Name: Digestione delle proteine, ultrafiltrazione e cromatografia di esclusione di formato per ottimizzare lisolamento degli esosomi da siero e Plasma sanguigno umano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Impara a purificare gli esosomi dal sangue umano con digestione proteica, ultrafiltrazione e cromatografia di esclusione di formato. Questo metodo riduce le proteine co-purificanti e migliora l'accuratezza dell'analisi proteomica.

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Questa ricerca è stata sostenuta da fondi interni da CSU (di KMD), ATCC contratto n. 2016-0550-0002 (un subappalto di NIAID HHSN272201600013C) e The Bill e Melinda Gates Foundation (OPP1039688) (a KMD/NKG). Ringraziamo l'esperienza di ricerca NSF per programma estivo di laureandi (REU) presso la Colorado State University per ulteriore supporto.

Quest'opera è stata determinata non deve essere la ricerca del soggetto umano all'esame iniziale dagli di Colorado State University Institutional Review Board (IRB), come tutti i campioni umani sono stati ottenuti come campioni de-identificati dal biorepository Bioreclamation IVT e sono stati raccolti sotto protocolli IRB approvato.
1. preparazione del campione grezzo (Plasma o siero) di cubettatura più grandi vescicole e detriti cellulari
Nota: Considerazione di sicurezza: plasma, siero e altri fluidi biologici sono materiali a rischio biologico e deve essere maneggiati con cura speciale, mentre indossa base dispositivi di protezione individuale, compresi i guanti e camice da laboratorio. È altamente raccomandato che i campioni biologici sono trattati in una cappa di biosicurezza; Se non disponibile, è consigliato l'uso di protezioni per gli occhi.
<ol><li>Equilibrare un siero o un campione di plasma inserendo il tubo in condizioni di non-agitazione in un frigorifero a 4 ° C durante la notte (da o -20 o stoccaggio di-80 ° C).</li>
	<li>Aliquotare e 250 µ l del campione in una provetta da microcentrifuga utilizzando una pipetta di 1.000 µ l.</li>
	<li>Centrifugare il campione a 18.000 x g per 30 min a 4 ° C.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta 200 µ l, 200 µ l del surnatante eliminato di rimuovere e aggiungerlo ad un nuovo tubo del microcentrifuge. Evitare qualsiasi materiale pellettato durante il trasferimento il supernatante. Scartare il materiale pellettato.</li>
	<li>Quantificare il contenuto proteico del campione dall'analisi di bicinconinico acido (BCA), utilizzando il protocollo del produttore. Per eseguire il test, è necessario diluire il campione 01:50 in 1x tampone fosfato salino (PBS). Test di ciascun campione in duplicato. Nota: Se non diversamente specificato, utilizzare 1X PBS in tutto il protocollo. In media, 200 µ l di chiarificato siero o plasma (dopo 18.000 x g) resa di 15 mg di proteine totali. Altri tipi di campione, con contenuto proteico inferiore o superiore, possono richiedere ulteriori diluizioni di BCA.</li>
	<li>Aliquotare 10 mg di campione in una provetta da microcentrifuga nuovo. Utilizzare la concentrazione ottenuta al passaggio 1.5 per calcolare il corrispondente volume di campione. Aliquota del campione usando una pipetta 200 µ l. Nota: Si raccomanda di conservare il campione rimanente a-80 ° C. Aliquota del campione in diversi tubi a 10 mg per tubo per evitare il gelo-disgelo più cicli in futuro utilizzare.</li>
</ol>2. la digestione delle proteine del sangue Non-exosomal
Nota: La fase di digestione è progettata per ridurre le proteine non-exosomal che possono co-purificare con esosomi. Se la conservazione delle proteine di superficie esosomi è necessaria per le analisi a valle, dovrebbe essere preso in considerazione che questo passaggio ha il potenziale di interferire con questa analisi. La rilevazione di exosomal CD63, una proteina di superficie-esposta studi, non era stata influenzata significativamente negativamente da questo processo.
<ol><li>Preparare la proteinasi K soluzione ad una concentrazione di 500 µ g/mL in PBS. Aggiungere la quantità corrispondente di proteinasi K in una provetta conica. Aggiungere quindi il buffer e vortexare per 30 s, 3 x a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l di soluzione di proteinasi K nell'esempio 10 mg aliquota e mescolare dolcemente pipettando su e giù usando una pipetta a 200 µ l.</li>
	<li>Incubare il campione a 37 ° C a bagnomaria per 30 min. posto il tubo in una cremagliera del tubo galleggiante ed evitare la completa immersione del tubo nel bagno d'acqua per evitare potenziali perdite.</li>
	<li>Trasferire il campione e la cremagliera del tubo galleggiante a bagnomaria a 60 ° C per 10 min, per inattivare la proteinasi K.</li>
</ol>3. rimozione di piccole proteine e peptidi mediante ultrafiltrazione centrifuga
<ol><li>Sciacquare contenente 100 filtro cut-off (MWCO) di peso molecolare di kDa prima di PBS di utilizzare un dispositivo di ultrafiltrazione. Questo scopo, aggiungere 500 µ l di PBS per il filtro, utilizzando una pipetta di 1.000 µ l. Girare il dispositivo a 3.700 x g per 5 min, scartare qualsiasi retentato rimanente, come pure l'eluato. Nota: La capacità del volume di campione del dispositivo ultrafiltrazione deve essere 0,5 mL - 4 mL per assicurarsi che il volume del campione ridotto finale di 50 µ l è realizzabile.</li>
	<li>Prelevare il campione dal punto 2.4 e aumentare il volume a 500 µ l con l'aggiunta di PBS. Dispensare il campione nel dispositivo pre-risciacquata ultrafiltrazione. Nota: In media, il volume del campione dal passaggio 2.4 è 185 µ l (120-150 µ l di campione e 50 µ l di soluzione di proteinasi K).</li>
	<li>Posizionare il dispositivo di ultrafiltrazione in una centrifuga da banco ad angolo fisso a 3.700 x g a 4 ° C fino a quando il campione è ridurre ad un volume di 50 µ l. Attenzione: Quando si utilizzano dispositivi di ultrafiltrazione con arresto volume, si deve prestare attenzione per evitare il completo essiccamento della membrana del filtro durante le fasi di centrifugazione.</li>
	<li>Aggiungere 500 µ l di PBS direttamente nel filtro a membrana e pipetta su e giù per 5 volte. Centrifugare come descritto al punto 3.3. Eseguire questo passaggio di lavaggio un totale di 3 volte.</li>
	<li>Trasferire il retentato finale 50 µ l in un nuovo tubo del microcentrifuge.</li>
	<li>Sciacquare il filtro a membrana con 200 µ l di PBS, pipettaggio su e giù per 10 volte e trasferire il lavaggio nella provetta da passo 3.5.</li>
	<li>Inserire il portafiltro nella posizione inversa in un nuovo tubo. Eseguire un ripristino di inversione di rotazione per 5 min a 2.000 x g per recuperare il campione rimanente dalla membrana. Piscina il campione con il campione dal punto 3.5.</li>
</ol>4. purificazione delle vescicole di cromatografia di esclusione di formato (SEC)
<ol><li>Aggiungere 850 µ l di liquami SEC, con perline avendo una MWCO di kDa 700, in una colonna di flusso di vuoto, con un massimo di gravità usando una pipetta di 1.000 µ l. Posizionare le colonne in un formato rack appropriato dotato di un gocciolatoio.</li>
	<li>Stappare la parte inferiore della colonna e lasciare che lo scarico liquido per 5 min. Una volta scolati, aggiungere 10 mL di PBS per lavare la resina. Consentire 20 min per il lavaggio drenare dalla colonna.</li>
	<li>Posizionare il concentrato, proteinasi K trattato campione da passo 3.5 in una provetta conica da 15 mL e aumentare il volume del campione a 5 mL di PBS di aggiungere con una pipetta sierologica. Mescolare delicatamente il tubo da dondolo per 1 min e poi lentamente applicare il campione alla colonna preparata al punto 4.2 con una pipetta sierologica. Nota: Una volta rimosso il tappo della colonna, il campione fluirà attraverso la resina per gravità; L'esempio 5 mL fluirà completamente attraverso la colonna in 10 min.</li>
	<li>Raccogliere il flusso attraverso in una nuova provetta conica da 15 mL.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta sierologica, applicare il materiale raccolto per la resina nuovamente per rimuovere qualsiasi materiale restante sotto 700 kDa.</li>
	<li>Raccogliere il flusso attraverso in una nuova provetta conica da 15 mL. Lavare la resina due volte aggiungendo 1 mL di PBS. Raccogliere il flusso attraverso il tubo dal punto 4.5; il volume finale totale sarà di circa 7 mL. Nota: Dopo passo 4.6, il campione sarà diluito circa 35 volte dal volume del campione originale; la seguente procedura verrà ridurre il volume e concentrare il campione di esosomi purificata.</li>
</ol>5. concentrazione di esosomi purificati e quantificazione di proteine totali
<ol><li>Sciacquare un dispositivo di ultrafiltrazione con un filtro MWCO 3 kDa prima di PBS di utilizzare, come descritto al punto 3.1.</li>
	<li>Aggiungere l'esempio dal passaggio 4.6 al dispositivo di ultrafiltrazione e centrifuga in un rotore basculante a 3.700 x g a 4 ° C. Tampone passa attraverso il filtro e possa essere scartate. Concentrato di esosomi verranno mantenuti sopra il filtro. Centrifugare il campione fino a quando il volume sopra il filtro (retentato) è ridotto a 200 µ l.</li>
	<li>Trasferire il retentato ad un nuovo tubo del microcentrifuge.</li>
	<li>Sciacquare il filtro a membrana con 200 µ l PBS pipettando sopra la membrana 10 volte e trasferire il lavaggio del tubo dal punto 5.3. Questo permetterà per la raccolta di un campione di esosomi residua.</li>
	<li>Portare il volume di campione fino a 500 µ l con l'aggiunta di PBS. Mescolare lentamente pipettando su e giù per 10 volte. Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. I campioni devono essere conservati a 4 ° C durante la notte o a-20 /-80 ° C per la conservazione a lungo termine.</li>
	<li>Quantificare il contenuto proteico del campione dall'analisi di BCA, utilizzando il protocollo del produttore. Diluire il campione 01:10 e 01:50 in PBS. Eseguire ogni campione in duplicato. Nota: A partire da 10 mg di proteine totali del siero o del plasma, la proteina totale resa in esosomi purificati dal passaggio 5.6 è, in media, 150 µ g. ulteriori diluizioni possono essere necessari se vengono utilizzati campioni diversi da siero o plasma; la resa può variare con tipo di campione.</li>
</ol>6. quantificazione e dimensionamento degli esosomi di Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)
<ol><li>Aggiungere 5 µ g di esosomi purificati (come quantificato in 5.6) a 1 mL di PBS e agitare con vortex per 15 s su medio-bassa velocità.<ol>
<li>Il campione viene posto in una siringa monouso da 1 mL. Se disponibile, è possibile impostare la siringa in una pompa a siringa automatica impostata di iniettare il campione diluito esosomi a una velocità di 30 µ l/min.</li>
		<li>Eseguire misurazioni NTA utilizzando impostazioni di acquisizione video: schermo guadagno del livello 3-4 e fotocamera di 12-13.</li>
		<li>Definire lo script per l'analisi eseguire tre replicati tecnici per un minimo di 30 s usando un flusso costante per ogni replica. Per l'analisi, impostare la soglia di cattura alle 5. Nota: Dettagli per quanto riguarda l'uso della siringa automatica e le impostazioni per l'acquisizione video sono disponibili nel riferimento13. Impostazioni di acquisizione e analisi per NTA devono essere coerente in diversi campioni per assicurare la comparabilità.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. determinazione della riduzione della proteina solubile
<ol><li>Aggiungere µ g di 1-10 di esosomi purificati a tampone campione SDS ed eseguire l'elettroforesi su gel di poliacrilamide (pagina) utilizzando un Gel di Bis-Tris di 4-12% in 1 x MES SDS in esecuzione buffer per 35 min a 200 V. Transfer risolti proteine ad una membrana di nitrocellulosa 0,2 µm applicando una tensione o f 50 V per 1-1.5 h. eseguire l'analisi western blot per valutare la presenza di albumina, apolipoproteine A e B e il marcatore di esosomi CD 63 seguendo metodologie standard. Nota: Protocolli di completo per i metodi 7.1 si trovano riferimento14; in particolare, SP007: esecuzione del gel di poliacrilammide e SP011: protocollo occidentale della macchia.</li>
	<li>Separare i 10 µ g di esosomi purificati utilizzando la pagina come descritto al punto 7.1 e macchia le bande proteiche utilizzando colorante coomassie, seguenti raccomandazioni standard, per visualizzare la variazione di proteina e riduzione tra i campioni. Nota: Ulteriori dettagli riguardanti il protocollo per le macchie occidentali specifici di CD63 sono descritti da Diaz et al. 15
</li>
</ol>

<ol><li>Stoorvogel, W., Kleijmeer, M. J., Geuze, H. J., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biogenesis+and+functions+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The biogenesis and functions of exosomes.</a> Traffic. 3 (5), 321-330 (2002).</li>
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<li>Diaz, G., Wolfe, L. M., Kruh-Garcia, N. A., Dobos, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+Membrane-Associated+Proteins+of+Exosomes+Released+from+Human+Macrophages+after+Mycobacterium+tuberculosis+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Changes in the Membrane-Associated Proteins of Exosomes Released from Human Macrophages after Mycobacterium tuberculosis Infection.</a> Sci Rep. 6, 37975(2016).</li>
<li>Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-isolation+of+extracellular+vesicles+and+high-density+lipoproteins+using+density+gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li>
<li>Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3.22 (2006).</li>
<li>Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biologically-active+exosomes+from+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of biologically-active exosomes from human plasma.</a> J Immunol Methods. 411, 55-65 (2014).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Un metodo ottimizzato per aumentare la purezza e la resa degli esosomi da sangue aumenterà la capacità di miniera con precisione le vescicole extracellulari come fonte di biomarcatori per parecchie malattie. I metodi standard attualmente utilizzate per isolare gli esosomi, in particolare, ultracentrifugazione e metodi di precipitazione, hanno diversi svantaggi tra cui aggregazione esosomi e cubettatura di proteine solubili7,17, 18</s...

Gli esosomi sono nanovesicles (che variano nel formato da 30 nm a 150 nm) rilasciato da quasi tutte le cellule nel corpo umano per facilitare la comunicazione cellula--cellula elabora1,2. È interessante notare che, la composizione degli esosomi cambia a seconda le celle di origine, nonché lo stato di salute dei singoli3,4,5. Inoltre, esosomi possono essere Estratto da diversi fluidi biologici come: saliva, urina e sangue2. A causa di queste caratteristiche, gli esosomi sono considerati una buona fonte di biomarker di malattia. Purtroppo, non esiste alcun metodo standard per l'isolamento di esosomi. Alcuni laboratori considerano centrifugazione multifasico, con un passaggio ad alta velocità finale a 100.000 x g usando le pendenze di densità come il metodo gold standard per l'isolamento di esosomi. Tuttavia, recenti studi hanno dimostrato che ultracentrifugazione induce l'aggregazione di esosomi con proteine solubili e altri esosomi, oltre ad interessare l'integrità di esosomi, entrambi i quali possono ostacolare applicazioni a valle6,7 . Altri metodi comuni di esosomi isolamento includono, ma non sono limitati a: precipitazione da commerciale polietilenglicole (PEG) base di reagenti, ultrafiltrazione centrifuga e cromatografia di esclusione dimensionale (SEC). I reagenti commerciali utilizzando polimeri di polietilene glicole (spina) arricchiscono esosomi causando loro di precipitare e formare una pallina. Limitazioni di utilizzo di questo polimero sono contaminazione con residui PEG polimero e un'abbondanza di proteine solubili non-exosomal nel prodotto finale. Ultrafiltrazione utilizza centrifugazione per purificare e concentrare le vescicole utilizzando una membrana di cellulosa; esosomi vengono mantenuti sopra il filtro, mentre le più piccole impurità e altre proteine passano attraverso la membrana7,8. Proprio come altri metodi, ultrafiltrazione centrifuga ha una capacità limitata per purificare gli esosomi a causa della ritenzione di alti livelli di proteine non-exosomal, tra cui aggregati e complessi proteici. Infine, purificazione SEC utilizza resina porosa per separare le molecole di dimensioni. SEC ha mostrato risultati promettenti, superando la maggior parte dei problemi con esperienza con altri metodi catturando la maggior parte delle proteine contaminanti e preservando l'integrità del exosomal, poiché l'isolamento è basato sulla gravità o sistemi a bassa pressione7, 9. Tuttavia, la co-isolamento di proteine più grandi aggregati e lipoproteine10 durante il SEC colpisce la purezza della preparazione finale esosomi. Mentre alcuni metodi sono stati testati per la purificazione di esosomi da surnatanti della cultura delle cellule e del plasma7o solo al plasma9,11, non c'è alcuna informazione circa le prestazioni dei metodi direttamente a confronto sangue plasma e siero dallo stesso individuo.
Qui, ci concentriamo sulla purificazione del sangue esosomi confrontando una serie di flussi di lavoro per determinare se tecniche di arricchimento della vescicola sono traducibili tra plasma e siero. Nanoparticle tracking analysis e western blot sono stati usati per quantificare le differenze nella composizione di concentrazione, purezza e proteina di esosomi nei prodotti finali. Il metodo finale, dettagliato nel presente protocollo, aumenta i numeri della vescicola e riduce i livelli di proteina non-exosomal. D'importanza, è dimostrata una drastica riduzione delle proteine co-precipitazione comuni tra cui albumina e apolipoproteine. All'abbondanza di queste due proteine nel sangue e la frequenza alla quale essi co-purificare con esosomi cause incoerenze tra i campioni "purificati", inclinare le analisi a valle. Questo protocollo prevede l'utilizzo di una resina SEC disponibile in commercio; la resina è composto dei branelli porosi in cui proteine inferiore a 700 kDa possono inserire le perline. Una volta all'interno, le proteine vengono mantenute da un ligando octylamine. L'eluato è composto di esosomi e molecole più grandi di 700 kDa12. Inoltre, al fine di ridurre gli aggregati proteici e apolipoproteine che eludere intrappolamento della perla, includiamo una fase di digestione della proteasi del flusso di lavoro. Attualmente, non esiste nessuna tecnica da sola in grado di massimizzare la resa di esosomi riducendo proteine non-exosomal co-purificante. Questo studio indica che un protocollo di purificazione che combina un pretrattamento di digestione della proteasi con più metodi di recupero e purificazione può essere utilizzato per aumentare la resa di esosomi e purezza da siero del sangue e del plasma.

<table><tbody><tr><td>Microcentrifuga da banco Nanosight</td><td>Malvern</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo</td><td>Legend Mico21</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da banco</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra 6R</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath&nbsp;</td><td>Lettore</td> di micropiastre Benchmark <td>B2000-4</td><td></td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine BCA</td><td></td> BIOTEK Epoch <td></td> Pierce THERMO 23227 <td></td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine Micro BCA</td><td>THERMO</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti</td><td>Corning</td><td>15705-066</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unità filtrante centrifuga Amicon Ultra-0.5 con membrana Ultracel-100</td><td>EMD-Millipore</td><td>UFC510096</td><td></td></tr><tr><td>Unità filtranti centrifughe Amicon Ultra-4</td><td>EMD-Millipore</td><td>UFC800324</td><td></td></tr><tr><td>Capto Core 700</td><td>GE Healthcare</td><td>17548103</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Prep&nbsp; Colonne per cromatografia</td><td>BIORAD</td><td>7311550</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gel</td><td>THERMO</td><td>NP0323BOX</td><td></td></tr><tr><td>membrana in nitrocellulosa, rotolo, 0,2 e micro; m</td><td>BIORAD</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>proteinasi K,&nbsp; Tritirachium album</td><td>EMD-Millipore</td><td>539480</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>THERMO</td><td>LC6065</td><td></td></tr><tr><td>SIGMAFAST&nbsp; BCIP/NBT</td><td>Millipore-SIGMA</td><td>B5655</td><td></td></tr><tr><td>4-cloro-1-naftolo</td><td>Millipore-SIGMA</td><td>C6788</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD63 (coniglio anti-umano) con anticorpo secondario HRP anti-coniglio di capra</td><td>SYSTEM BIOSCIENCES</td><td>EXOAB-CD63A-1</td><td>Anticorpi primari e secondari</td></tr><tr><td>Anticorpo ALB (F-10)</td><td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.</td><td>sc-271605</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>primario apoB Anticorpo (C1.4)</td><td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.</td><td>sc-13538</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>primario apoA-I Anticorpo (B-10)</td><td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.</td><td>sc-376818</td><td>Anticorpo primario</td></tr></tbody></table>

digestione delle proteine, ultrafiltrazione e cromatografia di esclusione di formato per ottimizzare l'isolamento degli esosomi da siero e plasma sanguigno umano

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Esosomi, un tipo di nanovesicle rilasciato da tutti i tipi di cellule, possono essere isolati da qualsiasi fluido corporeo. Il contenuto di esosomi, tra cui proteine ed RNA, è univoco per le cellule da cui essi sono derivati e può essere utilizzati come indicatori della malattia. Diversi protocolli comuni di arricchimento, tra cui ultracentrifugazione, resa di esosomi caricati di contaminanti di proteina solubile. In particolare, abbiamo trovato che le proteine più abbondanti all'interno del sangue spesso co-purificano con esosomi e possono confondere studi di proteomica a valle, vanificando l'identificazione dei candidati biomarcatore abbondanza bassa. Di ulteriore preoccupazione è irriproducibilità di quantificazione della proteina esosomi grazie alla rappresentazione incoerente dei livelli della proteina non-exosomal. Il protocollo dettagliato qui è stato sviluppato per rimuovere le proteine non-exosomal che co-purificano con esosomi, aggiunta di rigore per il processo di purificazione di esosomi. Cinque metodi sono stati confrontati usando accoppiato al plasma di sangue e siero da cinque donatori. Analisi usando nanoparticle tracking analysis e analisi della proteina acido bicinconinico micro ha rivelato che un protocollo combinato che utilizza cromatografia di esclusione di ultrafiltrazione e dimensione ha prodotto l'arricchimento della vescicola ottimale e la rimozione di proteina solubile. Macchiarsi occidentale è stato utilizzato per verificare che le proteine del sangue abbondanti attesi, tra cui l'albumina e apolipoproteine, sono state vuotate.

I dati presentati di seguito sono stati ottenuti utilizzando campioni appaiati di siero e plasma da cinque donatori sani. Per determinare gli effetti di ogni fase di lavorazione, sono state effettuate cinque varianti del protocollo presentato, e rimozione di proteine di recupero e non-esosomi esosomi sono stati confrontati. I metodi sperimentati inclusi: 1) SEC 700 kDa + ultrafiltrazione 3 kDa; 2) ultrafiltrazione 100 kDa; 3) proteinasi K + ultrafiltrazione 100 kDa; 4) SEC kDa 700 + ultra...

Qui, presentiamo un protocollo per purificare gli esosomi da siero con ridotta co-purificazione non-exosomal di proteine del sangue e del plasma. Il protocollo ottimizzato include ultrafiltrazione, trattamento con proteasi e cromatografia di esclusione di formato. Una maggiore purificazione di esosomi analisi a valle di vantaggi, tra cui più accurata quantificazione delle vescicole e caratterizzazione proteomica.

Digestione delle proteine, ultrafiltrazione e cromatografia di esclusione di formato per ottimizzare l'isolamento degli esosomi da siero e Plasma sanguigno umano

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di purificare le vescicole dal sangue riducendo al contempo le proteine e i complessi co-purificanti che possono interferire con l'analisi a valle, tra cui il tracciamento delle nanoparticelle e la proteomica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave come quali sono i cambiamenti proteomici nel siero o nelle vescicole plasmatiche durante lo stato di malattia rispetto a uno stato sano. Il vantaggio principale di questa tecnica è la maggiore precisione nell'enumerazione delle vescicole.Nella rimozione di abbondanti contaminanti non vescicolari, aumentiamo l'identificazione di proteine a bassa abbondanza e i potenziali biomarcatori della malattia. Le implicazioni di questo metodo si estendono alla scoperta di nuovi biomarcatori diagnostici. Consente una determinazione più accurata della composizione proteomica delle vescicole extracellulari in matrici complesse, come il sangue.In generale, gli individui che non conoscono la purificazione delle vescicole avranno difficoltà perché ci sono molte tecniche pubblicate. La riproducibilità dell'analisi proteomica a valle è influenzata dalla co-purificazione di abbondanti proteine del siero. Equilibrare un campione di siero o plasma posizionando la provetta in condizioni di non agitazione in un frigorifero a quattro gradi Celsius per una notte.Il giorno successivo, aliquotare 250 microlitri di campione in una provetta da microcentrifuga utilizzando una pipetta da 1.000 microlitri. Centrifugare il campione a 18.000 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Utilizzando una pipetta da 200 microlitri, rimuovere 200 microlitri del surnatante chiarificato e aggiungerlo a una nuova provetta per microcentrifuga.Evitare qualsiasi materiale pellettato durante il trasferimento del surnatante. Quantificare il contenuto proteico del campione mediante il dosaggio dei BCA utilizzando il protocollo del produttore. Per eseguire il saggio, diluire il campione da uno a 50 in una soluzione salina tamponata con fosfato X.Testare ogni campione in duplicato. Preparare una soluzione di proteinasi K a una concentrazione di 50 microgrammi per millilitro in PBS aggiungendo prima la quantità corrispondente di proteinasi K in una provetta conica. Quindi aggiungere il tampone e vortice per 30 secondi tre volte a temperatura ambiente.Quindi, aggiungere 50 microlitri di soluzione di proteinasi K all'aliquota del campione da 10 milligrammi e mescolare delicatamente pipettando su e giù con una pipetta da 200 microlitri. Incubare il campione a 37 gradi Celsius in un bagno d'acqua per 30 minuti, posizionando la provetta in una rastrelliera per tubi galleggianti. Per evitare potenziali perdite, evitare l'immersione completa del tubo nel bagnomaria.Dopo l'incubazione, trasferire il campione e il rack in un bagno d'acqua a 60 gradi Celsius per 10 minuti per inattivare la proteinasi K.Quindi, sciacquare un dispositivo di ultrafiltrazione contenente un filtro di taglio del peso molecolare da 100 kilodalton con PBS prima dell'uso. Utilizzare una pipetta da 1.000 microlitri per aggiungere 500 microlitri di PBS al filtro. Dopo aver fatto girare il dispositivo a 3, 700 volte G per cinque minuti, scartare il retentato rimanente e l'eluato.Aumentare il volume del campione a 500 microlitri aggiungendo PBS. Quindi pipettare il campione nel dispositivo di ultrafiltrazione pre-risciacquato. Centrifugare il dispositivo di ultrafiltrazione in una centrifuga da banco ad angolo fisso a 3, 700 volte G e quattro gradi Celsius fino a quando il campione non si è ridotto a un volume di 50 microlitri.Successivamente, aggiungere 500 microlitri di PBS direttamente sulla membrana del filtro. E pipettare su e giù cinque volte prima di centrifugare di nuovo come prima. Trasferire l'ultimo retentato da 50 microlitri in una nuova provetta da microcentrifuga.Sciacquare la membrana del filtro con 200 microlitri di PBS, pipettando su e giù 10 volte. E trasferire il lavaggio nel tubo. Quindi, posizionare il portafiltro in posizione inversa in un nuovo tubo.Eseguire un recupero a rotazione inversa per cinque minuti a 2.000 volte G per recuperare il campione rimanente dalla membrana. Posizionare le colonne in una rastrelliera di dimensioni adeguate. Aggiungere 850 microlitri di liquame SEC con perle aventi un limite di peso molecolare di 700 kilodalton utilizzando una pipetta da 1.000 microlitri.Stappate il fondo della colonna e lasciate scolare il liquido in un contenitore per rifiuti per cinque minuti. Una volta scolato, aggiungere 10 microlitri di PBS per lavare la resina. Attendere 20 minuti affinché il lavaggio si scarichi dalla colonna.Posizionare il campione trattato con proteinasi K concentrata in una provetta conica da 15 millilitri. E aumentare il volume del campione a cinque millilitri aggiungendo PBS con una pipetta sierologica. Mescolare delicatamente il tubo facendolo oscillare per un minuto.Quindi, applicare lentamente il campione sulla colonna preparata con una pipetta sierologica. Raccogliere il flusso in un nuovo tubo conico da 15 millilitri. Pipettare nuovamente il materiale raccolto sulla resina per rimuovere il materiale rimanente al di sotto di 700 kilodalton, raccogliendo il flusso in un nuovo tubo conico da 15 millilitri.Lavare la resina due volte aggiungendo ogni volta un millilitro di PBS. Raccogliere il flusso in un tubo. Il volume finale totale sarà di circa sette millilitri.Sciacquare un dispositivo di ultrafiltrazione con un filtro a peso molecolare da tre kilodalton come prima. Centrifugare in un rotore a secchiello oscillante a 3, 700 volte G e quattro gradi Celsius. Il buffer passerà attraverso il filtro e può essere scartato.Gli esosomi concentrati verranno trattenuti sopra il filtro. Centrifugare il campione fino a quando il volume sopra il filtro non si riduce a 200 microlitri. Quantificare il contenuto proteico del campione mediante il dosaggio dei BCA utilizzando il protocollo del produttore.Aggiungere cinque microgrammi di esosomi purificati a un millilitro di PBS. E vortice per 15 secondi a velocità medio-bassa. Mettere il campione in una siringa monouso da un millilitro.Se disponibile, inserire la siringa in una pompa a siringa automatica impostata per iniettare il campione di esosoma diluito a una velocità di 30 microlitri al minuto. Definisci lo script per l'analisi per eseguire tre repliche tecniche per un minimo di 30 secondi utilizzando un flusso costante per ogni replica. Per l'analisi, impostare la soglia di acquisizione su cinque.Infine, determinare la riduzione delle proteine solubili come descritto nel protocollo di testo. Vengono mostrati i risultati rappresentativi dell'analisi di tracciamento delle nanoparticelle di vescicole di siero purificato. La dimensione della vescicola è di circa 100 nanometri, come previsto.Qui è mostrato un gel proteico colorato con Coomassie che confronta il siero grezzo, le frazioni pre e post SEC mostrando la riduzione dell'albume e di altri contaminanti non vescicolari. Un Western blot mostra la ritenzione di CD63, una proteina esosomica distintiva dopo il trattamento e la purificazione della proteinasi K. La fase K della proteinasi è progettata per digerire le proteine solubili.CD63 è una proteina transmembrana ed è meno suscettibile alla proteinasi K alla concentrazione e alla lunghezza di incubazione determinate. Qui, un Western blot mostra l'esaurimento dell'albume, la proteina più abbondante nel sangue e una comune proteina co-purificante dopo la purificazione. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in sei ore.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare l'ultrafiltrazione a centrifuga, la digestione della proteasi e la cromatografia ad esclusione dimensionale per ottenere vescicole da fluidi biologici. È importante eseguire la quantificazione delle proteine mediante BCA o tecnica equivalente prima di una cromatografia e del tracciamento delle nanoparticelle. I risultati varieranno se le concentrazioni proteiche superano quelle indicate in questo protocollo.Non dimenticare che lavorare con fluidi biologici può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni, come indossare dispositivi di protezione individuale tra cui guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la spettrometria di massa della cromatografia liquida per determinare le proteine esatte contenute nelle vescicole purificate. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla composizione delle vescicole di sangue, può essere applicato anche ad altri tipi di campioni, come urina, liquido cerebrospinale o surnatanti di colture cellulari.

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Digestione delle proteine, ultrafiltrazione e cromatografia di esclusione di formato per ottimizzare lisolamento degli esosomi da siero e Plasma sanguigno umano (Video) | JoVE Journal

Digestione delle proteine, ultrafiltrazione e cromatografia di esclusione di formato per ottimizzare l'isolamento degli esosomi da siero e Plasma sanguigno umano

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