Quantificazione della crescita intracellulare all'interno di macrofagi è un veloce e affidabile metodo per valutare la virulenza dei parassiti di Leishmania

L'obiettivo generale di questo esperimento è valutare la virulenza di vari ceppi di Leishmania attraverso l'infezione di macrofagi derivati dal midollo osseo murino in vitro e la successiva quantificazione della cinetica di crescita intracellulare del parassita. Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande chiave sui fattori sia del macrofago dell'ospite che dell'agente patogeno che determinano la virulenza dei parassiti infettivi della Leishmania. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di un metodo veloce, economico e affidabile che richiede un numero significativamente inferiore di animali, rispetto agli studi in vivo.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia della Leishmaniosi, in quanto può essere utilizzata per valutare l'infettività dei ceppi mutati di Leishmania o l'efficacia dei composti terapeutici. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le fasi di isolamento dei macrofagi derivati dal midollo osseo e di quantificazione del parassita intracellulare sono difficili da apprendere dai soli protocolli scritti. Inizia fissando un topo femmina di quattro o sei settimane a una tavola di dissezione e disinfettando l'animale con etanolo al 70%.

Usa le forbici per praticare un'incisione di un centimetro vicino a un'articolazione dell'anca e taglia la pelle tutto intorno all'articolazione. Tirare la pelle dalla gamba verso la caviglia per rimuovere accuratamente l'arto e tagliare il piede in corrispondenza o sotto l'articolazione della caviglia per lasciare intatta la tibia. Per localizzare l'articolazione dell'anca, manipolare il femore per identificare il punto di rotazione e utilizzare le forbici per recidere la gamba sopra l'articolazione dell'anca, lasciando intatta la testa prossimale del femore.

Rimuovere quanto più muscolo e tessuto connettivo possibile dalla gamba e mettere le ossa pulite in una capsula di Petri contenente RPMI sterile integrata con antibiotici su ghiaccio. Dopo aver raccolto la seconda serie di ossa delle gambe, utilizzare una pinza sterilizzata e una lama numero dieci per rimuovere i muscoli e il tessuto connettivo rimanenti. Trasferisci le ossa pulite in un coperchio vuoto della capsula di Petri e usa il bisturi per rimuovere entrambe le estremità di ciascuna tibia per accedere al midollo.

Usando una pinza, posizionare una tibia sulla bocca di un tubo conico da 50 millilitri sul ghiaccio e inserire la punta di un ago da 25 gauge attaccato a una siringa da 10 millilitri riempita con terreni integrati con antibiotici in un'estremità della tibia. Lavare circa 5-10 millilitri di terreno attraverso l'osso nel tubo conico fino a quando tutto il tessuto del midollo osseo rosso è stato raccolto e l'osso appare bianco. Quando tutto il midollo è stato raccolto, centrifugare il midollo osseo raggruppato e risospendere la tavolozza cellulare del midollo osseo in cinque millilitri di terreno macrofagico derivato dal midollo osseo.

Trasferire la sospensione di cellule del midollo osseo in un pallone di coltura cellulare di 175 centimetri quadrati contenente 60 millilitri di terreno sterile per macrofagi derivati dal midollo osseo e sciacquare la provetta due volte con il terreno del pallone di coltura per garantire il massimo recupero cellulare. Dopo il secondo lavaggio, trasferire un'aliquota di 30 millilitri di cellule in un secondo pallone per colture cellulari da 175 centimetri quadrati e chiudere ogni pallone con un tappo filtrante. Quindi, incubare entrambe le colture durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per consentire la separazione dei macrofagi residenti da eventuali fibroblasti contaminanti o altre cellule aderenti.

La mattina successiva, trasferire 10 millilitri di surnatante indifferenziato contenente cellule di midollo osseo da ciascun pallone in singole piastre di Petri di polistirene trattate con colture non tissutali da 100 per 15 millimetri e rimettere le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per altri due o tre giorni. Quindi, nutrire le colture con cinque millilitri di terreno macrofagico fresco derivato dal midollo osseo a 37 gradi Celsius per piatto e rimettere le piastre nell'incubatrice. Il settimo o l'ottavo giorno dopo la coltura, utilizzare una punta di aspirazione montata su una linea del vuoto per trasferire quattro vetrini di vetro da 12 millimetri sterilizzati in autoclave sul fondo di ciascun pozzetto di una piastra di coltura a sei pozzetti senza sovrapporsi.

Prepara piastre identiche per ogni punto temporale dell'esperimento. Successivamente, lavare due volte le colture di macrofagi derivate dal midollo osseo con PBS fresco a 37 gradi Celsius e cinque millilitri di PBS senza calcio e magnesio integrati con un millimolare di EDTA su ciascuna piastra. Dopo cinque minuti a 37 gradi Celsius, riunire le cellule staccate in una provetta conica da 50 millilitri, risciacquando ogni piastra due volte con altri cinque millilitri di PBS senza calcio e magnesio.

Dopo la centrifugazione, risospendere i macrofagi in 5-10 millilitri di terreno macrofagico fresco derivato dal midollo osseo su ghiaccio. Dopo il conteggio, diluire le cellule a cinque volte la concentrazione da 10 a quinta per millilitro in terreno macrofagico fresco derivato dal midollo osseo e aggiungere due millilitri di cellule per pozzetto alla piastra a sei pozzetti. Quindi, incubare le cellule per una notte nell'incubatore per colture cellulari.

Per infettare le cellule con L.amazonesis, diluire la sospensione del parassita alla molteplicità sperimentale appropriata di infezione e aggiungere da 50 a 100 microlitri di parassiti a ciascun pozzetto di tutte e sei le piastre del pozzetto, compresi tutti i punti temporali dell'esperimento. Incubare i macrofagi derivati dal midollo osseo per il periodo e la temperatura di infezione appropriati. Quindi, lavare i pozzetti tre volte con due millilitri di PBS fresco a 37 gradi Celsius senza calcio o magnesio per pozzetto e fissare i campioni del punto temporale iniziale con 1,5-2 millilitri di paraformaldeide al 2% per 10 minuti.

Per le piastre corrispondenti ai punti temporali successivi, aggiungere due millilitri di terreno macrofagico fresco derivato dal midollo osseo a ciascun pozzetto e rimettere le piastre nell'incubatore appropriato. Quindi, fissare e lavare le celle per ciascuno dei punti temporali rimanenti, come appena dimostrato, e conservare i campioni a quattro gradi Celsius in PBS fresco. Per colorare le cellule con DAPI, sostituire il surnatante con 1,5 millilitri di PBS fresco senza calcio e magnesio, integrato con lo 0,1% di detergente non ionico per 10 minuti a temperatura ambiente, seguito da tre lavaggi da due millilitri con PBS senza calcio o magnesio.

Successivamente, colorare le cellule con due microgrammi per millilitro di DAPI in un millilitro di PBS per un'ora a temperatura ambiente. Dopo tre lavaggi, posizionare il vetrino coprioggetto con la cella rivolta verso il basso su un singolo vetrino da microscopio montato con un reagente di montaggio anti-sbiadimento commerciale. Quindi, per quantificare il numero di cellule infette, utilizzare l'obiettivo dell'olio di emersione 100x di un microscopio a fluorescenza e un contatore manuale per identificare il numero di nuclei di amastigote più piccoli raggruppati attorno a ciascun grande nucleo colorato DAPI.

La leishmania ha due forme infettive, i promastigoti metaciclici, che si differenziano dai promastigoti prociclici nella fase stazionaria della coltura, e l'amastigote, la forma infettiva intracellulare che si trova all'interno dell'ospite vertebrato. Qui, gli amastigoti differenziati axenicamente possono essere visualizzati all'interno di un macrofago derivato dal midollo osseo un'ora dopo l'infezione iniziale e prima della formazione di vacuoli parassitofori tramite fusione fagolisosomiale. A 48 ore, si possono osservare distinti grandi vacuoli parassitofori che ospitano più parassiti, caratteristici di un'infezione virulenta da Leishmania.

I promastigoti in fase logaritmica non virulente, al contrario, non sono in grado di avviare lo sviluppo del vacuolo parassitoforo, non riescono a replicarsi e alla fine vengono uccisi all'interno dei macrofagi dell'ospite. In questo esperimento, è stato osservato un aumento costante del numero di parassiti metaciclici della Leishmania intracellulare wild type fino a 72 ore dopo l'infezione, mentre è stata misurata poca o nessuna crescita intracellulare per i parassiti mutanti con una ridotta importazione di ferro mitocondriale, suggerendo che l'attività mitocondriale è necessaria per la crescita del parassita all'interno dei macrofagi. Le infezioni macrofagiche effettuate con amastigoti axenici wild type e mutanti hanno mostrato un pattern di crescita intracellulare simile a quello osservato con i promastigoti metaciclici, ma con un'infettività del parassita wild type ancora più elevata rispetto a quella osservata dai promastigoti metaciclici.

È importante notare che esiste un ritardo iniziale di 24 ore per le infezioni da promastigoti metaciclici, che rappresenta il tempo necessario ai promastigoti metaciclici internalizzati per differenziarsi in amastigoti prima di iniziare a replicarsi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in 15 giorni se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante utilizzare i ceppi di topo appropriati ed eseguire un'attenta quantificazione sia dei macrofagi che delle cellule del parassita per garantire MOI coerenti in tutti gli esperimenti.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come coltivare macrofagi derivati dal midollo osseo e infettarli con Leishmania per quantificare la loro crescita intracellulare del parassita, dopo la colorazione nucleare con DAPI. Non dimenticare che lavorare con Leismania può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura dovrebbero essere sempre prese precauzioni, come l'uso di una cabina di sicurezza biologica e di dispositivi di protezione individuale e l'evitare strumenti appuntiti.