Name: Quantificazione della crescita intracellulare allinterno di macrofagi è un veloce e affidabile metodo per valutare la virulenza dei parassiti di Leishmania (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Impara a quantificare la crescita intracellulare di Leishmania in macrofagi murini derivati dal midollo osseo. Questo metodo rapido ed economico permette di valutare la virulenza dei parassiti e testare composti terapeutici.

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Questo lavoro è stato sostenuto dagli istituti nazionali di sovvenzione di salute RO1 AI067979 a NWA. YK è destinatario della borsa di studio dello studente non laureato da Howard Hughes Medical Institute/Università di Maryland College Park.

Tutte le procedure sperimentali sono stati condotti in conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio da National Institutes of Health e sono state approvate dall'IACUC di Università del Maryland. Tutti i passaggi descritti nelle sezioni da 1 a 4 dovrebbero essere eseguiti in modo sterile all'interno biologica a flusso laminare. Protezione personale dovrebbe essere usato, e deve prestare attenzione durante la manipolazione di parassiti di Leishmania vivi durante tutte le fasi di sperimentazione.
1. isolamento e la differenziazione dei macrofagi derivate da midollo osseo (saggi)8,30,31
<ol><li>
Giorno 0: Sacrificio di 4 - 6-settimana-vecchio femmina C57BL/6 o il mouse BALB/c in una camera di CO2 e confermare la morte tramite dislocazione cervicale. Garantire una sterilizzazione di forbici e pinze tenendole imbevuto di etanolo al 70%. Guanti a spruzzo con etanolo al 70% per consentire sterile gestione durante tutto il processo di isolamento delle cellule del midollo osseo.</li>
	<li>Mouse sicuro sacrificato per dissezione a bordo da appuntare i suoi arti e disinfettare spruzzando abbondantemente con etanolo al 70%.</li>
	<li>Praticare una piccola incisione (circa 1 cm) con le forbici vicino l'articolazione dell'anca. Inserire con cautela forbici sotto la pelle per separare il muscolo sottostante e tagliare la pelle tutto intorno l'articolazione dell'anca. Nota: La scheda di dissezione può essere ruotato per consentire il miglioramento dell'accesso all'articolazione dell'anca.</li>
	<li>Con attenzione deglove pelle dalla coscia tirando verso la caviglia e rimuovere. Tagliare il piede alla caviglia, facendo molta attenzione a tagliare o di sotto della caviglia congiunta per lasciare la tibia completamente intatto. Nota: Il perone in questa fase è vagamente collegato e possa essere facilmente separato con il forcipe.</li>
	<li>Individuare manualmente l'articolazione dell'anca manipolando il femore per identificare il punto di rotazione. Con attenzione usare le forbici per tagliare la gamba sopra l'anca di lasciare intatta la testa del femore prossimale.</li>
	<li>Rimuovere quanto più muscolo e del tessuto connettivo come possibile dalla coscia con le forbici. Rimuovere qualsiasi pelle restante dalla caviglia e qualsiasi materiale osseo in eccesso sopra l'articolazione dell'anca.</li>
	<li>Posizionare le ossa della gamba puliti in RPMI sterile completati con penicillina/streptomicina (1% di concentrazione finale) in una capsula Petri sul ghiaccio.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 1.4 attraverso 1.6 per isolare la tibia e femore di altra gamba posteriori.</li>
	<li>Rimuovere qualsiasi muscolo e tessuto connettivo rimanenti dalle ossa ammollo in RPMI utilizzando pinze sterili e sterile #10 lama.</li>
	<li>Mettete le ossa sul coperchio scatola di Petri. Tagliare la tibia attentamente con la lama immediatamente di sopra dell'articolazione della caviglia per accedere il midollo. Rimuovere la tibia dal resto della gamba di taglio immediatamente sotto l'articolazione del ginocchio.</li>
	<li>Disegnare 10 mL sterili RPMI supplementato con penicillina/streptomicina (1% di concentrazione finale) una siringa 10 mL e fissare un ago 25G.</li>
	<li>Saldamente la tibia con il forcipe, verticalmente sopra un tubo conico da 50 mL su ghiaccio. Usare la siringa per iniettare delicatamente circa 5 mL RPMI nell'estremità dell'osso per svuotare il midollo osseo fuori l'altra estremità nella provetta conica. Sciacquare il midollo osseo con un totale di 10 mL RPMI fino a quando l'osso diventa bianco. Nota: Dopo aver sciacquato, l'osso dovrebbe diventare bianco. In caso contrario, continuare a sciacquare per rimuovere del midollo. Potrebbe essere necessario essere assettato indietro con la lama se è troppo stretta per inserire l'ago l'estremità distale della tibia.</li>
	<li>Tagliare il femore immediatamente sopra l'articolazione del ginocchio e immediatamente sotto l'anca per esporre entrambe le estremità dell'osso per accedere il midollo. Filo del midollo osseo dal femore con un totale di 10 mL RPMI nello stesso modo come la tibia.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 1.6 attraverso 1.13 con le ossa rimanenti di lavaggio e pulizia e raccogliere le cellule di midollo osseo svuotata in un tubo conico di singolo 50 mL Nota: Se un osso si rompe in qualsiasi punto durante la dissezione prima dell'osso vampate di calore, non utilizzare il midollo da questo osso.</li>
	<li>Centrifugare la provetta conica utilizzata per raccogliere midollo osseo svuotato da tutte le quattro ossa per 10 min a 4 ° C a 300 x g.</li>
	<li>Posto 60 mL di mezzo BMM sterile (RPMI con una concentrazione finale del 20% FBS, 1% di penicillina/streptomicina, 1,2 mM Na-piruvato, 25 µ g/mL M-CSF umano) in un matraccio di cultura cellulare2 175 cm con tappo del filtro.</li>
	<li>Scartare il surnatante in seguito a centrifugazione e risospendere il pellet cellulare di brezza su e giù per pipettaggio con 5 mL di terreno BMM dal pallone.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare nel matraccio di cultura e sciacquare il tubo conico due volte con il mezzo di BMM nel matraccio di cultura per garantire il recupero massimo delle cellule. Garantire la sospensione cellulare è mescolato completamente in mezzo e distribuire 30 mL dal matraccio di cultura cellulare2 iniziale 175 cm per una seconda 175cm2 cella matraccio di cultura con tappo del filtro.</li>
	<li>Incubare entrambi beute contenenti 30 mL di sospensione cellulare ogni notte a 37 ° C, 5% CO2 per consentire la separazione di eventuali contaminanti fibroblasti, macrofagi residenti e altre cellule aderenti.</li>
	<li>
1 ° giorno: Trasferire il surnatante contenente cellule indifferenziate del midollo osseo da boccette di 100 x 15 mm-TC-trattati Petri polistirolo a circa 10 mL/piatto e incubare a 37 ° C, 5% CO2. Scartare le beute.</li>
	<li>
Giorno 3 o 4: Aggiungere un ulteriori 5 mL di terreno di BMM (pre-riscaldato a 37 ° C) per ogni capsula di Petri e continuare l'incubazione a 37 ° C, 5% CO2.</li>
</ol>2. placcatura saggi sulle lamelle per infezione (giorno 7 o 8)
<ol><li>Preparare piastre di coltura del tessuto 6 pozzetti inserendo quattro 4 lamelle di vetro sterile 12 mm (autoclavate e conservate in un contenitore di vetro chiuso) nella parte inferiore di ogni vuota bene. Nota: Raccogliere ogni vetrino coprioggetto sterili 12 mm con una punta di aspirazione montata su una linea del vuoto. Posizionare le lamelle nei pozzetti senza sovrapposizione, rilasciando nella posizione desiderata pizzicando il tubo per interrompere vuoto.</li>
	<li>Media aspirato (e tutte le cellule non-aderenti) da capsule di Petri rivestito con aderenti del midollo osseo derivano macrofagi e delicatamente aderente risciacquo cellule 2x con soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco sterile senza cloruro di calcio e magnesio (PBS- / -) pre-riscaldato a 37 ° C.</li>
	<li>Aggiungere goccia a goccia, 5 mL sterile 1 x PBS- / - con una concentrazione finale di 1 mM EDTA per ogni capsula di Petri e incubare per 5 min a 37 ° C per staccare aderente saggi. Verificare che le cellule sono staccate usando un microscopio.</li>
	<li>Raccogliere tutto staccato le cellule sospese in PBS 1X- / - completati con 1 mM EDTA in una provetta conica da 50 mL. Sciacquare ogni piatto 2 volte con 5 mL di PBS- / - e aggiungere al pool di sospensione cellulare. Nota: Sospensione cellulare può essere diluito con ulteriori PBS- / - per proteggere i macrofagi da tossicità EDTA durante il processo di raccolta.</li>
	<li>Centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante e risospendere i macrofagi in 5-10 mL di terreno di BMM pipettando. Posto risospese cellule sul ghiaccio per impedire il collegamento di tubi e l'agglutinamento.</li>
	<li>Conteggio di cellule vitali con esclusione del Trypan blu nell'emocitometro. Nota: Per contare le celle BMM risospese in 5 mL di terreno, un mix di diluizione della sospensione di cellule 25 µ l in 445 µ l PBS- / - e 30 µ l 0,4% Trypan blu soluzione in genere permette facile quantificazione in un emocitometro (prendendo in considerazione un fattore di diluizione 20 x per il calcolo finale ). Contare solo le celle che ha fatto non macchiarsi con Trypan blu (cellule vitali). Il volume della sospensione cellulare può essere alterato se questa miscela è troppo concentrata o diluita. In generale, la resa di BMM per preparazione varia tra 2 x 107 e 5 x 107 cellule da un unico mouse.</li>
	<li>Preparare la sospensione cellulare in mezzo BMM alla concentrazione desiderata placcatura (5 x 105/ml) e disperdere sospensione a 6 pozzetti in 2 mL di terreno per pozzetto affinché ognuno riceve ben 1 x 106 macrofagi. Nota: Questo è un passaggio fondamentale che garantisce ogni bene ottiene il numero adeguato di macrofagi a coprire uniformemente i coprioggetti. Controllare che coprioggetti in pozzi non sono sovrapposte o galleggiante nel mezzo. Se è così, regolare delicatamente con una pipetta sterile.</li>
	<li>Incubare per una notte a 37 ° C, 5% CO2.</li>
</ol>3. purificazione delle forme infettive di L. amazonensis
Nota: Preparare Leishmania per infezioni - purificare metacyclic promastigotes da stazionario promastigote culture8,13, o differenziarsi promastigotes nella cultura in forma amastigote utilizzando standard L. amazonensis differenziazione axeniche protocollo6,8.
<ol><li>
Purificazione di Leishmania metacyclic promastigotes utilizzando media(Materials) gradiente di densità 33<ol>
<li>Preparare la soluzione di riserva del 40% dei media gradiente di densità in acqua sterile, privo di endotossina.</li>
		<li>Diluire la soluzione di gradienti di densità in 10 x M199 medio (senza siero) per preparare 10% concentrazione nel medium M199.</li>
		<li>Consente di filtrare tutte le soluzioni di 0,22 µm filtro. Nota: Soluzioni Stock possono essere conservate a 4 oC al buio per non più di 1 mese.</li>
		<li>Aggiungere 2 mL di soluzione al 40% densità media pendenza nel fondo di una provetta conica per centrifuga 15 mL.</li>
		<li>Strato 2 mL di soluzione di media pendenza 10% densità in M199 sopra lo strato di pendenza media del 40% densità con attenzione, usando una pipetta di Pasteur per evitare qualsiasi miscelazione tra i due strati.</li>
		<li>Raccogliere 1 x 109 parassiti da cultura stazionario-fase di centrifugazione a 1.900 x g per 10 min.</li>
		<li>Risospendere le cellule in di 6 mL Dulbecco per volta essenziale Medium (DMEM).</li>
		<li>Strato 2 mL della sospensione delle cellule direttamente sopra il 10% densità gradienti supporti i layer, delicatamente, usando una pipetta di Pasteur per evitare la commistione fra gli strati.</li>
		<li>Centrifugare il gradiente per 10 min a 1.300 x g e a temperatura ambiente. Nota: A causa delle differenze nelle proprietà fisiche tra specie di Leishmania , le condizioni di centrifugazione per ognuno potrebbero essere necessario essere leggermente regolata per garantire il massimo rendimento.</li>
		<li>Raccogliere i parassiti (arricchiti in forma promastigote metacyclic) dalla band formata al confine di media pendenza superiore 10% densità (interfaccia tra gli strati di media pendenza 0% e 10% di densità).</li>
		<li>Diluire i parassiti con un volume di DMEM e raccogliere mediante centrifugazione (1.900 x g per 10 min a temperatura ambiente).</li>
		<li>Risospendere in mezzo DMEM 500 µ l e contare in un emocitometro per quantificare il rendimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Generazione di L. amazonensis amastigoti in condizioni di coltura axenica (basso pH / temperatura elevata)6,8,13<ol>
<li>Mix 5 mL di coltura di registro-fase promastigote (pH 7,4 a 26 oC) con un volume uguale di amastigote medio (pH 4,5), utilizzando boccette di 25 cm2 (Totale 10 mL di terreno) e incubare a 26 ° C durante la notte.</li>
		<li>Spostare il pallone da 26 ° C a 32 ° C.</li>
		<li>Dopo 3 o 4 giorni, split cultura 1:5 in media amastigote a 32 ° C.</li>
		<li>Controllare i parassiti nei prossimi 3-4 giorni (massimo 7 giorni) per vedere se sono pronti per l'uso in caso di infezioni. Nota: Amastigoti axeniche sano dovrebbero avere una forma ovale, senza flagelli visibili. Amastigoti parzialmente differenziati hanno una forma ovale grande con breve flagelli. La cultura non dovrebbe avere un sacco di ciuffi - ciuffi molti sono un'indicazione di non-crescita, parassiti morenti. La cultura di amastigote può essere split 1:5 e mantenuta per un massimo di 3 settimane.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. infezione con L. amazonensis
<ol><li>Diluire sospensioni parassita secondo MOI desiderato (solitamente 3-5 metacyclic promastigotes al macrofago [MOI di 1:3 o 1:5]) e 1 amastigote al macrofago [MOI 1:1]. Aggiungere la Leishmania in PBS- / - in un volume di 50-100 µ l a ciascun pozzetto già contenente 2 mL di terreno.</li>
	<li>Incubare 1h con amastigoti e 3 h con metacyclic promastigotes a 34 oC per l'infezione di saggi. Nota: La temperatura ottimale di infezione può variare da specie.</li>
	<li>Dopo incubazione, accuratamente lavare via i parassiti gratis in ogni ben 3 volte con 2 mL di PBS- / - pre-riscaldato a 37 ° C. Nota: Disperdere PBS delicatamente per garantire che le lamelle non galleggiano sopra a vicenda. Agitare delicatamente la piastra e quindi aspirare il liquido. Utilizzare punta ad aspirazione separato se utilizza più ceppi di parassiti per evitare la contaminazione incrociata.</li>
	<li>Difficoltà 1 h o h 3 campioni del tempo-punto incubando ogni bene con 1.5-2 mL di 2% PFA in PBS- / - per 10 min. lavare 3 volte con PBS- / -. Non aspirare ultimo lavaggio e refrigerare piastre contenenti coprioggetti in PBS fino a colorazione.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di terreno di BMM fresco ad ogni pozzetto su piastre per ulteriore tempo-punti e incubare a 34 ° C.</li>
	<li>Difficoltà tempo-punti rimanenti come desiderato, come descritto al punto 4.3 e refrigerare piastre fino a colorazione.</li>
</ol>5. il DAPI colorazione e montaggio vetrino coprioggetti
<ol><li>Aspirare la PBS da pozzetti contenenti coprioggetti e aggiungere 1,5 mL di PBS- / - con detergenti non ionici 0.1%. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente, seguita da lavare 3 volte con 2 mL di PBS- / -.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di PBS- / - con 2 µ g/mL DAPI (diluito da 5 mg/mL di soluzione madre in acqua) per pozzetti contenenti coprioggetti e incubare per un altro 1 h a temperatura ambiente. Nota: Il tempo di incubazione con DAPI è fondamentale per la corretta visualizzazione dei parassiti intracellulari di Leishmania . I nuclei del macrofago macchia rapidamente, grazie alla loro dimensione maggiore e DNA contenuto ma la macchiatura dei nuclei dei parassiti intracellulari è più lento. Pertanto, estendere il tempo di incubazione di là di ciò che è necessario per visualizzare i nuclei BMM è necessario consentire DAPI a permeare attraverso e la membrana di plasma del parassita e la membrana nucleare parassita. Con la macchia di DAPI corretta, cinetoplasto mitocondriale del DNA vicino la tasca fustigatrice del parassita possa anche essere visualizzato, oltre il DNA nucleare.</li>
	<li>Lavare ogni pozzetto contenente coprioggetti 3 x con 2 mL di PBS- / - e poi ascensore e vetrini coprioggetti flip con il forcipe di posizionare il lato di cella e montare sul vetro microscopio diapositive con un reagente di montaggio antifade commercialmente disponibili. Nota: Le lamelle sono estremamente fragili e devono gestione prudente. Evitare di mettere pressione su di loro, soprattutto contro la parete laterale dei pozzetti durante il sollevamento. Aggiungendo poche gocce di PBS- / - riduce la tensione superficiale tra il vetrino coprioggetto e bene e facilita il processo di sollevamento. Un ago di calibro fine può essere utilizzato per aiutare a indiscreti lamelle dal fondo del pozzo. Dopo aver piazzato un vetrino coprioggetto sulla diapositiva, premere delicatamente con le pinzette per far uscire eventuali bolle d'aria nei media montaggio. Se un vetrino coprioggetto è rotto o possibilmente ha girato durante il processo di sollevamento, non rimontare; utilizzare semplicemente il coprioggetto quarto ricambio.</li>
	<li>Refrigerare diapositive fino alla quantificazione.</li>
</ol>6. infezione quantificazione
<ol><li>Esaminare i vetrini colorati DAPI sotto un microscopio a fluorescenza focalizzando l'attenzione sui macrofagi utilizzando 100 X Diametro obiettivo con olio da immersione (eccitazione a 358 nm; emissione ottimale a 461 nm). Assicurarsi che la messa a fuoco sia sul livello dei macrofagi tra il vetrino e il vetrino coprioggetti.</li>
	<li>Quantificare il numero dei macrofagi (grandi nuclei macchiati con DAPI) e il numero dei piccoli nuclei di amastigote raggruppati attorno a ogni nucleo del macrofago (Vedi Figura 2A, DAPI) per ogni campo di visibilità, utilizzando un contatore manuale. Nota: I nuclei Amastigote non siate tutti visibili in un piano di messa a fuoco a causa della loro piccola dimensione. Contare quelli che sono visibili quando è focalizzato sui nuclei del macrofago e quindi utilizzare la messa a fuoco micrometrica per verificare per nuclei di parassita nei piani sopra e sotto i nuclei del macrofago.</li>
	<li>Spostarsi in un altro campo di visibilità per ripetere la quantificazione. Utilizzare una chiave di contatore separato per tenere traccia del numero di campi contato. Muoversi attraverso i campi visivi in file parallele attraverso ogni vetrino coprioggetti, per evitare sovrapposizione di conteggio.</li>
	<li>Quantificare un minimo di 200 macrofagi al vetrino coprioggetti. Quantificare ogni punto di tempo dell'infezione in triplice copia (3 lamelle). Contare il coprioggetto quarto se uno del precedente non è adatto per il conteggio a causa di sovrapposizione vetrino coprioggetti, montaggio povero, rottura vetri, ecc. Nota: Se 200 macrofagi non possono essere conteggiati su qualsiasi un vetrino coprioggetti, conteggio quarto la ruota di scorta.</li>
	<li>Calcolare i tassi di infezione come macrofagi amastigoti/macrofago o amastigoti/100 e determinare percentuale i macrofagi infettati dai dati grezzi quantificazione.</li>
</ol>

Gli autori dichiarano che non hanno nessun concorrenti interessi finanziari,

I dati quantitativi di prodotto da BMM infezione dosaggio descritto in precedenza, consente ai ricercatori di ottenere tassi di infezione e una determinazione affidabile delle modifiche nelle proprietà di virulenza in un relativamente breve periodo di tempo (massimo 2 settimane, rispetto al 2 mesi previsti per gli esperimenti in vivo ). Questo metodo si basa sul colorante specifico DNA DAPI, che in particolare i nuclei del macrofago e parassita di macchie e permette la rapida identificazione e quantificazione de...

La leishmaniosi si riferisce ad un ampio spettro di malattie umane causate da specie di protozoo parassita del genere Leishmania. Circa 12 milioni di persone sono attualmente infettati con Leishmania in tutto il mondo, e più di 350 milioni sono a rischio. La patologia della malattia dipende dalla specie di Leishmania e fattori dell'ospite, e sintomi variano da lesioni cutanee autorigenerante innocuo a forme visceralizing letali. Se non trattata, viscerale di leishmaniosi è fatale, classifica solo dopo la malaria come la più letale malattia umana causata tramite l'infezione con un protozoo parassita1. Nonostante le differenze ad ampio raggio in patologia di malattia ed i sintomi, tutte le specie di Leishmania hanno un ciclo di vita digenica alternando fasi promastigote ed amastigote all'interno insetti e vertebrati padroni di casa, rispettivamente. Interno vertebrati, Leishmania macrofagi host per invasione di destinazione e inducono la formazione di vacuoli parasitophorous (PVs), compartimenti acidi con proprietà di phagolysosomes dove le forme altamente virulento amastigote replicano. Amastigoti persistono nei tessuti dell'ospite durante le infezioni croniche e possono essere passate avanti a non infetti Pappataci, completando il ciclo di trasmissione. Pertanto, nel contesto dello sviluppo di malattia umana, amastigoti sono i più importanti di forma di Leishmania del ciclo di vita2. Indagando come amastigoti replicano all'interno del macrofago PVs è fondamentale per la comprensione Leishmania virulenza3,4,5,6,7 e per la sviluppo di nuove terapie efficaci.
Descriviamo qui un metodo utilizzato regolarmente dal nostro laboratorio per studiare la Leishmania infezione e la replicazione in macrofagi derivate da midollo osseo (saggi), che comporta la valutazione quantitativa del numero di intracellulare Leishmania nel corso del tempo. Il processo prevede la raccolta dei monociti da midollo osseo di topo e la differenziazione di macrofagi nella cultura, infezione in vitro con forme infettive (metacyclic promastigotes o amastigotes) di Leishmania e quantificazione della numero di parassiti intracellulari ad ogni intervallo di 24 ore per un periodo di 72-96 h dopo l'infezione. Questo test è stato utilizzato nel nostro laboratorio per determinare l'impatto di diversi fattori ambientali e geni di parassita, compresa l'individuazione del ruolo critico di ferro nel promuovere L. amazonensis virulenza che più ulteriormente è stata convalidata da zampa studi di sviluppo di lesione in topi6,8,9,10,11,12,13,14,15 . Poiché tutte le specie patogene di Leishmania stabiliscono loro nicchia replicativa dentro macrofagi host, questo test può essere utilizzato universalmente per le determinazioni di virulenza in tutte le specie di Leishmania .
L'esecuzione di infezioni BMM consente analisi delle interazioni ospite-parassita a livello di singola cellula e quindi una più ampia comprensione di come i parassiti di Leishmania interagiscono con loro microambiente ospite preferito, il PVs dei macrofagi. Macrofago infezione saggi sono stati utilizzati con successo da più gruppi16,17,18,19,20,21,22 per esplorare funzioni del macrofago host e Leishmania specifici geni e di loro possibili implicazioni nella complessa interazione che caratterizza l'infezione intracellulare. Le infezioni BMM permetterà la quantificazione della crescita del parassita come una lettura dell'impatto dei fattori dell'ospite che influenzano la sopravvivenza intracellulare, come produzione di ossido nitrico microbicida, generazione di specie reattive dell'ossigeno e altre condizioni avverse ha rilevato all'interno del lysosome-come PVs23. Saggi di infezione del macrofago inoltre sono stati utilizzati per identificare potenziali contatti di droga di anti-leishmanial per sviluppo terapeutico13,24.
La natura in vitro delle infezioni BMM fornisce parecchi vantaggi sopra altri metodi per valutare la virulenza di Leishmania . Tuttavia, diversi studi precedenti, esaminare i meccanismi di sopravvivenza del parassita intracellulare nel corso del tempo non ha fatto quantificare l'infezione come un tasso20,21,24. Inoltre, molti studi focalizzati sulle seguenti infezioni in vivo nel corso del tempo ha fatto misurando la dimensione della lesione cutanea e altri sintomi fisiologici che sono solo indirettamente collegati ad parassita replica25,26 , 27. in vivo l'infezione è un approccio rigoroso per valutare la virulenza del parassita, ma misure lesione basate su grassatore gonfiore da solo sono spesso inadeguate, come essi riflettono la risposta infiammatoria nei tessuti infetti e non il numero assoluto di parassiti. Per questo motivo, lo sviluppo della lesione grassatore saggi devono essere seguite da quantificazione del carico parassita nei tessuti infetti, una procedura che richiede diluizione limitante lunghi saggi28. Inoltre, in vivo gli studi coinvolgono spesso sacrificare animali multipli in diversi punti nel tempo per estrarre tessuti di interesse6,8,9,10, 11 , 13. al contrario, grandi numeri di saggi possono essere ottenuti da un solo animale, e queste cellule possono essere placcate in condizioni tali da consentono la valutazione dell'infezione in vari punti nel tempo. Inoltre, rispetto agli studi in vivo , in vitro infezioni BMM l'esecuzione consente maggiore controllo sulle condizioni sperimentali. Quantificare i macrofagi infetti con i parassiti stessi consente un controllo preciso della molteplicità di infezione (MOI) e di condizioni di coltura. Controllo preciso su questi fattori può essere chiave nell'identificare le caratteristiche delle vie cellulari discrete e nella comprensione del loro impatto sul corso dell'infezione.
Dato questi vantaggi, è un po' sorprendente che molto pochi gruppi studiando Leishmania virulenza finora hanno preso pieno vantaggio della valutazione quantitativa di replica intracellulare in macrofagi. In questo articolo, discutiamo i problemi comuni che possono ostacolare l'utilizzazione più ampia di questo test e fornire un protocollo dettagliato per facilitare la corretta esecuzione. Considerando la sua precisione e versatilità, il BMM infezione analisi che descriviamo qui può non solo essere utilizzata per esplorare le interazioni ospite-patogeno che influenzano la virulenza di Leishmania , ma anche di studiare altri microrganismi che replicano all'interno macrofagi29. D'importanza, questo test può essere sviluppato anche come metodo di screening pre-clinico rapido ed economico per lo sviluppo di farmaci anti-leishmanial.

<table><tbody><tr><td>piastra per coltura cellulare a 6 pozzetti</td><td>Cellstar</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Acros Organics</td><td>AC147440250</td><td></td></tr><tr><td>Punte per pipette con barriera all'aerosol (100-1000 &mu; L)</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-404</td><td></td></tr><tr><td>Punte per pipette con barriera per aerosol (20-200 &mu; L)</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-430</td><td></td></tr><tr><td>Punte per pipette con barriera all'aerosol (2-20 &mu; L)</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-432</td><td></td></tr><tr><td>Bard-Parker Rib-Back Lama chirurgica in acciaio al carbonio #10</td><td>Aspen Surgical</td><td>371110</td><td></td></tr><tr><td>BD Luer-Lok Tip 10 mL Siringa</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>BD Precisionglide Needle, 25G&nbsp;</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>305124</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per colture cellulari 35 mm x 10 mm</td><td>Cellstar</td><td>627 160</td><td></td></tr><tr><td>Pallone per colture cellulari</td><td>Cellstar</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>Bicchieri di copertura: cerchi da 12 mm</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>D-Biotina</td><td>J.T. Baker</td><td>C272-00</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Alcool etilico 200 proof</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm x 15 mm non trattato TC-trattato Piastra di Petri in polistirene Corning</td><td></td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll400</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8016</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>Nikon</td><td>E200</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-topo IgG Texas rosso</td><td>Invitrogen</td><td>T-862</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-coniglio IgG AlexaFluor488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Hemin</td><td>Tokyo Chemical Industry Co. LTD</td><td>H0008</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Isoton II Diluente</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td>8546719</tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Gemini</td><td>400-106</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199 (10X)</td><td>Gibco</td><td>11825-015</td><td></td></tr><tr><td>Na piruvato (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Alfa Aesar</td><td>43368</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Gemini</td><td>400-109</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (-/-)</td><td>ThermoFisher</td><td>14200166</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga coniche in polipropilene 15 mL</td><td>Cellstar</td><td>188 271</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga coniche in polipropilene 50 mL</td><td>Cellstar</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>Reagente antisbiadimento ProLong Gold</td><td>ThermoFisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Lamp-1 anti-topo per ratto</td><td>Studi sullo sviluppo Banca degli ibridomi</td><td>1D4B</td><td></td></tr><tr><td>Umano Ricombinante M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>Reichert Bright-Line&nbsp; Emocitometro&nbsp;</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 (1X)</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 Tensioattivo</td><td>Millipore Sigma</td><td>TX1568-1</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Forbici delicate, 4 1/2"</td><td>VWR</td><td>82027-582</td><td></td></tr><tr><td>Pinze da dissezione, punta fine</td><td>VWR</td><td>82027-386</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>VWR</td><td>16004-368</td><td></td></tr><tr><td>Contatore di particelle Z1 Coulter, doppia soglia</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605699</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificazione della crescita intracellulare all'interno di macrofagi è un veloce e affidabile metodo per valutare la virulenza dei parassiti di leishmania

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Il ciclo di vita di Leishmania, l'agente eziologico della leishmaniosi, alterna fasi promastigote ed amastigote all'interno l'insetto e vertebrati padroni di casa, rispettivamente. Mentre patogeni sintomi della leishmaniosi possono variare ampiamente, da lesioni cutanee benigne a forme altamente fatale malattia viscerale a seconda della specie infettiva, tutte le specie di Leishmania risiedono all'interno di host macrofagi durante la fase di vertebrati di il ciclo di vita. Leishmania infettività pertanto è direttamente correlata alla sua capacità di invadere, sopravvivere e replicare all'interno di vacuoli parasitophorous (PVs) all'interno dei macrofagi. Così, valutando la capacità del parassita di replicare intracellulare serve come un metodo affidabile per determinare la virulenza. Studiare lo sviluppo di leishmaniosi utilizzando modelli animali è lungo, noioso e spesso difficile, specialmente con il patogeno importante forme viscerali. Descriviamo qui una metodologia per seguire lo sviluppo intracellulare di Leishmania in macrofagi derivate da midollo osseo (saggi). Parassita intracellulare numeri sono determinati a intervalli di 24 h per 72-96 ore dopo l'infezione. Questo metodo consente una determinazione affidabile degli effetti di vari fattori genetici sulla virulenza di Leishmania . Ad esempio, mostriamo come un'omissione di singolo allele del gene del trasportatore mitocondriale di ferro Leishmania (LMIT1) altera la capacità del ceppo mutante Leishmania amazonensis LMIT1/ΔLmit1 a crescere all'interno di saggi, riflettendo una drastica riduzione nella virulenza rispetto al wild type. Questo test consente inoltre un controllo preciso delle condizioni sperimentali, che possono essere manipolati individualmente per analizzare l'influenza di vari fattori (nutrienti, specie reattive dell'ossigeno, ecc.) sull'interazione ospite-patogeno. Pertanto, l'esecuzione appropriata e la quantificazione degli studi infezione BMM forniscono un'alternativa non invasiva, veloce, economica, sicura e affidabile agli studi di modello animali convenzionali.

Leishmania ha due forme infettive - metacyclic promastigotes che differenziano da prociclico promastigotes presso la fase stazionaria della cultura e amastigoti, che sono le fasi intracellulari (Figura 1). In alcune specie di Leishmania come L. amazonensis, amastigoti possono essere differenziate anche in coltura axenica a spostando le celle promastigote per abbassare il pH (4.5) e temperatura elevata (32 ° C), condizioni simili a q...

Tutte le specie di Leishmania patogene risiedono e replicano all'interno dei macrofagi dei loro ospiti vertebrati. Qui, presentiamo un protocollo per infettare i macrofagi murini derivate da midollo osseo nella cultura con Leishmania, seguita da quantificazione precisa della cinetica di crescita intracellulare. Questo metodo è utile per lo studio di singoli fattori che influenzano l'interazione ospite-patogeno e la virulenza di Leishmania .

Quantificazione della crescita intracellulare all'interno di macrofagi è un veloce e affidabile metodo per valutare la virulenza dei parassiti di Leishmania

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è valutare la virulenza di vari ceppi di Leishmania attraverso l'infezione di macrofagi derivati dal midollo osseo murino in vitro e la successiva quantificazione della cinetica di crescita intracellulare del parassita. Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande chiave sui fattori sia del macrofago dell'ospite che dell'agente patogeno che determinano la virulenza dei parassiti infettivi della Leishmania. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di un metodo veloce, economico e affidabile che richiede un numero significativamente inferiore di animali, rispetto agli studi in vivo.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia della Leishmaniosi, in quanto può essere utilizzata per valutare l'infettività dei ceppi mutati di Leishmania o l'efficacia dei composti terapeutici. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le fasi di isolamento dei macrofagi derivati dal midollo osseo e di quantificazione del parassita intracellulare sono difficili da apprendere dai soli protocolli scritti. Inizia fissando un topo femmina di quattro o sei settimane a una tavola di dissezione e disinfettando l

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Imaging in vivo del transgenico parassiti Leishmania in un host live

Un saggio parassita-salvataggio e di trasformazione con THP1 cellule...

Un test Parasite salvataggio e di trasformazione per screening Antileishmanial contro intracellulare<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigoti in THP1 umana linea cellulare Leucemia acuta Monocytic

Questo video dimostra una tecnica di quantificazione in vitro per determinare l'infezione da Listeria monocytogenes dei macrofagi mediante il test dell'unità formante colonie. Le colonie batteriche sulla piastra di agar rappresentano la popolazione batterica intracellulare che sfugge al meccanismo di difesa dell'ospite e sopravvive all'interno dei macrofagi.

Quantificazione dell'infezione batterica nelle cellule ospiti mediante il saggio dell'unità formante colonia

Questo video indaga la virulenza della Leishmania trattando i macrofagi con promastigoti metaciclici, con conseguente formazione di amastigoti intracellulari. La conferma della virulenza della Leishmania si ottiene attraverso la colorazione con colorante fluorescente con acido nucleico. Questa intuizione può contribuire allo sviluppo di nuove terapie per la leishmaniosi.

Valutazione della virulenza della Leishmania nei macrofagi in coltura

Questo video mostra un test per quantificare la crescita intracellulare dei parassiti nei macrofagi derivati dal midollo osseo (BMM). Le cellule macrofagiche sono infettate dagli stadi invasivi mobili e non mobili della Leishmania, rispettivamente i promastigoti metaciclici e gli amastigoti. I parassiti invadono i macrofagi, interiorizzandosi in un vacuolo parassitoforo e moltiplicandosi all'interno. La crescita intracellulare del parassita viene quantificata utilizzando un microscopio dopo...

Un test in vitro per quantificare la crescita intracellulare del parassita nei macrofagi

Descriviamo entrambe le analisi in vitro e in vivo di infezione che possono essere utilizzate per analizzare le attività dei fattori ospite-codifica.

Utilizzando un agente patogeno batterico alla sonda per le risposte cellulari e organismica-livello Host

Qui, presentiamo un protocollo compilato per valutare l'infezione cutanea dei topi con Leishmania amazonensis. Questo è un metodo affidabile per studiare la virulenza dei parassiti, consentendo una visione sistemica della risposta dell'ospite vertebrato all'infezione.

Infezione in vivo con Leishmania amazonensis per valutare la virulenza dei parassiti nei topi

Il meccanismo associato alla fagocitosi nell'infezione da Leishmania rimane poco conosciuto. Qui, descriviamo i metodi per valutare gli eventi precoci che si verificano durante l'interazione di Leishmania con le cellule ospiti.

Studiare la fagocitosi della Leishmania usando la microscopia confocale

Qui presentiamo una valutazione longitudinale di criceti dorati infettati per via intraperitoneale (IP) o per via intragengivale (IG) con L. infantum-Luc mediante imaging bioluminescente e mediante PCR. I criceti sono stati valutati 1 giorno dopo l'infezione (1 dpi), 1 settimana dopo l'infezione (8 dpi) e 3 settimane dopo l'infezione (22 dpi) e soppressi al 50° dpi e 8 mesi dopo l'infezione.

In vivo Imaging di criceti infetti da Leishmania infantum mediante inoculazione gengivale di amastigoti axenici che esprimono luciferasi

Incroci genetici di parassiti della malaria roditori vengono eseguite da mangiare due parassiti geneticamente distinte alle zanzare. Ricombinante progenie vengono clonati dal sangue del mouse dopo aver lasciato le zanzare a mordere topi infettati. Questo video mostra come produrre incroci genetici...

Protocollo per la produzione di un incrocio fra i roditori parassiti della malaria

Impara a quantificare la crescita intracellulare di Leishmania in macrofagi murini derivati dal midollo osseo. Questo metodo rapido ed economico permette di valutare la virulenza dei parassiti e testare composti terapeutici.

Quantificazione della crescita intracellulare allinterno di macrofagi è un veloce e affidabile metodo per valutare la virulenza dei parassiti di Leishmania (Video) | JoVE Journal

Quantificazione della crescita intracellulare all'interno di macrofagi è un veloce e affidabile metodo per valutare la virulenza dei parassiti di Leishmania

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