Name: Generazione di monomero Exon1 huntingtina nativo, senza tag e fibrille usando una strategia di fusione di SUMO (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Scopri un protocollo robusto per produrre monomeri e fibrille nativi senza tag della proteina Huntingtin exon 1. Questo metodo semplice ed efficiente migliora la riproducibilità degli studi strutturali e funzionali sulle malattie neurodegenerative.

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Questo lavoro è stato finanziato principalmente da sovvenzioni dalla fondazione CHDI e Swiss National Science Foundation. Ringraziamo Dr. Sophie Vieweg per utili discussioni durante lo sviluppo di questo nuovo sistema di espressione e altri membri del gruppo Lashuel per condividere la loro esperienza con questo sistema di espressione e per il loro input e prezioso feedback. Ringraziamo anche la Prof. ssa Oliver Hantschel per fornire il plasmide ULP1. Gli autori ringraziano il Dr. John B. Warner e Dr. Senthil K. Thangaraj per revisione critica del manoscritto

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<li>DiFiglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+Huntingtin+in+Neuronal+Intranuclear+Inclusions+and+Dystrophic+Neurites+in+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aggregation of Huntingtin in Neuronal Intranuclear Inclusions and Dystrophic Neurites in Brain.</a> Science. 277 (5334), 1990-1993 (1997).</li>
<li>Atwal, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+has+a+membrane+association+signal+that+can+modulate+huntingtin+aggregation%2C+nuclear+entry+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Huntingtin has a membrane association signal that can modulate huntingtin aggregation, nuclear entry and toxicity.</a> Human Molecular Genetics. 16 (21), 2600-2615 (2007).</li>
<li>Sathasivam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+splicing+of+HTT+generates+the+pathogenic+exon+1+protein+in+Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Aberrant splicing of HTT generates the pathogenic exon 1 protein in Huntington disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (6), 2366-2370 (2013).</li>
<li>Mangiarini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+1+of+the+HD+gene+with+an+expanded+CAG+repeat+is+sufficient+to+cause+a+progressive+neurological+phenotype+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exon 1 of the HD gene with an expanded CAG repeat is sufficient to cause a progressive neurological phenotype in transgenic mice.</a> Cell. 87 (3), 493-506 (1996).</li>
<li>El-Daher, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+proteolysis+releases+non-polyQ+fragments+that+cause+toxicity+through+dynamin+1+dysregulation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Huntingtin proteolysis releases non-polyQ fragments that cause toxicity through dynamin 1 dysregulation.</a> EMBO Journal. 34 (17), 2255-2271 (2015).</li>
<li>Lunkes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteases+acting+on+mutant+Huntingtin+generate+cleaved+products+that+differentially+build+up+cytoplasmic+and+nuclear+inclusions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Proteases acting on mutant Huntingtin generate cleaved products that differentially build up cytoplasmic and nuclear inclusions.</a> Molecular Cell. 10 (2), 259-269 (2002).</li>
<li>Vieweg, S., Ansaloni, A., Wang, Z. M., Warner, J. B., Lashuel, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Intein-based+Strategy+for+the+Production+of+Tag-free+Huntingtin+Exon+1+Proteins+Enables+New+Insights+into+the+Polyglutamine+Dependence+of+Httex1+Aggregation+and+Fibril+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An Intein-based Strategy for the Production of Tag-free Huntingtin Exon 1 Proteins Enables New Insights into the Polyglutamine Dependence of Httex1 Aggregation and Fibril Formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (23), 12074-12086 (2016).</li>
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<li>Scherzinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+polyglutamine-containing+huntingtin+fragments+into+amyloid-like+fibrils%3A+implications+for+Huntington%27s+disease+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 96 (8), 4604-4609 (1999).</li>
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<li>Tam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chaperonin+TRiC+blocks+a+huntingtin+sequence+element+that+promotes+the+conformational+switch+to+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The chaperonin TRiC blocks a huntingtin sequence element that promotes the conformational switch to aggregation.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1279-1285 (2009).</li>
<li>Nekooki-Machida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+conformations+of+in+vitro+and+in+vivo+amyloids+of+huntingtin-exon1+show+different+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Distinct conformations of in vitro and in vivo amyloids of huntingtin-exon1 show different cytotoxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 106 (24), 9679-9684 (2009).</li>
<li>Wacker, J. L., Zareie, M. H., Fong, H., Sarikaya, M., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+and+Hsp40+attenuate+formation+of+spherical+and+annular+polyglutamine+oligomers+by+partitioning+monomer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hsp70 and Hsp40 attenuate formation of spherical and annular polyglutamine oligomers by partitioning monomer.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 11 (12), 1215-1222 (2004).</li>
<li>Legleiter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+recognize+distinct+conformational+epitopes+formed+by+polyglutamine+in+a+mutant+huntingtin+fragment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies recognize distinct conformational epitopes formed by polyglutamine in a mutant huntingtin fragment.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (32), 21647-21658 (2009).</li>
<li>Legleiter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+huntingtin+fragments+form+oligomers+in+a+polyglutamine+length-dependent+manner+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mutant huntingtin fragments form oligomers in a polyglutamine length-dependent manner in vitro and in vivo.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (19), 14777-14790 (2010).</li>
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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse con il contenuto di questo articolo.

In questo protocollo, abbiamo delineato una procedura efficace per ottenere quantità di milligrammo di nativo, senza tag Httex1 contenenti residui di glutamina 23 o 43. Questo è stato ottenuto esprimendo Httex1 come una fusione di C-terminale a un suo6-tag SUMO, che viene utilizzato per isolare la proteina di fusione dalla cella lysata di IMAC e viene scisso prima purificazione HPLC di Httex1. Mentre la strategia SUMO è stata utilizzata nella produzione di parecchie altre proteine, il nostro metodo indica che le proprietà uniche di che Sumo potrebbe essere utilizzato anche per generare intrinsecamente disordinata, aggregazione-inclini, proteine amiloidogeniche che precedentemente hanno dimostrato di essere estremamente difficile da gestire e produrre43,44. Vi presentiamo un protocollo che è semplice, facile da usare e paragonabile a un protocollo per la generazione di una proteina "ben educata". La fusione di SUMO solubilizza e stabilizza Httex1 durante l'espressione e la fase di purificazione di IMAC. Scissione precoce del tag, come osservato con il intein strategia10 e l'aggregazione non erano più un problema.
Proteine intrinsecamente disordinati sono particolarmente vulnerabili alla degradazione. Mentre la degradazione del N-terminale della regione N17 non è un problema usando questo protocollo, possono verificarsi troncamenti in PRD di Httex1. Come le proteine tronche sono molto simile a Httex1 di idrofobicità, carica e dimensione, rimuoverli con mezzi cromatografici è impegnativo, quindi è meglio prevenire la loro formazione in primo luogo. Attenersi strettamente al protocollo, sempre lavorando sul ghiaccio e utilizzando una quantità sufficiente di inibitore della proteasi dovrebbe aiutare a mantenere molto basso il livello di troncamento osservato. L'applicazione di un tag di fusione al C-terminale di Httex1 potrebbe rimuovere troncamenti in PRD facilmente come la proteina tronca perderebbe anche il tag di affinità. Tuttavia, se la sequenza nativa deve essere mantenuto che questa opzione non può essere applicata come Httex1 termina con prolina e al meglio della nostra conoscenza non ci sono nessun tag di fusione di C-terminale che è noti per indurre il clivaggio traceless ed efficiente dopo prolina.
La parte più critica del protocollo è la gestione della Httex1 liberata dopo la scissione del tag SUMO da ULP1. La proteina deve essere purificata immediatamente da RP-HPLC. Fortunatamente, questa è una reazione efficiente e veloce che di solito è completata in 10-20 min a 4 ° C. Al contrario, la strategia di intein richiesto diverse ore per la scissione completa di intein, richiedendo così un compromesso tra la fenditura incompleta e inizio aggregazione al fine di massimizzare il rendimento. Un workup veloce è necessario per mutante Httex1, come si inizierà ad aggregare alla concentrazione relativamente alta presente nella reazione di scissione, mentre la variante 23Q è stabile per un tempo più lungo. Durante la purificazione di RP-HPLC, un altro vantaggio di SUMO diventa evidente: mentre il Ssp DnaB intein è idrofobo e bastoni fortemente alla colonna, SUMO è più idrofilo ed eluisce completamente dalla colonna a fase inversa C4. Anche se ULP1 commerciale è piuttosto costoso, la proteina può essere prodotto facilmente nell'alto rendimento seguendo protocolli precedentemente pubblicati29.
L'importanza critica di applicare un protocollo di disaggregazione prima utilizzando Httex1 non può essere sottolineato abbastanza. Liofilizzato polyQ proteine quali Httex1 sono stabili e possono essere memorizzati lunghi periodi, ma non sono completamente solubili in acqua e buffer. La presenza di oligomeri preformati o fibrille potrebbe avere un impatto significativo sulla cinetica di aggregazione e proprietà biofisiche del proteina45. Il protocollo di disaggregazione descritto qui permette la disgregazione della proteina, rimozione degli aggregati preformati e generazione di una soluzione di Httex1 monomerico da un campione di liofilizzato. Abbiamo osservato la simile morfologia di cinetica e fibrilla di aggregazione per Httex1 ottenuti con il SUMO e la strategia di intein.
Rispetto ai precedenti metodi per la produzione di Httex1, la strategia SUMO descritta qui offre diversi vantaggi e si espande la gamma di possibili studi per indagare la struttura e le proprietà funzionali di questa proteina nella salute e nella malattia. La proteina di fusione di SUMO-Httex1 è facile da gestire, può essere congelato e memorizzato o mantenuto in soluzione per 24 h a temperatura ambiente, mentre il mHttex1 gratuito sarebbe aggregare rapidamente. La stabilità e l'alta solubilità delle proteine di fusione di SUMO-Httex1 offrono una maggiore flessibilità per modificare la proteina e/o introdurre modifiche enzimatiche e chimiche in mHttex1 che altrimenti non sarebbe possibile dopo fenditura. Ciò comprende l'introduzione di modificazioni post-traduzionali, fluorofori, spin etichette, tag di biotina, ecc i progressi presentati qui dovrebbero 1) facilitare futuri studi per delucidare la relazione struttura-funzione di Httex1; 2) generare nuovi strumenti per studiare l'aggregazione Htt e patologia diffusione; 3) consentire lo sviluppo di nuovi test per identificare molecole che stabilizzano mutante Httex1 e prevenire la sua aggregazione; e 4) incoraggiare gli scienziati di altri campi per portare a lavorare su questa proteina e unire la nostra ricerca per trovare cure per la malattia di Huntington.

Htt è una proteina di 348 kDa ed è stato implicato in varie funzioni fisiologiche1. Quando Htt contiene una regione di polyQ espanso di più di 36 residui nella sua estremità N-terminale, che provoca HD2,3. Patologia di HD è caratterizzata da inclusioni cellulari nel corpo striato e corteccia, che conduce alla morte neuronale e l'atrofia dei tessuti colpiti4,5. Parecchi frammenti N-terminale Htt che contengono il tratto ripetere polyQ sono stati rilevati in cervelli post mortem da pazienti con MH e sono pensati per essere generati dal processamento proteolitico della proteina huntingtina6. Gli studi recenti suggeriscono che Httex1 potrebbe anche essere formato dovuto l'impionbatura del mRNA aberrante. Httex1 contiene la mutazione patologica poliQ e sua sovraespressione in animali possa ricapitolare molte delle caratteristiche chiave di HD7, evidenziando così un possibile ruolo centrale di questo frammento in HD patologia e malattia progressione6, 8,9.
A causa l'aggregazione alta propensione del mutante Httex1 (mHttex1) con tratto poliQ espanso, la maggior parte degli esistenti sistemi di espressione si basata sulla fusione transitoria di Httex1 alle proteine (come la glutatione-S-transferasi (GST), thioredoxin (TRX) o maltosio--proteina (MBP) e/o peptidi (poli-istidina) che differenzialmente migliorano l'espressione, stabilità, purificazione e/o solubilità10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Il partner di fusione è legato al Httex1 con una breve sequenza contenente un sito di clivaggio per proteasi come la tripsina, tabacco etch proteasi virus (TEV) o PreScission per consentire la scissione e il rilascio di Httex1 prima dell'inizio dell'aggregazione o purificazione. Carenze di questi metodi includono la possibilità di lasciare ulteriori residui a causa di non-traceless scissione e la creazione di frammenti troncate a causa di miscleavage all'interno della sequenza di Httex1, oltre alla eterogeneità dovuto fenditura incompleta ( Vedi Vieweg et per più approfondita discussione su vantaggi e limiti di questo approccio)10. Per risolvere queste limitazioni, abbiamo recentemente sviluppato una strategia di espressione che consente la generazione di Httex1 privo di tag nativo per la prima volta utilizzando una transitoria fusione del N-terminale di Synechocystis SP. (Ssp) DnaB intein a Httex110. Mentre il clivaggio di intein è traceless e specifici e produce quantità di mg di proteine, soffre ancora due inconvenienti che potrebbero ridurre il rendimento: vale a dire, prematuro fenditura di intein che può verificarsi durante l'espressione e il fatto che la scissione si verifica sopra parecchie ore, che potrebbero portare alla perdita di proteine a causa di aggregazione, soprattutto per Httex1 con ripetizioni di polyQ espanso.
Per affrontare queste limitazioni e di affinare la nostra strategia per la produzione di nativi, privo di tag Httex1, abbiamo sviluppato un nuovo sistema di espressione basato sulla fusione transitoria di SUMO, più esattamente il lievito dell'omologo Smt3 a Httex1. L'applicazione del sistema SUMO per la produzione di proteine ricombinanti in primo luogo è stato pubblicato nel 200429, dove è stati dimostrati un tasso aumentato di espressione e la solubilità della proteina di fusione di SUMO. Il tag SUMO può essere clivato da ubiquitina come proteine specifiche proteasi 1 (ULP1), che non richiedono un sito di riconoscimento, ma riconosce la struttura terziaria di SUMO e praticamente eliminano la possibilità di miscleavage30. Inoltre, la fenditura di ULP1-mediata è veloce e traceless e non lascia residui aggiuntivi. La scissione precoce del tag fusion, come osservato con l'autocatalitica intein10, è completamente evitata mediante la richiesta di una proteasi esterna. Mentre la strategia SUMO è oggi ampiamente usata per la produzione di proteine ricombinanti31,32,33, dimostriamo in questa carta che è particolarmente utile per la generazione di un intrinsecamente disordinati, aggregazione-inclini, proteine amiloidogeniche come Httex1. Noi crediamo che la semplicità, l'efficienza e la solidità del nostro metodo basati su SUMO-fusione renderà più accessibili ai ricercatori di diverse discipline Httex1 nativo, privo di etichetta ed eliminano la necessità di utilizzare sequenze di non-nativi del Httex1 in vitro . Si tratta di un importante passo avanti che faciliterà gli studi futuri per delucidare il rapporto struttura-funzione di Httex1.
Il protocollo descrive la purificazione di Httex1 da 12 L di coltura batterica, ma il protocollo potrebbe essere facilmente adattato per produzioni su scala più piccola o più grande. Il protocollo descrive la produzione di tipo selvaggio Httex1 (wtHttex1) con una lunghezza di ripetizione di poliQ sotto (23Q) e mutante Httex1 (mHttex1) con un polyQ ripetere lunghezza sopra (43Q) la soglia di patogena (36Q).

<table><tbody><tr><td>Formiato di uranile (UO2(CHO2)2)</td><td>EMS</td><td>22450</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/carbonio 200 mesh, griglie Cu 50 EMS</td><td></td><td>FCF200-Cu-50</td><td></td></tr><tr><td>Cella ad alta precisione in quarzo SUPRASIL 1 mm di percorso della luce da Hellma Analytics</td><td>HellmaAnalytics</td><td>110-1-40</td><td></td></tr><tr><td>Sostanza tampone Dulbecco's (PBS senza Ca e Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA</td><td>Witech</td><td>SVA4730203</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>AxonLab</td><td>A0839.0100</td><td></td></tr><tr><td>Brodo Luria (Brodo LB di Miller)</td><td>&nbsp; Chemie Brunschwig</td><td>1551.05</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &beta;-D-1-tiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>AxonLab</td><td>A1008.0025</td><td></td></tr><tr><td>E. coli B ER2566</td><td>NEB</td><td>NEB # E4130</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma</td><td>56750-500G</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete&nbsp; Cocktail di inibitori della proteasi</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-huntingtina, a.a. 1-82</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>MAB5492</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD IgG anti-topo di capra (H + L)</td><td>Licor</td><td>925-68070</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>AxonLab</td><td>A0999.0005</td><td></td></tr><tr><td>HisPrep 16/10 colonna&nbsp;</td><td></td> Colonna HPLC <td>GE Healthcare</td> 28936551 <td></td></tr><tr><td>C4</td><td>Phenomenex</td><td>00G-4168. P0</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; 10 &micro; m C4 300 &Aring;, Colonna LC 250 x 21,2 mm, Phenomenex, 19x10 mm colonna di protezione, non incamiciata a temperatura</td></tr><tr><td>Acetonitrile HPLC</td><td>MachereyNagel</td><td>C2502</td><td></td></tr><tr><td>Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre sterile</td><td>Sarstedt AG</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro semi-micro cuvetta</td><td>Reactolab S.A.</td><td>2534</td><td></td></tr><tr><td>Superloop, raccordi da 1/16" (&Auml; KTAdesign), 50 ml</td><td>GE Healthcare</td><td>18111382</td><td></td></tr><tr><td>Acido trifluoroacetico</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>GREINER Provette per FPLC 16 x 100 mm, tappo 12,0 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>7.160 102</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 100 kD Microcon&nbsp; filtri a flusso rapido</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>MRCF0R100</td><td></td></tr><tr><td>Processore di liquidi ad ultrasuoni Vibra-cell VCX130</td><td>Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&Auml; KTA 900 dotato di collettore di frazioni&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jasco J-815 Dicroismo circolare</td><td>Jasco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters Sistema UPLC&nbsp;</td><td>Waters</td><td></td><td>C8 BEH acquity 2,1x100 mm colonna da 1,7 micron, colonna preriscaldata (40 gradi; C), portata di 0,6 mL/min, volume di iniezione di 4 &mu; </td></tr><tr><td>Sistema HPLC L waters</td><td>Rivelatore</td> UV Waters <td></td><td>2489 e modulo a gradiente quaternario 2535, loop da 20 mL in alloggiamento FlexInject</td></tr><tr><td>ESI-MS: Finnigan LTQ</td><td>Thermo Fisher Strumento</td> liofilizzatore scientifico <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>FreeZone 2.5 Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai Spirit BioTWIN&nbsp;</td><td>Microscopio elettronico FEI</td><td></td><td>dotato di una pistola LaB6 e di una telecamera CCD FEI Eagle 4K x 4K (FEI) e funzionante a 80 kV</td></tr><tr><td>37 &deg; C agitazione&nbsp; incubatrice</td><td>Infors HT multitron Biofotometro standard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>plus</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di monomero exon1 huntingtina nativo, senza tag e fibrille usando una strategia di fusione di sumo

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Malattia di Huntington (HD) è una malattia neurodegenerative ereditato fatale causata da un'espansione CAG (≥36) nel primo esone del gene MH, conseguente l'espressione della proteina huntingtina (Htt) o N-terminale frammenti della stessa con un espanso di polyglutamine ( tratto poliQ).
La exon1 della proteina huntingtina (Httex1) è il più piccolo frammento di Htt che riassume molte delle caratteristiche di HD in cellulare e animale modelli ed è uno dei frammenti più ampiamente studiati di Htt. Le piccole dimensioni del Httex1 rendono sperimentalmente più favorevoli alla caratterizzazione biofisica utilizzando tecniche standard e ad alta risoluzione rispetto ai frammenti più lunghi o Htt full-length. Tuttavia, la propensione ad alta aggregazione del mutante Httex1 (mHttex1) con aumentata polyQ contenuto (≥42) ha reso difficile sviluppare espressione efficienti e sistemi di purificazione a produrre queste proteine in quantità sufficienti e renderli accessibili al scienziati di diverse discipline senza l'uso di proteine di fusione o altre strategie che alterano la sequenza nativa della proteina. Qui presentiamo un metodo robusto e ottimizzato per la produzione di quantità di milligrammo di nativo, tag-gratuita Httex1 basata sulla fusione transitoria del piccolo ubiquitina relative al modificatore (SUMO). La semplicità e l'efficienza della strategia eliminerà la necessità di utilizzare sequenze di non-nativi di Httex1, così rendendo questa proteina più accessibile ai ricercatori e migliorare la riproducibilità degli esperimenti in laboratori diversi. Noi crediamo che questi progressi faciliterà anche futuri studi volti a chiarire la relazione struttura-funzione di Htt, nonché sviluppare nuovi strumenti diagnostici e terapie per curare o rallentare la progressione della HD.

Httex1 è espressa in e. coli con un N-terminale sua6-tag SUMO. I risultati rappresentativi della espressione e purificazione della proteina di fusione sono riassunti nella Figura 1. La sequenza di Httex1 è costituito da residui di 2-90 di Htt e inizia con Ala2, perché Met1 è completamente spaccati in vivo42. La numerazione degli aminoacidi si riferisce alla variante 23Q, la sequenza completa della proteina di fusione espressa è mostrata in Figura 1A. I plasmidi saranno depositati presso Addgene nel prossimo futuro da condividere con la Comunità. Un disegno schematico del plasmide e la proteina di fusione espressa è illustrato nella Figura 1B. His6-SUMO Httex1 esprime a un livello medio (Figura 1,C) e la maggior parte della proteina di fusione è presente nella frazione solubile dopo lisi, sia per il 23Q e la variante 43Q. La proteina di fusione migra più in alto del previsto, sulla base del peso molecolare. Questo è parzialmente dovuto la piega forte di SUMO, ma principalmente a causa della composizione insolita sequenza di Httex1, contenente principalmente residui di glutamina e prolina. Il mutante (43Q) e il wildtype (23Q) proteina di fusione può essere arricchita di ~ 80% purezza da IMAC (Figura 1D) la presenza di co-purificazione proteina ospite può essere spiegata dal livello comparativamente bassa espressione di Httex1 e il grande campione volume applicato alla colonna.
La scissione del suo6-tag di SUMO e la purificazione di Httex1 è illustrato nella Figura 2A. UPLC è uno strumento efficace per monitorare la scissione del suo6-tag SUMO (Figura 2B). Il picco originale della proteina di fusione è consumato e due picchi di nuovi e ben separati, corrispondente al suo6-SUMO tag e Httex1 vengono visualizzati. La reazione di scissione è rifinita in 10-20 min. Il Western Blot (WB) è troppo lento per monitorare in modo efficiente la reazione di scissione, ma è stato incluso nella figura per riferimento e per dimostrare la completezza del clivaggio SUMO. Entrambi Httex1 23Q e 43Q possono essere separati anche dal suo6-SUMO tag da RP-HPLC (Figura 2C) e sono stati ottenuti a elevata purezza, come indicato dall'analisi UPLC, MS e SDS-PAGE (Figura 2D).
Per illustrare che le proteine Httex1 preparate da questo metodo mantengono le proprietà di aggregazione previsto di Httex1, abbiamo valutato la cinetica di fibrillazione del mutante Httex1 a 37 ° C da un'analisi di sedimentazione, monitorare i cambiamenti nella struttura secondaria di CD spettroscopia e caratterizza la morfologia degli aggregati di TEM. Un set di dati rappresentativo delle cinetiche di aggregazione di formazione di fibrille di mHttex1 come determinato mediante un test di sedimentazione è mostrato inFigura 3A. La perdita di sostanza solubile Httex1 43Q nel tempo, a causa di formazione della fibrilla è stata quantificata tramite UPLC. Osserviamo un completo depauperamento delle proteine solubili dopo 48 ore di incubazione. Inoltre, abbiamo determinato la struttura secondaria della proteina di spettroscopia CD (Figura 3B). Httex1 43Q turni da non strutturati (λmin 205 nm) alla conformazione ricca soprattutto β-foglio (λmin 215 nm) dopo 48 ore di incubazione. Questo cambiamento strutturale è accompagnato dalla formazione di aggregati fibrillari lungo come osservabile da TEM a 48 ore (Figura 3C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig1.jpg"> Figura 1 . Espressione e purificazione del suo6-proteina di fusione di SUMO Httex1.  (A), la sequenza aminoacidica del suo6-SUMO-Httex1-QN fusione costrutti (sua6-SUMO in verde e Httex1-QN in arancione); (B) descrizione schematica dell'espressione e purificazione della proteina di fusione; (C) analisi SDS-PAGE dell'espressione e la solubilità della proteina di fusione dopo la lisi; (D) cromatogramma della IMAC purificazione della proteina di fusione e analisi delle frazioni da SDS-PAGE (barra rossa: barra di frazione non legata, blu: frazione di lavaggio, barra nera: le frazioni contenenti il picco di eluizione); <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig2.jpg"> Figura 2 . Fenditura del suo6 SUMO tag e purificazione delle proteine di Httex1-QN privo di etichetta. Descrizione schematica (A); (B) analisi di fenditura del tag SUMO con ULP1 di UPLC (blu: prima dell'aggiunta della ULP1; nero: 20 min (23Q), rispettivamente 10 min (43Q) dopo l'aggiunta di ULP1) e WB (MAB5492 1: 2000, secondario goat anti-mouse anticorpo 1: 5000); (C) cromatogramma della purificazione RP-HPLC preparativa di Httex1; D: analisi della Httex1 purificata da UPLC, SDS-PAGE ed ESI-MS; il peso molecolare previsto è Da 9943 (23Q) e Da 12506 (43Q) rispettivamente. <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig3.jpg"> Figura 3 . Aggregazione di Httex1-43Q: saggio di sedimentazione (A) basato su UPLC. (B) spettri CD della struttura secondaria a 0 h e micrografie TEM 48 h. (C) degli aggregati a 48 h (barre della scala sono 200 nm). <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Qui, presentiamo un protocollo robusto e ottimizzato per la produzione di quantità di milligrammo di monomeri nativi, privo di etichetta e fibrille di exon1, della proteina huntingtina (Httex1), basata sulla fusione transitoria del piccolo ubiquitina relative al modificatore (SUMO).

Generazione di monomero Exon1 huntingtina nativo, senza tag e fibrille usando una strategia di fusione di SUMO

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Questo metodo ci permette di produrre l'esone uno privo di tag che riporta la sequenza nativa della proteina e offre nuove opportunità per studiare la funzione strutturale di questa proteina, permettendoci così di comprendere la sua funzione in salute e in malattia. I principali vantaggi qui sono la semplicità, l'efficienza e la robustezza del metodo. Eliminando l'eterogeneità della sequenza, questo metodo consentirà e faciliterà il confronto e la riproducibilità tra diversi laboratori.Sebbene questo metodo sia stato sviluppato per la produzione dell'esone uno di Huntingtina, può essere applicato anche ad altri sistemi inclini all'aggregazione come il peptide beta-amiloide e l'alfa-sinucleina. In primo luogo, filtrare un surnatante precedentemente isolato contenente la proteina di fusione His-SUMO huntingtina esone uno utilizzando un filtro a siringa da 0,45 micrometri. Rimuovere un campione da 20 microlitri del surnatante filtrato per l'analisi SDS-PAGE.Riempire il lisato chiarificato in un Superloop. Isolare la proteina di fusione His-SUMO Huntingtina esone uno dal lisato batterico chiarificato mediante cromatografia di affinità con metalli immobilizzati su un sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni a quattro gradi Celsius. Passare 10 volumi di colonna o 200 millilitri di tampone A a 10 millilitri al minuto per lavare via le proteine non legate.Eluire la proteina di fusione con 2,5 volumi di colonna o 50 millilitri di tampone B al 100% a due millilitri al minuto. Prelevare 20 microlitri di ciascuna frazione per l'analisi SDS-PAGE. Aggiungere 20 microlitri di colorante di caricamento a ciascun campione.Caricare due microlitri di proteina grezza, la frazione non legata, la frazione di lavaggio e ciascuna frazione del picco di eluizione su un gel al 15%. Far funzionare il gel per 90 minuti a 180 volt. Al termine della corsa, colorare il gel con il colorante Coomassie secondo le istruzioni del produttore.Raggruppare le frazioni contenenti la proteina di fusione in base al picco del cromatogramma. Quindi aggiungere 100 millimolari di DTT e 100 millimolari di L-cisteina alle frazioni raggruppate e sciogliere invertendo delicatamente il tubo. Per preparare il solvente A per la purificazione HPLC, aggiungere due millilitri di acido trifluoroacetico a una bottiglia d'acqua da due litri.Per preparare il solvente B, aggiungere 2,5 millilitri di acido trifluoroacetico a un flacone da 2,5 litri di acetonitrile. Preparare il sistema HPLC come suggerito dal produttore. Eseguire una sequenza di pezzi grezzi per garantire una colonna pulita.Successivamente, prelevare 100 microlitri della proteina di fusione prima dell'aggiunta di ULP1 per monitorare la reazione di scissione da parte dell'UPLC. Trasferire 20 millilitri della proteina di fusione in una nuova provetta da 50 millilitri e aggiungere 0,4 millilitri di soluzione madre ULP1. Incubare il campione su ghiaccio e mantenere la proteina di fusione rimanente sul ghiaccio.Non conservare la proteina durante i passaggi intermedi e procedere con la purificazione fino al completamento. Ogni 10 minuti, rimuovere 100 microlitri della reazione di scissione per monitorare l'andamento dell'UPLC. Dopo aver centrifugato i campioni, analizzare due microlitri di ciascun surnatante mediante UPLC.Confrontare i cromatogrammi ottenuti per il campione prima dell'aggiunta di ULP1 e i campioni prelevati dopo. Una volta completata la scissione di SUMO, filtrare il campione con un filtro per siringa da 22 micrometri. Successivamente, purificare il campione filtrato mediante HPLC in fase inversa.Analizza le frazioni HPLC mediante UPLC e ESI-MS. Frazioni di pool di purezza simile in tubi di plastica da 50 millilitri. Congelare i campioni in azoto liquido e liofilizzare.Quindi trasferire la proteina liofilizzata in provette di plastica da due millilitri e conservarla a meno 20 gradi Celsius. Sciogliere 100 microgrammi di esone liofilizzato di Huntingtina, uno su otto microlitri di acido trifluoroacetico puro in una provetta da 1,5 millilitri. Dopo l'incubazione per 20 minuti a temperatura ambiente, far evaporare con cura l'acido trifluoroacetico sotto una cappa aspirante con un getto di azoto o argon.Una volta che la proteina è asciutta, scioglierla in 100 microlitri di acqua. Quindi analizzare due microlitri di campione mediante UPLC. Ora mescola 20 microlitri di soluzione proteica con 20 microlitri di colorante 2X.Analizza campioni di proteine da uno a 10 microgrammi mediante SDS-PAGE. Far funzionare il gel per 90 minuti a 180 volt. Al termine della corsa, colorare il gel con il colorante Coomassie secondo le istruzioni del produttore.Preparare 10 millilitri di DPBS in una provetta da 50 millilitri. Filtrare la soluzione DPBS attraverso un filtro da 2 micrometri prima di ogni utilizzo. Successivamente, sciogliere 150 microlitri di esone liofilizzato di Huntingtina uno su 12 microlitri di acido trifluoroacetico puro in una provetta da 1,5 millimetri.Dopo l'incubazione per 20 minuti a temperatura ambiente, far evaporare con cura l'acido trifluoroacetico in una cappa aspirante con un getto di azoto o argon. Sciogliere la proteina disaggregata in un millilitro di DPBS pre-raffreddato e regolare il pH tra 7,2 e 7,4 con un idrossido di sodio molare. Quindi filtrare la soluzione proteica attraverso un filtro centrifugo da 100 kilodalton in tubi di plastica da 1,5 millilitri.Determinare la concentrazione dell'esone uno dell'huntingtina utilizzando una curva di calibrazione UPLC basata sul rilevamento dell'analisi degli amminoacidi. Quindi calcola la quantità di DPBS che deve essere aggiunta per ottenere una concentrazione di tre micromolari di Huntingtina esone uno. Diluire la proteina a tre micromolari aggiungendo la quantità calcolata di DPBS alla provetta.Mantenere la provetta in ghiaccio fino all'inizio del protocollo di aggregazione. La validazione mediante elettromicroscopia e altre tecniche deve essere eseguita al fine di convalidare che il protocollo di disaggregazione sia riuscito a rimuovere eventuali aggregati preformati. La sequenza completa di amminoacidi della proteina di fusione espressa è mostrata qui.Qui viene mostrato uno schema del plasmide e della proteina di fusione espressa. L'esone Huntingtina di His-SUMO uno si esprime a un livello medio, e la maggior parte della proteina di fusione è presente nella frazione solubile dopo la lisi, sia per la variante 23 glutammine che per la variante 43 glutammina. Sia la proteina di fusione wild-type che quella mutante possono essere arricchite a circa l'80% di purezza mediante cromatografia di affinità con metalli immobilizzati.Qui sono mostrati la scissione del tag His-SUMO e la purificazione dell'esone uno di Huntingtina. Il picco originale della proteina di fusione viene consumato e compaiono due nuovi picchi ben separati corrispondenti al tag His-SUMO e all'esone Huntingtina uno. Sia l'esone uno di Huntingtina, 23 glutammine che 43 glutammine possono essere separati dal tag His-SUMO mediante HPLC in fase inversa e sono stati ottenuti in elevata purezza, come dimostrato dall'analisi UPLC, MS e SDS-PAGE.La cinetica di aggregazione della formazione di fibrille dell'esone uno della m-Huntingtina, determinata da un saggio di sedimentazione, mostra la completa deplezione della proteina solubile dopo 48 ore di incubazione. La spettroscopia CD della struttura secondaria della proteina mostra uno spostamento delle 43 glutammine dell'esone uno dell'huntingtina dalla conformazione non strutturata a quella ricca di beta-fogli. Questo cambiamento strutturale è accompagnato dalla formazione di lunghi aggregati fibrillari come osservato dalla TEM.Una volta padroneggiato, questo metodo per l'espressione e la purificazione dell'esone uno dell'Huntingtina può essere eseguito in tre giorni se viene eseguito correttamente. Mentre si tenta questa procedura, è molto importante ricordare che le proteine dell'esone uno dell'huntingtina, in particolare le proteine con allungamento espanso della poliglutammina, hanno un'altissima propensione all'aggregazione. Grazie a questo metodo, siamo in grado di produrre una quantità sufficiente di proteine dell'esone uno dell'Huntingtina e di eseguire studi precedentemente inaccessibili per studiare la struttura, l'aggregazione e la tossicità della proteina e per sviluppare nuovi saggi per rilevare e quantificare la forma associata alla malattia dell'esone uno dell'Huntingtina.La stabilità e l'elevata solubilità della proteina di fusione SUMO fornisce una maggiore flessibilità nella manipolazione della proteina e consente l'introduzione di modificazioni nel contesto delle proteine di fusione che altrimenti non sarebbero possibili dopo la scissione. Speriamo che la semplicità e l'efficienza di questo metodo eliminino la necessità di utilizzare sequenze non native e sistemi modello e incoraggino ricercatori di diverse discipline a unirsi alla nostra ricerca per comprendere la biologia di questa importante proteina e sviluppare terapie efficaci per il trattamento della malattia di Huntington.

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Un metodo è descritto per il frazionamento delle specie solubili e insolubili huntingtina mutata dalla coltura delle cellule e del cervello del mouse. Il metodo descritto è utile per la caratterizzazione e la quantificazione del flusso di proteina huntingtina ed aids nell'analizzare omeostasi della proteina nella patogenesi della malattia e in presenza di...

Frazionamento per la risoluzione delle specie di huntingtina solubili e insolubili

Vari oligonucleotidi antisenso (AON) sono stati indicati per indurre l'inclusione dell'esone (modulazione della giuntura) e salvataggio espressione SMN per l'atrofia muscolare spinale (SMA). Qui, descriviamo un protocollo per AON presenti per indurre l'inclusione dell'esone del gene SMN2 e i metodi di valutazione per determinare l'efficacia in fibroblasti di pazienti SMA.

Valutazione dell'inclusione dell'esone indotta da impiombare commutazione oligonucleotidi antisenso in fibroblasti del paziente di SMA

Questo articolo descrive i protocolli per valutare l'effetto di proteine fluorescenti sull'aggregazione e la tossicità di polyglutamine misfolded espansione per la valutazione rapida di una proteina fluorescente appena atipico nel contesto del reporter fluorescenti.

Effetto di proteine fluorescenti su Fusion partner utilizzando saggi di tossicità di Polyglutamine in lievito

Il SUMO è una proteina modificatoria di tipo ubiquitina, essenziale e altamente conservata. In questo protocollo stiamo descrivendo l'uso di una proteina di SUMO-trapping ricombinante tollerante allo stress (kmUTAG) per visualizzare i coniugati SUMO nativi e senza tag e la loro localizzazione in una varietà di tipi di cellule.

Localizzazione delle proteine di SUMO-modificate utilizzando proteine di cattura di Sumo fluorescente

L'obiettivo di questo articolo è quello di delineare i passi necessari per la generazione di fibrille da alfa-sinucleina monomerica, successivo controllo di qualità, e l'uso dei fibrili preformati in vivo.

Generazione di fibrille preformate alfa-sinucleina da monomeri e uso in vivo

Questo protocollo descrive la conversione dei fibroblasti cutanei in mioblasti e la loro differenziazione in miotubi. Le linee cellulari sono derivate da pazienti con disturbi neuromuscolari e possono essere utilizzate per indagare meccanismi patologici e testare strategie terapeutiche.

Riprogrammazione diretta dei fibroblasti umani in mioblasti per indagare le terapie per i disturbi neuromuscolari

Forniamo protocolli scalabili che coprono la progettazione di costrutti, la trasfezione transitoria, l'espressione e la purificazione di varianti proteiche di huntingtina umana a lunghezza intera in cellule HEK293.

Produzione efficiente e scalabile di varianti di huntingtina umana a lunghezza intera in cellule di mammifero utilizzando un sistema di espressione transitoria

Descriviamo qui un metodo per l'identificazione di proteine che legano piccole molecole utilizzando l'etichettatura di fotoaffinità. Il vantaggio di questa tecnica è che il legame e la marcatura covalente delle proteine bersaglio avvengono all'interno dell'ambiente cellulare vivo, eliminando il rischio di interrompere la struttura proteica nativa e le condizioni di legame dopo la lisi cellulare.

L&#39;identificazione di piccole proteine ​​che legano molecole in un nativo Cellular ambiente da Live-cell Photoaffinity Etichettatura

Scopri un protocollo robusto per produrre monomeri e fibrille nativi senza tag della proteina Huntingtin exon 1. Questo metodo semplice ed efficiente migliora la riproducibilità degli studi strutturali e funzionali sulle malattie neurodegenerative.

Generazione di monomero Exon1 huntingtina nativo, senza tag e fibrille usando una strategia di fusione di SUMO

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