Magnetico-Activated Cell Sorting strategie per isolare e purificare Synovial cellule staminali mesenchimali liquido derivato da un modello di coniglio

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel protocollo di smistamento nel campo delle cellule staminali fornendo una procedura per purificare le cellule staminali mesenchimali direttamente dal liquido sinoviale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che abbiamo stabilito un protocollo semplice ed economico per l'isolamento e la purificazione del MACS dal liquido sinoviale di coniglio. Generalmente nella ricerca, grazie a questo metodo, facciamo grandi sforzi, perché la pluzione della popolazione cellulare dipende dalla produzione di una singola sospensione cellulare.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo notato che solo il metodo di selezione cellulare attivato magneticamente è attualmente approvato dalla FDA per applicazioni cliniche. Iniziare questa procedura con l'anestesia animale come descritto nel protocollo di testo. Per eseguire la raccolta del liquido sinoviale articolare dal ginocchio del coniglio, selezionare un'area di circa cinque per cinque centimetri intorno al ginocchio.

Radere i peli di coniglio intorno a quest'area usando un rasoio elettrico di sicurezza. In alternativa, disinfettare il sito della procedura con una soluzione di iodio povidone e etanolo al 75% tre volte. Quindi, applicare teli sterili dopo che l'area si è completamente asciugata.

Utilizzare una siringa ipodermica sterile per iniettare da uno a due millilitri di soluzione salina isotonica nella cavità articolare del ginocchio dallo spazio articolare laterale. Muovi il ginocchio tre o quattro volte, quindi aspira tutto il liquido sinoviale a temperatura ambiente. Filtrare il liquido sinoviale attraverso un colino cellulare in nylon da 40 micron per rimuovere eventuali detriti, entro quattro ore.

Per coltivare le SF-MSC di coniglio, raccogliere il fluido filtrato in provette da centrifuga da 50 millilitri e centrifugare a 1.500 giri/min per dieci minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante dopo la centrifugazione e lavare il pellet con PBS. Dopo aver risospeso il pellet con il terreno di coltura completo, impiattare il terreno in piastre da 100 millilitri.

Incubare le piastre a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di anidride carbonica. Dopo 48 ore, riempire le pietanze con terreno fresco per eliminare eventuali cellule non aderenti. Sostituire il mezzo due volte a settimana per due settimane come passaggio zero.

Dopo 14 giorni dall'impiattamento iniziale, molte colonie dovrebbero essersi formate nei piatti di coltura. Seleziona le colonie di diametro superiore a due millimetri. Segna dove si trovano le colonie selezionate, tracciando la loro circonferenza sul fondo del piatto.

Scartare le colonie larghe meno di due millimetri utilizzando raschietti cellulari. Digerire le colonie selezionate con circa cinque microlitri di tripsina allo 0,25% utilizzando un cilindro di clonazione e trasferire le colonie in un nuovo piatto per il passaggio. Quando le cellule raggiungono circa l'80% di confluenza, aspirare il terreno.

Quindi, aggiungere uno o due millilitri di tripsina EDTA allo 0,25% a ciascun piatto. Incubare le piastre per due o tre minuti per consentire il distacco delle cellule. Una volta che le cellule sono state staccate, aggiungere una quantità uguale di terreno di coltura per rendere inattiva la tripsina.

Passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 micron e raccogliere il filtrato in una provetta da 15 millilitri. Quindi centrifugare le celle a 600 volte G per dieci minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet della cella nel buffer di esecuzione MACS.

Per eseguire la marcatura magnetica, determinare il numero di cellule utilizzando un emocitometro. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 volte G per dieci minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver aspirato completamente il surnatante, aggiungere 80 microlitri di tampone di risospensione per dieci milioni di cellule totali.

Per dieci milioni di cellule totali, aggiungere 20 microlitri di microsfere coniugate con un anticorpo monoclonale anti-coniglio CD90. Mescolare le perle magnetiche e le celle in modo uniforme nelle provette. Quindi incubarli a quattro gradi Celsius per 15 minuti al buio.

Aggiungere un millilitro di tampone per dieci milioni di cellule alla provetta, quindi centrifugare a 300 volte G per dieci minuti a quattro gradi Celsius, per lavare le cellule. Eliminare il surnatante dopo la centrifugazione. Risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone per dieci milioni di cellule.

Posizionare la colonna, con le ali della colonna in avanti, nel campo magnetico del separatore magnetico. Sciacquare la colonna del separatore magnetico con 500 microlitri di tampone per dieci milioni di cellule. Trasferire la sospensione a cella singola nella colonna.

Lascia che le cellule negative passino attraverso il campo magnetico per scartare queste celle non etichettate. Lavare la colonna una o due volte con 500 microlitri di tampone per dieci milioni di cellule e scartare il flusso. Trasferire la colonna in una provetta da centrifuga da 15 millilitri.

Aggiungere un millilitro di tampone per dieci milioni di celle alla colonna. Quindi spingere immediatamente lo stantuffo nella colonna, per eliminare le celle marcate magneticamente. Ripetere la procedura di cui sopra con una seconda colonna di separatore magnetico, per aumentare la purezza delle cellule CD90-positive, che possono arricchire la frazione eluita.

Dopo aver centrifugato la sospensione cellulare a 300 volte G per dieci minuti, aspirare il surnatante e risospendere il pellet con il terreno di coltura. Inoculare le cellule in piastre da 100 millilitri dopo la selezione cellulare attivata magneticamente. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius in un incubatore cellulare umidificato con il 5% di anidride carbonica.

Quando si raggiunge l'80-90% di confluenza della coltura primaria, a circa sette-dieci giorni, digerire le cellule aderenti con lo 0,25% di tripsina EDTA e farle passare a una diluizione di uno a due per fare il passaggio due. Utilizzare lo stesso metodo per passare le cellule al passaggio tre, che può essere utilizzato per i saggi in vitro. Qui viene mostrata la morfologia delle SF-MSC di coniglio coltivate monostrato prima e dopo la MACS, al microscopio invertito.

Prima della cernita, le popolazioni di cellule del liquido sinoviale di coniglio aderenti mostrano eterogeneità. Contengono diversi tipi e dimensioni di cellule come la morfologia ovale, a fuso lungo, a fuso corto e stellata. La morfologia principale del passaggio due e del passaggio sei, è una morfologia a fuso.

Dopo la MACS con CD90, le popolazioni cellulari mostrano una morfologia omogenea. Con la sottocoltura, il numero di cellule aumenta. L'analisi della citometria a flusso ha dimostrato che le cellule SF-MSC di coniglio erano positive per i marcatori MSC CD44 e CD105.

Mentre è negativo per il marcatore delle cellule endoteliali CD34 e per il marcatore delle cellule ematopoietiche CD45. I risultati hanno mostrato che prima della MACS, la popolazione di SF-MSC di coniglio era composta da circa il 40% di cellule MSC. Dopo la MACS, la popolazione arricchita conteneva più del 99% di cellule MSC.

Di seguito è illustrata l'analisi della citometria a flusso del marcatore CD90-positivo prima e dopo lo smistamento MAC. La colorazione con Alizarin Red ha dimostrato che i noduli mineralizzati si sono formati sotto induzione osteogenica per tre settimane. Dopo tre settimane di induzione adipogenica, l'accumulo di vacuoli ricchi di lipidi è stato rilevato mediante colorazione intracellulare con olio rosso O.

Dopo tre settimane di induzione condrogenica, il pellet cellulare è stato analizzato istologicamente con colorazione con blu di toluidina. Il proteoglicano acido positivo caratterizzava le cellule simili ai condrociti. Dopo tre settimane di induzione, è stata rilevata l'espressione relativa dell'mRNA del marcatore osteoblastico, del marcatore adipogenico e del marcatore condrogenico.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due o quattro ore. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione dell'isolamento diretto e della purificazione delle cellule staminali mesenchimali dal liquido sinoviale del coniglio bianco della Nuova Zelanda. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di selezionare quelle colonie più grandi di due millilitri di diametro.

Produrre anche una sospensione a singola cellula prima della selezione immunomagnetica, poiché le cellule indesiderate attaccate a una cellula marcata rimarranno sulla perlina magnetica. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza, al fine di rispondere a ulteriori domande relative alla sicurezza e all'efficacia della purificazione delle cellule staminali mesenchimali. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della rigenerazione della cartilagine articolare per esplorare le cellule CD ideali nella riparazione della cartilagine articolare.

Non dimenticare che le operazioni sono state eseguite sul banco di raffreddamento dell'arcata e che le precauzioni come i guanti, devono essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia della lesione della cartilagine articolare, perché le MASC derivate dal liquido sinoviale sono candidati promettenti per la rigenerazione della cartilagine articolare.