37 ° C in un'incubatrice umidificata cellulare con 5% CO2.</li>
		<li>Quando viene raggiunta la confluenza di 80-90% di colture primarie, a circa 7-10 giorni, digerire le celle aderenti con 0,25% tripsina-EDTA e passaggio a una diluizione di 1:2 a fare passaggio 2 (P2).</li>
		<li>Utilizzare lo stesso metodo per passare alle cellule di passaggio 3 (P3), che possono essere utilizzate per le analisi in vitro . Nota: Dopo la sub-cultura e la purificazione, si ottengono circa 1 x 107 rbSF-MSCs.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. identificazione del rbSF-MSCs
<ol><li>
Conferma di superficie dell'indicatore di rbSF-cellule staminali mesenchimali da citometria a flusso
	<ol>
<li>Quando i MSCs sono 80-90% confluenti a P3, lavare le cellule con PBS e trattarli con 1 mL di 0,25% tripsina-EDTA. Quindi, incubare le MSCs a 37 ° C per 2-3 minuti fino a quando le cellule sono staccate.</li>
		<li>Raccogliere le celle utilizzando 10 mL di PBS, trasferirli in un tubo conico (15 mL) e li Centrifugare a 300 × g per 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Eliminare i sovranatante. Risospendere il pellet cellulare in 500 µ l di PBS e trasferirlo in una provetta da 1,5 mL.</li>
		<li>Incubare una diluizione di 1: 100 di anticorpi coniugati FITC e PE-coniugati (isotipo, FITC-CD34/PE-CD45, FITC-CD105/PE-CD44) per 1 h al buio a 4 ° C.</li>
		<li>Questa miscela a 300 × g per 5 min a temperatura ambiente di centrifugare e lavare le cellule due volte con PBS mediante centrifugazione a 300 × g per 5 minuti ogni volta. Eliminare i sovranatante.</li>
		<li>Risospendere le cellule in 500 µ l di PBS, trasferire la sospensione cellulare in una provetta di turno-fondo (5 mL) e analizzarlo utilizzando un citometro a flusso. Nota: Acquisizione di dati su un citometro dotato di due canali di fluorescenza: 533/30 e 585/40. Per ogni isotipo di fluorescenza, utilizzare il controllo di isotipo per regolare la tensione del laser appropriato e impostare l'intensità minima necessaria per ottenere un istogramma di fluorescenza che Visualizza i bordi destro e sinistro del picco. Raccogliere un minimo di 10.000 eventi per le analisi statistiche.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Al multidifferenziamento delle rbSF-MSC Nota: Uso P3 rbSF-MSCs per le analisi di multidifferenziativo in vitro .<ol>
<li>
Differenziazione osteogenica
		<ol>
<li>Preparare il supporto di induzione osteogenica: DMEM basic (1x) contenente 50 mM di L-ascorbico acido-2-fosfato, α-glicerofosfato di 10 mM e 100 nM di desametasone.</li>
			<li>Le cellule a 103 cellule/cm2 in una piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti di semi e loro cultura nel mezzo di induzione osteogenica.</li>
			<li>Cambiare il mezzo di induzione ogni 3 giorni per 3 settimane.</li>
			<li>Fissare le cellule con formaldeide al 4% per 30 min a temperatura ambiente, una volta completata la differenziazione, macchia le celle con il colore rosso di alizarina 1% per 5 minuti e poi lavare loro 3 x con PBS15.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Adipogenico differenziazione
		<ol>
<li>Preparare il supporto di induzione adipogenico: DMEM basic (1x) composto da 100 mM di indometacina, 10 mg/mL di insulina umana ricombinante, 1 mM di desametasone e 0,5 mM di 3-isobutyl-1-methylxanthine.</li>
			<li>Trattare il P3 rbSF-MSCs per 3 settimane nel medium adipogenico induzione.</li>
			<li>Dopo 3 settimane, macchia i vacuoli di lipidi neutri utilizzando Oil Red O per confermare la differenziazione adipogenico. Fissare le cellule in una soluzione di formaldeide 4% a temperatura ambiente per 30 minuti e poi lavare 3 volte con PBS16.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Differenziazione chondrogenic
		<ol>
<li>Preparare il supporto di induzione condrogenica: DMEM basic (1x) che consiste di 10 ng/mL di TGFβ1, 1% suo supplemento, 0,35 mM di L-prolina, 100 nM di desametasone, 50 mM di L-ascorbico acido-2-fosfato e 1 mM di piruvato di sodio.</li>
			<li>Utilizzare pellet coltura per l'induzione di chondrogenic. Centrifugare 5 × 105 P3 rbSF-MSCs a 1500 rpm per 10 min in un tubo in polipropilene (15 mL) per formare una pallina.</li>
			<li>Per 3 settimane con il mezzo di induzione condrogenica della coltura del pellet.</li>
			<li>Modificare il mezzo ogni 3 giorni per 3 settimane.</li>
			<li>Dopo induzione di 3 settimane, incorporare il pellet cellulare con paraffina, sezione a fette di 4 mm e macchia utilizzando 0.1% blu di toluidina per 30 min a temperatura ambiente17.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Estrazione di RNA totale e l'analisi di reazione a catena della polimerasi in tempo reale quantitativa (qRT-PCR)
	<ol>
<li>Isolare il RNA totale delle cellule dopo induzione di differenziazione di 3 settimane attraverso l'estrazione di RNA commerciale kit (Vedi Tabella materiali).<ol>
<li>Rimuovere il terreno di coltura nella piastra di coltura e quindi aggiungere 1 mL di reagente di isolamento.</li>
			<li>Lisare le cellule pipettando ripetuto finché la soluzione non è omogenea. Incubare a temperatura ambiente per 3 min.</li>
			<li>Trasferire il lysate delle cellule in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.</li>
			<li>Aggiungere 100 µ l di cloroformio, scuoterlo da mano 15x e incubare la miscela a temperatura ambiente per 3 min.</li>
			<li>Centrifugare la provetta a 12.000 × g per 15 min a 4 ° C. Trasferire i surnatanti in un nuovo tubo per microcentrifuga da 1,5 mL.</li>
			<li>Aggiungere 500 µ l di isopropanolo e precipitare il RNA per 10 min a temperatura ambiente.</li>
			<li>Centrifugare a 12.000 × g per 10 minat 4 ° C. La pallina del RNA dovrebbe essere visibile nella parte inferiore del tubo.</li>
			<li>Rimuovere il supernatante e quindi aggiungere 500 µ l di etanolo al 75%. Girare brevemente il tubo per alcuni secondi per lavare la pallina del RNA. E centrifugare a 7.500 × g per 5 min a 4 ° C.</li>
			<li>Rimuovere il residuo dell'etanolo.</li>
			<li>Dissolva la pallina del RNA in 10 µ l di acqua DEPC e posizionare i tubi sul ghiaccio.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Retromarcia trascrivere RNA totale in cDNA con una sintesi di DNA kit (Vedi Tabella materiali). Nota: Eseguire tutte le procedure seguenti sul ghiaccio.<ol>
<li>Preparare il mix master di trascrizione inversa.</li>
			<li>Aggiungere 25 µ l di RNA dnasi-trattati in ogni provetta con 1 µ g di RNA.</li>
			<li>Incubare la miscela alle seguenti temperature utilizzando un termociclatore PCR: 26 ° C per 10 min (per consentire il random esameri tempri), 42 ° C per 45 min (trascrizione inversa) e 75 ° C per 10 min (inattivare la trascrittasi inversa).</li>
			<li>Immediatamente analizzare il cDNA risultante dalla PCR quantitativa in tempo reale, o conservare a-20 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Eseguire l'analisi di espressione genica con un sistema PCR quantitativo in tempo reale.<ol>
<li>Utilizzare qRT-PCR Master Mix (Vedi Tabella materiali) per eseguire la PCR. Gli iniettori PCR per GAPDH, Runx2, Agg e PPARγ sono elencati nella tabella 1.</li>
			<li>Calcolare l'espressione genica utilizzando il metodoΔΔCT 2−.</li>
			<li>Condurre un'analisi statistica utilizzando software statistici standard. Utilizzare un test t per campioni indipendenti per confrontare i mezzi del gruppo.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

L'esistenza di cellule staminali mesenchimali nel liquido sinoviale fornisce un'alternativa per la terapia cellulare. Gli studi precedenti hanno dimostrato che lesioni siti contengono una maggiore quantità di cellule staminali mesenchimali in loro liquido sinoviale, che può essere correlata positivamente con il periodo di alberino-ferita di5. MSCs nel liquido sinoviale può essere favorevole al tessuto per migliorare la guarigione spontanea dopo un infortunio18,<s...

MSCs sono stati suggeriti come una preziosa fonte per la medicina rigenerativa, soprattutto per le lesioni della cartilagine. MSCs, tra cui condrociti, osteoblasti, adipociti, miociti scheletrici e viscerali cellule stromali, largamente espandere le aree per il trapianto di cellule staminali a causa della loro alta espansione tasso e multi-lignaggio differenziazione potenziali1. MSCs può essere isolato dal scheletrico muscolare, synovium, midollo osseo e del tessuto adiposo2,3,4. Risultati hanno inoltre confermato la presenza di cellule staminali mesenchimali nel liquido sinoviale, e precedente ricerca ha identificato MSCs derivato liquido sinoviale (SF-MSCs) come candidati promettenti per rigenerazione articolare5,6.
Tuttavia, ricerca e sperimentazione preclinica su campioni umani sono soggetti a molte questioni etiche. Invece, i conigli sono stati e continuano ad essere il più comunemente usato specie animali per dimostrare che il trapianto di cellule staminali mesenchimali può riparare il danno della cartilagine. Negli ultimi anni, un numero crescente di ricercatori hanno studiato le cellule staminali mesenchimali coniglio (rbMSCs) entrambi in vitro e in vivo, come queste cellule sono simili all'essere umano MSCs nella loro fisiologia biologia e tessuto. Allo stesso modo, il rbMSCs sono in grado di aderire a superfici in plastica, visualizzazione morfologia dell'alberino-fibroblasto come MSCs umane. Inoltre, campioni mesenchymal coniglio sono semplici e facili da ottenere7. Inoltre, i punti più cruciali sono che rbMSCs esprimono marcatori di superficie, quali CD44, CD90 e CD105, e che sia preservata la differenziazione multi-lignaggio potenziale, che è d'accordo con i criteri per l'identificazione delle popolazioni di MSC come definito dalla società internazionale per la terapia cellulare8,9. In particolare, sono in grado di non-ipertrofica Condrogenesi quando indotto dal TGF-β1, rendendoli così fonti di cellule adatto per cartilagine articolare fenotipico rigenerazione10,11, chondroprogenitors fluido sinoviale 12.
Tuttavia, l'isolamento della SF-MSCs è notevolmente diverso da altri tessuti, compreso il cordone ombelicale, il tessuto adiposo, sangue periferico e midollo osseo. Attualmente, gli approcci più comuni per la purificazione e l'ordinamento di SF-MSCs sono citometria a flusso e immunomagnetica ordinamento basato su tallone, anche se il metodo di cytometry di flusso richiede un ambiente specifico e altamente costosi strumenti13.
Questo articolo presenta una procedura per la raccolta semplice e minimamente invasiva di campioni di liquido sinoviale dalla Nuova Zelanda conigli bianchi. Durante la procedura, il rbSF-MSCs sono stabilmente espanse in vitro e quindi isolato con CD90 positive procedure basate su tallone magnetiche. Infine, il protocollo viene illustrato come ottenere MSCs con elevata purezza e vitalità dalle fonti delle cellule raccolte.
In questo protocollo, l'isolato rbSF-MSCs sono caratterizzati base alla loro morfologia, espressione di marcatori specifici e pluripotenza delle cellule staminali. Flusso cytometry-basata immunophenotyping rivela una significativa espressione positiva di CD44 e CD105, mentre l'espressione di CD45 e CD34 è negativo. Infine, un test in vitro per rbSF-MSCs illustra la differenziazione osteogenica, adipogenico e condrogenica di queste cellule.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagenti</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MesenGro</td><td>StemRD</td><td>MGro-500 1703</td><td>Caldo in 37 &deg; C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>MesenGro Integratore</td><td>StemRD</td><td>MGro-500 M1512</td><td>Componente del terreno di coltura MSC</td></tr><tr><td>DMEM basic</td><td>Gibco Inc.</td><td>C11995500BT</td><td>Terreno di differenziazione delle MSC</td></tr><tr><td>Soluzione salina isotonica</td><td>Litai, Cina</td><td>5217080305</td><td>Reagente per la procedura di artrocentesi della cavità</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>HyClone Inc.</td><td>SH30256,01B</td><td>PBS, privo di Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gibco Inc.</td><td>10099-141</td><td>Componente del terreno di coltura MSC Soluzione di</td></tr><tr><td>iodio povidone</td><td>Guangdong, Cina</td><td>150605</td><td>Agente di sterilizzazione</td></tr><tr><td>75% etanolo</td><td>Lircon, Cina</td><td>170917</td><td>Agente di sterilizzazione</td></tr><tr><td>0,25% Tripsina/EDTA</td><td>Gibco Inc.</td><td>25200-056</td><td>Reagente di dissociazione cellulare</td></tr><tr><td>1% Penicillina-Streptomicina</td><td>Gibco Inc.</td><td>15140-122</td><td>Componente del tampone di corsa MACS medio delle MSC</td></tr><tr><td></td><td>MiltenyiBiotec</td><td>5160112089</td><td>Contenente soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), albumina sierica bovina allo 0,5% (BSA) e 2</td></tr><tr><td>microsfere coniugate con anticorpi mMEDTA CD90</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>5160801456</td><td>Per la selezione cellulare attivata magneticamente</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td>Componente delle MSC condrogeniche differenziazione</td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td>Componente della differenziazione osteogenica delle MSC</td></tr><tr><td>ITS</td><td>BD</td><td>354352</td><td>1%, Componente della differenziazione condrogenica delle MSC</td></tr><tr><td>L-prolina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5607</td><td>0,35 mM, Componente della differenziazione condrogenica delle MSC</td></tr><tr><td>Acido L-ascorbico-2-fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td>50 mM, Componente della differenziazione condrogenica delle MSC</td></tr><tr><td>3-isobutil-1-metilxantina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td>0.5 mM, Componente della differenziazione adipogenica</td></tr><tr><td>Indometacina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td>100 mM, Componente della differenziazione adipogenica</td></tr><tr><td>TGF&beta; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>10 ng/mL, Componente della differenziazione condrogenica delle MSC&</td></tr><tr><td>alfa;-gliceroffato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6751</td><td>Componente della differenziazione osteogenica delle MSC</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonale CD34, FITC coniugato</td><td>Bioss</td><td>bs-0646R-FITC</td><td>Marcatore di cellule staminali ematopoietiche</td></tr><tr><td>Membrana di topo CD44</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA806GA</td><td>Thy-1 glicoproteina (marcatore delle MSC)</td></tr><tr><td>CD45 (anticorpo monoclonale)</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA808GA</td><td>Marcatore delle cellule staminali ematopoietiche</td></tr><tr><td>Anticorpo CD105</td><td>Genetex</td><td>GTX11415</td><td>marcatore delle MSC</td></tr><tr><td>Alcool isopropilico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9030</td><td>Precipita l'estrazione dell'RNA fasi organiche</td></tr><tr><td>Triclorometano</td><td>Wengè, Cina</td><td>61553</td><td>Estratto di RNA totale</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>Isolato di RNA totale</td></tr><tr><td>SYBR verde master mix</td><td>Takara Bio, Giappone</td><td>RR420A</td> Kit di sintesi del cDNA <td>per test PCR</td></tr><tr><td></td><td>Takara Bio, Giappone</td><td>RR047A</td><td>Trascritto inversamente su DNA complementare</td></tr><tr><td>Alizarina Red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td>Colorazione di composti di calcio</td></tr><tr><td>Toluidina Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89640</td><td>Colorazione di tessuto cartilagineo</td></tr><tr><td>Olio Soluzione di O rosso</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1391L</td><td>Colorazione del vacuolo lipidico</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Separatore</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-102</td><td>Per la selezione di cellule attivate magneticamente</td></tr><tr><td>MultiStand</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-303</td><td>Per la selezione di cellule attivate magneticamente</td></tr><tr><td>Colonne MS</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-201</td><td>Per la selezione cellulare attivata magneticamente</td></tr><tr><td>Filtro</td><td>cellulare FALCON Inc.</td><td>352340</td><td>40 &mu; m Emocitometro in nylon</td></tr><tr><td></td><td>ISOLAB Inc.</td><td>075.03.001</td><td>Conteggio delle cellule</td></tr><tr><td>Falcon Piatto da 100 mm</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>Piatto per coltura cellulare Provetta</td></tr><tr><td>per microcentrifuga</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>Provette per centrifuga per estrazione RNA e PCR</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91050</td><td>Centrifuga ad</td>alta velocità sterilizzata a raggi</tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>Cella</td></tr> per <tr><td>centrifuga incubatore</td><td>Thermo scientific</td><td>3111</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>PCR in tempo reale Strumento</td><td>Life Tech</td><td></td><td>QuantStudio Reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale</td></tr><tr><td>Citometro a flusso</td><td>BD Biosciences</td><td>342975</td><td>Analizzatore cellulare</td></tr><tr><td>Pipettor</td><td>Eppendorf</td><td>O25456F</td><td>Trasferimento del liquido</td></tr><tr><td>Cilindro di clonazione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3983-50EA</td><td>Isolare e prelevare singole colonie cellulari</td></tr><tr><td>Siringa ipodermica sterile</td><td>Double-Dove, China</td><td>131010</td><td>Procedura di artrocentesi</td></tr><tr><td>Gabbia per conigli</td><td>Zhike, China</td><td>ZC-TGD</td><td>Trattenere il coniglio</td></tr></tbody></table>

magnetico-activated cell sorting strategie per isolare e purificare synovial cellule staminali mesenchimali liquido derivato da un modello di coniglio

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Cellule staminali mesenchimali (MSCs) sono la fonte principale delle cellule per terapia cellulare. MSCs dal liquido sinoviale cavità articolare potrebbero essere utilizzati per l'ingegneria tissutale della cartilagine. MSCs dal liquido sinoviale (SF-MSCs) sono stati considerati promettenti candidati per rigenerazione articolare, e loro potenziale beneficio terapeutico li ha resi un tema di ricerca importante di ritardo. SF-MSCs dalla cavità del ginocchio del coniglio bianco di Nuova Zelanda può essere impiegato come un modello traslazionale ottimizzato per valutare umana medicina rigenerativa. Per mezzo di CD90-base magnetica attivato cella (MACS) tecnologie di differenziazione, questo protocollo ottiene correttamente coniglio SF-MSCs (rbSF-MSCs) da questo modello di coniglio e completamente dimostra ulteriormente il fenotipo MSC di queste cellule inducendo loro di differenziarsi per osteoblasti, adipociti e condrociti. Di conseguenza, questo approccio può essere applicato nella ricerca di biologia cellulare e tissutale utilizzando procedure e attrezzature semplici.

Isolamento, purificazione e la cultura delle rbSF-msc: Questo protocollo utilizza Mac per isolare rbSF-MSCs, basato sull'espressione del marcatore di superficie MSC CD90. Un diagramma di flusso del processo di isolamento, purificazione, dei rbSF-MSCs e la caratterizzazione e il protocollo di coltura in vitro è illustrato nella Figura 1.
Morfologia delle cellule d...

Questo articolo presenta un protocollo semplice ed economico per il semplice isolamento e purificazione delle cellule staminali mesenchimali da liquido sinoviale di coniglio bianco di Nuova Zelanda.

Magnetico-Activated Cell Sorting strategie per isolare e purificare Synovial cellule staminali mesenchimali liquido derivato da un modello di coniglio

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel protocollo di smistamento nel campo delle cellule staminali fornendo una procedura per purificare le cellule staminali mesenchimali direttamente dal liquido sinoviale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che abbiamo stabilito un protocollo semplice ed economico per l'isolamento e la purificazione del MACS dal liquido sinoviale di coniglio. Generalmente nella ricerca, grazie a questo metodo, facciamo grandi sforzi, perché la pluzione della popolazione cellulare dipende dalla produzione di una singola sospensione cellulare.Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo notato che solo il metodo di selezione cellulare attivato magneticamente è attualmente approvato dalla FDA per applicazioni cliniche. Iniziare questa procedura con l'anestesia animale come descritto nel protocollo di testo. Per eseguire la raccolta del liquido sinoviale articolare dal ginocchio del coniglio, selezionare un'area di circa cinque per cinque centimetri intorno al ginocchio.Radere i peli di coniglio intorno a quest'area usando un rasoio elettrico di sicurezza. In alternativa, disinfettare il sito della procedura con una soluzione di iodio povidone e etanolo al 75% tre volte. Quindi, applicare teli sterili dopo che l'area si è completamente asciugata.Utilizzare una siringa ipodermica sterile per iniettare da uno a due millilitri di soluzione salina isotonica nella cavità articolare del ginocchio dallo spazio articolare laterale. Muovi il ginocchio tre o quattro volte, quindi aspira tutto il liquido sinoviale a temperatura ambiente. Filtrare il liquido sinoviale attraverso un colino cellulare in nylon da 40 micron per rimuovere eventuali detriti, entro quattro ore.Per coltivare le SF-MSC di coniglio, raccogliere il fluido filtrato in provette da centrifuga da 50 millilitri e centrifugare a 1.500 giri/min per dieci minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante dopo la centrifugazione e lavare il pellet con PBS. Dopo aver risospeso il pellet con il terreno di coltura completo, impiattare il terreno in piastre da 100 millilitri.Incubare le piastre a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di anidride carbonica. Dopo 48 ore, riempire le pietanze con terreno fresco per eliminare eventuali cellule non aderenti. Sostituire il mezzo due volte a settimana per due settimane come passaggio zero.Dopo 14 giorni dall'impiattamento iniziale, molte colonie dovrebbero essersi formate nei piatti di coltura. Seleziona le colonie di diametro superiore a due millimetri. Segna dove si trovano le colonie selezionate, tracciando la loro circonferenza sul fondo del piatto.Scartare le colonie larghe meno di due millimetri utilizzando raschietti cellulari. Digerire le colonie selezionate con circa cinque microlitri di tripsina allo 0,25% utilizzando un cilindro di clonazione e trasferire le colonie in un nuovo piatto per il passaggio. Quando le cellule raggiungono circa l'80% di confluenza, aspirare il terreno.Quindi, aggiungere uno o due millilitri di tripsina EDTA allo 0,25% a ciascun piatto. Incubare le piastre per due o tre minuti per consentire il distacco delle cellule. Una volta che le cellule sono state staccate, aggiungere una quantità uguale di terreno di coltura per rendere inattiva la tripsina.Passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 micron e raccogliere il filtrato in una provetta da 15 millilitri. Quindi centrifugare le celle a 600 volte G per dieci minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet della cella nel buffer di esecuzione MACS.Per eseguire la marcatura magnetica, determinare il numero di cellule utilizzando un emocitometro. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 volte G per dieci minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver aspirato completamente il surnatante, aggiungere 80 microlitri di tampone di risospensione per dieci milioni di cellule totali.Per dieci milioni di cellule totali, aggiungere 20 microlitri di microsfere coniugate con un anticorpo monoclonale anti-coniglio CD90. Mescolare le perle magnetiche e le celle in modo uniforme nelle provette. Quindi incubarli a quattro gradi Celsius per 15 minuti al buio.Aggiungere un millilitro di tampone per dieci milioni di cellule alla provetta, quindi centrifugare a 300 volte G per dieci minuti a quattro gradi Celsius, per lavare le cellule. Eliminare il surnatante dopo la centrifugazione. Risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone per dieci milioni di cellule.Posizionare la colonna, con le ali della colonna in avanti, nel campo magnetico del separatore magnetico. Sciacquare la colonna del separatore magnetico con 500 microlitri di tampone per dieci milioni di cellule. Trasferire la sospensione a cella singola nella colonna.Lascia che le cellule negative passino attraverso il campo magnetico per scartare queste celle non etichettate. Lavare la colonna una o due volte con 500 microlitri di tampone per dieci milioni di cellule e scartare il flusso. Trasferire la colonna in una provetta da centrifuga da 15 millilitri.Aggiungere un millilitro di tampone per dieci milioni di celle alla colonna. Quindi spingere immediatamente lo stantuffo nella colonna, per eliminare le celle marcate magneticamente. Ripetere la procedura di cui sopra con una seconda colonna di separatore magnetico, per aumentare la purezza delle cellule CD90-positive, che possono arricchire la frazione eluita.Dopo aver centrifugato la sospensione cellulare a 300 volte G per dieci minuti, aspirare il surnatante e risospendere il pellet con il terreno di coltura. Inoculare le cellule in piastre da 100 millilitri dopo la selezione cellulare attivata magneticamente. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius in un incubatore cellulare umidificato con il 5% di anidride carbonica.Quando si raggiunge l'80-90% di confluenza della coltura primaria, a circa sette-dieci giorni, digerire le cellule aderenti con lo 0,25% di tripsina EDTA e farle passare a una diluizione di uno a due per fare il passaggio due. Utilizzare lo stesso metodo per passare le cellule al passaggio tre, che può essere utilizzato per i saggi in vitro. Qui viene mostrata la morfologia delle SF-MSC di coniglio coltivate monostrato prima e dopo la MACS, al microscopio invertito.Prima della cernita, le popolazioni di cellule del liquido sinoviale di coniglio aderenti mostrano eterogeneità. Contengono diversi tipi e dimensioni di cellule come la morfologia ovale, a fuso lungo, a fuso corto e stellata. La morfologia principale del passaggio due e del passaggio sei, è una morfologia a fuso.Dopo la MACS con CD90, le popolazioni cellulari mostrano una morfologia omogenea. Con la sottocoltura, il numero di cellule aumenta. L'analisi della citometria a flusso ha dimostrato che le cellule SF-MSC di coniglio erano positive per i marcatori MSC CD44 e CD105.Mentre è negativo per il marcatore delle cellule endoteliali CD34 e per il marcatore delle cellule ematopoietiche CD45. I risultati hanno mostrato che prima della MACS, la popolazione di SF-MSC di coniglio era composta da circa il 40% di cellule MSC. Dopo la MACS, la popolazione arricchita conteneva più del 99% di cellule MSC.Di seguito è illustrata l'analisi della citometria a flusso del marcatore CD90-positivo prima e dopo lo smistamento MAC. La colorazione con Alizarin Red ha dimostrato che i noduli mineralizzati si sono formati sotto induzione osteogenica per tre settimane. Dopo tre settimane di induzione adipogenica, l'accumulo di vacuoli ricchi di lipidi è stato rilevato mediante colorazione intracellulare con olio rosso O.Dopo tre settimane di induzione condrogenica, il pellet cellulare è stato analizzato istologicamente con colorazione con blu di toluidina. Il proteoglicano acido positivo caratterizzava le cellule simili ai condrociti. Dopo tre settimane di induzione, è stata rilevata l'espressione relativa dell'mRNA del marcatore osteoblastico, del marcatore adipogenico e del marcatore condrogenico.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due o quattro ore. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione dell'isolamento diretto e della purificazione delle cellule staminali mesenchimali dal liquido sinoviale del coniglio bianco della Nuova Zelanda. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di selezionare quelle colonie più grandi di due millilitri di diametro.Produrre anche una sospensione a singola cellula prima della selezione immunomagnetica, poiché le cellule indesiderate attaccate a una cellula marcata rimarranno sulla perlina magnetica. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza, al fine di rispondere a ulteriori domande relative alla sicurezza e all'efficacia della purificazione delle cellule staminali mesenchimali. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della rigenerazione della cartilagine articolare per esplorare le cellule CD ideali nella riparazione della cartilagine articolare.Non dimenticare che le operazioni sono state eseguite sul banco di raffreddamento dell'arcata e che le precauzioni come i guanti, devono essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia della lesione della cartilagine articolare, perché le MASC derivate dal liquido sinoviale sono candidati promettenti per la rigenerazione della cartilagine articolare.

magnetic-activated-cell-sorting-strategies-to-isolate-purify-synovial

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ratto MSC sono stati isolati da femori e delle tibie e poi arricchita da cell sorting magnetico. Cellule ordinati sono stati confermati per l'espressione di marcatori di superficie mediante citometria a flusso. Queste cellule sono state coltivate a densità clonale a formare singole colonie e poi queste colonie erano separate da cilindri di clonazione.

L&#39;isolamento e l&#39;arricchimento delle cellule staminali mesenchimali di ratto (MSC) e la separazione dei Single-colonia di cellule staminali mesenchimali derivate

Una tecnica sperimentale per il trattamento dei difetti osteocondrali nel ginocchio del coniglio è descritto. L'impianto di cellule staminali mesenchimali allogeniche in difetti osteocondrali fornisce una promettente sviluppo nel campo dell'ingegneria dei tessuti. La preparazione di...

Il trattamento dei difetti osteocondrali del ginocchio congiunta del Coniglio con impianto di cellule staminali mesenchimali allogeniche in coaguli di fibrina

Questo protocollo descrive una tecnica di isolamento per ottenere cellule mesenchimali stromali residenti polmonare primaria da ratti, attraverso l'uso di digestione enzimatica, la separazione gradiente di densità, aderenza plastica e CD146 + selezione perlina magnetica.

Isolamento di CD146<sup&gt; +</sup&gt; cellule residenti del polmone mesenchimali stromali da Rat Polmoni

Presentiamo le tecniche necessarie per isolare la frazione vascolare stromale (SVF) dai depositi di tessuto adiposo inguinale (sottocutaneo) e perigonadico (viscerale) di topo per valutare la loro espressione genica e l'attività collagenolitica. Questo metodo include l'arricchimento di cellule staminali di derivazione adiposa (ASC)ad alto contenuto di Sca1 utilizzando la separazione cellulare immunomagnetica.

Separazione immunomagnetica di Sca1 Fat Depot-specifica<sup&gt; alta</sup&gt; derivate da tessuto adiposo cellule staminali (ASC)

Viene presentato un protocollo che stabilisce cellule staminali mesenchimali (MSC) isolate dal liquido sinoviale e dal midollo osseo di maialini e raccolte in modo non invasivo mediante aspirazione a siringa. La fenotipizzazione cellulare è stata eseguita utilizzando la citometria a flusso dopo l'isolamento cellulare e la coltura in vitro di midollo osseo e liquidi sinoviali derivati da MSC.

Isolamento e Cellular Fenotipizzazione di cellule staminali mesenchimali derivate dal liquido sinoviale e del midollo osseo di mini-pig

Condrogenesi da cellule staminali richiede la messa a punto delle condizioni di coltura. Qui vi presentiamo un approccio magnetico per condensare le cellule, un passo essenziale per iniziare condrogenesi. Inoltre, mostriamo che la maturazione dinamico in un bioreattore applica stimolazione meccanica ai costrutti cellulari e aumenta la produzione di matrice extracellulare cartilaginea.

3D Stem magnetica cellulare Aggregazione e bioreattore maturazione per la cartilagine Regeneration

Qui, presentiamo un protocollo per produrre un gran numero di esosomi di grado GMP da cellule staminali mesenchimali del liquido sinoviale utilizzando un bioreattore 3D.

Preparazione su larga scala di esosomi derivati da cellule staminali mesenchimali con liquido sinoviale mediante coltura di bioreattori 3D

Il presente studio fornisce un protocollo modificato per isolare i macrofagi sinoviali e i fibroblasti dal tessuto dell'artrite infiammatoria murina.

Isolamento e coltura di macrofagi sinoviali primari e fibroblasti da tessuto di artrite murina

Questo studio ha stabilito un metodo stabile ed efficiente per l'isolamento, la coltura e la determinazione funzionale delle cellule staminali CD34+ residenti nella parete vascolare (CD34+ VW-SC). Questo metodo di isolamento, facile da seguire ed efficace in termini di tempo, può essere utilizzato da altri ricercatori per studiare i potenziali meccanismi coinvolti nelle malattie cardiovascolari.

Isolamento immunomagnetico delle cellule staminali CD34+ residenti nella parete vascolare dai topi

Le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo mascellare hanno funzioni significative nella differenziazione, nell'autorinnovamento e nella modulazione immunitaria. Sono emersi come un serbatoio cruciale di cellule precursori nella terapia genica, nell'ingegneria tissutale e nella medicina rigenerativa. Qui, presentiamo un metodo unico per isolare le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo mascellare nei ratti.

Tecnica per l'isolamento e la coltura di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo della mascella di ratto

Questo protocollo descrive un metodo di selezione basato su perle magnetiche che utilizza anticorpi di citometria di flusso marcati con ficoeritrina (PE) e microsfere anti-PE per isolare specifiche sottopopolazioni di cellule staminali mesenchimali con alta positività dei marker target postsort e attività proliferativa/metabolica basata su CCK-8 nelle condizioni testate, senza richiedere costosi selezionatori cellulari o perle personalizzate specifiche per target.

Isolamento e validazione delle sottopopolazioni di cellule staminali mesenchimali positive a Podoplanina utilizzando una strategia di perle magnetiche indirette

Scopri un protocollo semplice ed economico per isolare e purificare cellule staminali mesenchimali dal liquido sinoviale di conigli usando il MACS. Questo metodo migliora l'efficienza della purificazione cellulare per applicazioni cliniche.

Magnetico-Activated Cell Sorting strategie per isolare e purificare Synovial cellule staminali mesenchimali liquido derivato da un modello di coniglio (Video) | JoVE Journal

Magnetico-Activated Cell Sorting strategie per isolare e purificare Synovial cellule staminali mesenchimali liquido derivato da un modello di coniglio

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