Uso di anticorpi Anti-fosfo-girdin per visualizzare cellule intestinali ciuffo in Mouse digalleggiante digiuno Cryosections

L'obiettivo generale di questa procedura di colorazione è visualizzare le cellule del ciuffo nelle criosezioni del digiuno di topo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della gastroenterologia, come ad esempio come avviene la proliferazione delle cellule del ciuffo nell'intestino dei mammiferi durante l'infezione parassitaria. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i ricercatori con esperienza astrologica limitata possono ottenere immagini di cellule del ciuffo di alta qualità.

Inizia esponendo gli organi pelvici di un cadavere di topo appena fissato in formalina. Taglia l'estremità del retto dall'ano e separa l'intestino dal corpo tagliando il mesentere. Per isolare il digiuno, tagliare l'intestino a quattro centimetri dal lato anale dell'antro gastrico e scartare la metà anale dell'intestino tenue rimasto.

Tagliare il digiuno a metà per facilitare la procedura di lavaggio. Caricare 20 millilitri di soluzione di formalina neutra tamponata al 10% in una siringa da 20 millilitri e collegare un ago dritto calibro 18 con lo smusso rimosso. Quindi, iniettare una soluzione di formalina neutra tamponata al 10% da un'estremità del digiuno tagliato per eliminare il contenuto intestinale e fissare la superficie del lume intestinale.

Lavare il lume intestinale iniettando PBS. Quindi, sciacquare con una soluzione di gelatina liquida per sostituire il PBS. Chiudere un'estremità del digiuno tagliato mediante legatura di sutura, utilizzando una sutura tagliata in nylon 6-0.

Riempire il digiuno con gelatina liquida e chiudere l'estremità opposta mediante legatura con sutura. Quindi, fai quattro nodi di sutura per tutta la lunghezza del digiuno. Immergere i tessuti in 50 millilitri di saccarosio al 15% in una soluzione di formalina neutra tamponata al 10% per una notte, a 4 gradi Celsius.

Il giorno successivo, tagliare il digiuno in corrispondenza dei nodi di sutura per ottenere tre pezzi di digiuno simili a salsicce con entrambe le estremità legate. Allineare i pezzi in un criostampo, quindi coprire con un composto da inclusione. Congelare a scatto il criomold in isopentano raffreddato con azoto liquido.

Per preparare le sezioni di digiuno, inizia impostando sia la temperatura della camera del criostato che la temperatura dell'oggetto a meno 22 gradi Celsius. Posizionare il blocco di tessuto congelato in un criopoldo nella camera del criostato per almeno 15 minuti. Dopo 15 minuti, tagliare il blocco a metà con una lama di rasoio per esporre la sezione trasversale del digiuno.

Montare una metà del blocco su un adattatore per criostato. Sezionare il digiuno ripieno di gelatina in sezioni spesse 30 micron. Utilizzare una pinza congelata per trasferire delicatamente le sezioni in un piatto di coltura da 35 millimetri contenente 3 millilitri di PBS.

Dopo aver lavato le sezioni tre volte per cinque minuti ciascuna con 3 millilitri di PBS-T, aggiungere 3 millilitri di soluzione per il recupero dell'antigene appena preparata al piatto contenente le sezioni flottanti. Quindi, chiudere il coperchio, sigillare lo spazio tra la capsula e il coperchio con una striscia di nastro in vinile e incubare a 50 gradi Celsius in un incubatore di ibridazione per tre ore, senza agitare. Dopo l'immunocolorazione, trasferire la piastra delle sezioni colorate in PBS su un microscopio stereoscopico.

Mettere 200 microlitri di PBS in una gocciolina al centro di un vetrino bianco con codice MAS. Quindi, utilizzare un puntale per pipetta P200 per trasferire una sezione di digiuno dalla piastra alla gocciolina. Dopo aver regolato l'allineamento della sezione, aspirare tutto il PBS rimanente che circonda la sezione.

Aggiungere 20 microlitri di supporto di montaggio acquoso e posizionare un vetrino coprioggetto sopra il supporto. Sigillare immediatamente i bordi del vetrino coprioggetto con mezzi di montaggio a base di xilene e lasciare asciugare per due o tre ore prima di iniziare la microscopia confocale. Il ripieno di gelatina del digiuno preserva la forma rotonda del disco e mantiene il posizionamento verticale dei villi.

In assenza di riempimento di gelatina, le sezioni digiunali tendono ad attorcigliarsi, permettendo ai villi di oscillare all'indietro. pY1798 delinea in modo riproducibile intere cellule del ciuffo, compresa la membrana, il citoplasma del soma a forma di rocchetto e la punta luminale fortemente colorata, dove la robusta condensazione del segnale corrisponde al ciuffo sporgente di una cellula del ciuffo. La falloidina ha un'elevata affinità per l'actina filamentosa, che è presente nei microvilli che formano il bordo della spazzola intestinale.

La falloidina segna in modo riproducibile e prominente il bordo ispessito della spazzola che corrisponde a una massa di radichette che si estende dal ciuffo. La coerente co-localizzazione dei segnali di pY1798 con il bordo a spazzola prominentemente ispessito e positivo alla falloidina dimostra che questo protocollo identifica con successo le cellule del ciuffo indipendentemente dal fatto che si trovino su un villo o in una cripta. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre giorni se eseguita correttamente.

La combinazione di gelatina puntiforme a bassa emissione, criosezioni flottanti e recupero dell'antigene a bassa temperatura può essere applicata per l'immunocolorazione di altri tessuti del progetto.