Generazione di monomero Exon1 huntingtina nativo, senza tag e fibrille usando una strategia di fusione di SUMO

Questo metodo ci permette di produrre l'esone uno privo di tag che riporta la sequenza nativa della proteina e offre nuove opportunità per studiare la funzione strutturale di questa proteina, permettendoci così di comprendere la sua funzione in salute e in malattia. I principali vantaggi qui sono la semplicità, l'efficienza e la robustezza del metodo. Eliminando l'eterogeneità della sequenza, questo metodo consentirà e faciliterà il confronto e la riproducibilità tra diversi laboratori.

Sebbene questo metodo sia stato sviluppato per la produzione dell'esone uno di Huntingtina, può essere applicato anche ad altri sistemi inclini all'aggregazione come il peptide beta-amiloide e l'alfa-sinucleina. In primo luogo, filtrare un surnatante precedentemente isolato contenente la proteina di fusione His-SUMO huntingtina esone uno utilizzando un filtro a siringa da 0,45 micrometri. Rimuovere un campione da 20 microlitri del surnatante filtrato per l'analisi SDS-PAGE.

Riempire il lisato chiarificato in un Superloop. Isolare la proteina di fusione His-SUMO Huntingtina esone uno dal lisato batterico chiarificato mediante cromatografia di affinità con metalli immobilizzati su un sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni a quattro gradi Celsius. Passare 10 volumi di colonna o 200 millilitri di tampone A a 10 millilitri al minuto per lavare via le proteine non legate.

Eluire la proteina di fusione con 2,5 volumi di colonna o 50 millilitri di tampone B al 100% a due millilitri al minuto. Prelevare 20 microlitri di ciascuna frazione per l'analisi SDS-PAGE. Aggiungere 20 microlitri di colorante di caricamento a ciascun campione.

Caricare due microlitri di proteina grezza, la frazione non legata, la frazione di lavaggio e ciascuna frazione del picco di eluizione su un gel al 15%. Far funzionare il gel per 90 minuti a 180 volt. Al termine della corsa, colorare il gel con il colorante Coomassie secondo le istruzioni del produttore.

Raggruppare le frazioni contenenti la proteina di fusione in base al picco del cromatogramma. Quindi aggiungere 100 millimolari di DTT e 100 millimolari di L-cisteina alle frazioni raggruppate e sciogliere invertendo delicatamente il tubo. Per preparare il solvente A per la purificazione HPLC, aggiungere due millilitri di acido trifluoroacetico a una bottiglia d'acqua da due litri.

Per preparare il solvente B, aggiungere 2,5 millilitri di acido trifluoroacetico a un flacone da 2,5 litri di acetonitrile. Preparare il sistema HPLC come suggerito dal produttore. Eseguire una sequenza di pezzi grezzi per garantire una colonna pulita.

Successivamente, prelevare 100 microlitri della proteina di fusione prima dell'aggiunta di ULP1 per monitorare la reazione di scissione da parte dell'UPLC. Trasferire 20 millilitri della proteina di fusione in una nuova provetta da 50 millilitri e aggiungere 0,4 millilitri di soluzione madre ULP1. Incubare il campione su ghiaccio e mantenere la proteina di fusione rimanente sul ghiaccio.

Non conservare la proteina durante i passaggi intermedi e procedere con la purificazione fino al completamento. Ogni 10 minuti, rimuovere 100 microlitri della reazione di scissione per monitorare l'andamento dell'UPLC. Dopo aver centrifugato i campioni, analizzare due microlitri di ciascun surnatante mediante UPLC.

Confrontare i cromatogrammi ottenuti per il campione prima dell'aggiunta di ULP1 e i campioni prelevati dopo. Una volta completata la scissione di SUMO, filtrare il campione con un filtro per siringa da 22 micrometri. Successivamente, purificare il campione filtrato mediante HPLC in fase inversa.

Analizza le frazioni HPLC mediante UPLC e ESI-MS. Frazioni di pool di purezza simile in tubi di plastica da 50 millilitri. Congelare i campioni in azoto liquido e liofilizzare.

Quindi trasferire la proteina liofilizzata in provette di plastica da due millilitri e conservarla a meno 20 gradi Celsius. Sciogliere 100 microgrammi di esone liofilizzato di Huntingtina, uno su otto microlitri di acido trifluoroacetico puro in una provetta da 1,5 millilitri. Dopo l'incubazione per 20 minuti a temperatura ambiente, far evaporare con cura l'acido trifluoroacetico sotto una cappa aspirante con un getto di azoto o argon.

Una volta che la proteina è asciutta, scioglierla in 100 microlitri di acqua. Quindi analizzare due microlitri di campione mediante UPLC. Ora mescola 20 microlitri di soluzione proteica con 20 microlitri di colorante 2X.

Analizza campioni di proteine da uno a 10 microgrammi mediante SDS-PAGE. Far funzionare il gel per 90 minuti a 180 volt. Al termine della corsa, colorare il gel con il colorante Coomassie secondo le istruzioni del produttore.

Preparare 10 millilitri di DPBS in una provetta da 50 millilitri. Filtrare la soluzione DPBS attraverso un filtro da 2 micrometri prima di ogni utilizzo. Successivamente, sciogliere 150 microlitri di esone liofilizzato di Huntingtina uno su 12 microlitri di acido trifluoroacetico puro in una provetta da 1,5 millimetri.

Dopo l'incubazione per 20 minuti a temperatura ambiente, far evaporare con cura l'acido trifluoroacetico in una cappa aspirante con un getto di azoto o argon. Sciogliere la proteina disaggregata in un millilitro di DPBS pre-raffreddato e regolare il pH tra 7,2 e 7,4 con un idrossido di sodio molare. Quindi filtrare la soluzione proteica attraverso un filtro centrifugo da 100 kilodalton in tubi di plastica da 1,5 millilitri.

Determinare la concentrazione dell'esone uno dell'huntingtina utilizzando una curva di calibrazione UPLC basata sul rilevamento dell'analisi degli amminoacidi. Quindi calcola la quantità di DPBS che deve essere aggiunta per ottenere una concentrazione di tre micromolari di Huntingtina esone uno. Diluire la proteina a tre micromolari aggiungendo la quantità calcolata di DPBS alla provetta.

Mantenere la provetta in ghiaccio fino all'inizio del protocollo di aggregazione. La validazione mediante elettromicroscopia e altre tecniche deve essere eseguita al fine di convalidare che il protocollo di disaggregazione sia riuscito a rimuovere eventuali aggregati preformati. La sequenza completa di amminoacidi della proteina di fusione espressa è mostrata qui.

Qui viene mostrato uno schema del plasmide e della proteina di fusione espressa. L'esone Huntingtina di His-SUMO uno si esprime a un livello medio, e la maggior parte della proteina di fusione è presente nella frazione solubile dopo la lisi, sia per la variante 23 glutammine che per la variante 43 glutammina. Sia la proteina di fusione wild-type che quella mutante possono essere arricchite a circa l'80% di purezza mediante cromatografia di affinità con metalli immobilizzati.

Qui sono mostrati la scissione del tag His-SUMO e la purificazione dell'esone uno di Huntingtina. Il picco originale della proteina di fusione viene consumato e compaiono due nuovi picchi ben separati corrispondenti al tag His-SUMO e all'esone Huntingtina uno. Sia l'esone uno di Huntingtina, 23 glutammine che 43 glutammine possono essere separati dal tag His-SUMO mediante HPLC in fase inversa e sono stati ottenuti in elevata purezza, come dimostrato dall'analisi UPLC, MS e SDS-PAGE.

La cinetica di aggregazione della formazione di fibrille dell'esone uno della m-Huntingtina, determinata da un saggio di sedimentazione, mostra la completa deplezione della proteina solubile dopo 48 ore di incubazione. La spettroscopia CD della struttura secondaria della proteina mostra uno spostamento delle 43 glutammine dell'esone uno dell'huntingtina dalla conformazione non strutturata a quella ricca di beta-fogli. Questo cambiamento strutturale è accompagnato dalla formazione di lunghi aggregati fibrillari come osservato dalla TEM.

Una volta padroneggiato, questo metodo per l'espressione e la purificazione dell'esone uno dell'Huntingtina può essere eseguito in tre giorni se viene eseguito correttamente. Mentre si tenta questa procedura, è molto importante ricordare che le proteine dell'esone uno dell'huntingtina, in particolare le proteine con allungamento espanso della poliglutammina, hanno un'altissima propensione all'aggregazione. Grazie a questo metodo, siamo in grado di produrre una quantità sufficiente di proteine dell'esone uno dell'Huntingtina e di eseguire studi precedentemente inaccessibili per studiare la struttura, l'aggregazione e la tossicità della proteina e per sviluppare nuovi saggi per rilevare e quantificare la forma associata alla malattia dell'esone uno dell'Huntingtina.

La stabilità e l'elevata solubilità della proteina di fusione SUMO fornisce una maggiore flessibilità nella manipolazione della proteina e consente l'introduzione di modificazioni nel contesto delle proteine di fusione che altrimenti non sarebbero possibili dopo la scissione. Speriamo che la semplicità e l'efficienza di questo metodo eliminino la necessità di utilizzare sequenze non native e sistemi modello e incoraggino ricercatori di diverse discipline a unirsi alla nostra ricerca per comprendere la biologia di questa importante proteina e sviluppare terapie efficaci per il trattamento della malattia di Huntington.