Name: Valutazione vascolari agenti dinduzione Hyperpermeability nella pelle con il dosaggio di Miles (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Scopri come misurare la permeabilità vascolare nella pelle murina con il saggio di Miles utilizzando Evans Blue Dye. Questo metodo permette di quantificare la fuga vascolare indotta da agenti come VEGF in circa due ore.

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Si ringrazia Laura Denti, Valentina Senatore e il personale dell'unità risorse biologiche presso la UCL Institute of Ophthalmology per aiutare con allevamento del mouse e Camille Charoy per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del Medical Research Council (MR/N011511/1) a C. Rührberg e un British Heart Foundation PhD studentship di J.T. Brash (FS/13/59/30649).

Tutto il lavoro animale è stato effettuato seguendo UK Home Office e le linee guida istituzionali Animal Welfare ed etici recensione corpo (AWERB).
1. preparazione Mouse
Nota: Eseguire esperimenti su topi adulti di almeno 8 settimane di età, fino a 6 mesi di età. Al fine di dimostrare la riproducibilità tecnica e tempistica coerenza per ogni passaggio di questa procedura tra animali diversi, utilizzare un minimo di 2 e massimo di 6 topi per ogni sessione sperimentale. Per valutare l'effetto di una mutazione su una sostanza che induce permeabilità in topi geneticamente modificati, idealmente, usare 2 topi mutanti e 2 littermate controlli per esperimenti.
<ol><li>24 h prima del hyperpermeability vascolare stimolante, anestetizzare topi usando un adatto inalazione anestetica come isoflurano. Utilizzare 3% isoflurane per induzione di anestesia, fino a che il riflesso di raddrizzamento e il mouse non risponde agli stimoli esterni. Utilizzare isoflurane 1.5% per la manutenzione di anestesia (assicurarsi che il mouse ha i ritmi respiratori costanti). Nell'ambito dell'anestesia, radere accuratamente entrambi i fianchi di ogni mouse con un rasoio elettrico, evitando lesioni alla pelle. Nota: L'anestesia è usata per evitare di causare stress per l'animale e ridurre al minimo il movimento durante la rasatura, che può provocare danni alla pelle.</li>
	<li>Tornare il mouse rasato alla sua gabbia a casa. Per topi maschi, luogo ogni maschio in una gabbia individuale dopo il recupero di anestesia per evitare combattimenti e, di conseguenza, danneggiare la pelle. Per topi femmina, restituirli in un gruppo di loro gabbia a casa. Nota: Se viene osservato un comportamento combattimento tra topi maschi nella gabbia, prima della procedura, separarli in gabbie individuali per 3 giorni prima dell'esperimento per consentire potenziali danni alla pelle di guarire.</li>
	<li>Monitorare i topi fino a recuperare la coscienza (di solito entro pochi secondi) e muoversi intorno alla gabbia (di solito entro 1 min).</li>
</ol>2. endovenosa di Evans Blue Dye
<ol><li>In un flusso laminare, preparare soluzioni sterili separate del maleate di pyrilamine inibitore dell'istamina (4 µ g / µ l di soluzione fisiologica allo 0,9%) e del colorante blu di Evans (1% p/v in soluzione fisiologica allo 0,9%). Sterilizzare le soluzioni di passaggio attraverso un filtro 22 µm.</li>
	<li>Utilizzare una siringa sterile da 1 mL con ago 30g per iniettare intraperitonealmente ogni mouse con 10 µ l pyrilamine maleato soluzione/grammo di peso corporeo (Figura 1A). Per eseguire la collottola prima, iniezione, il mouse e quindi inclinarlo in modo che la testa è diretto verso il suolo e l'addome è diretto verso l'alto. Iniettare nei quadranti inferiori dell'addome partire dal midline per evitare di colpire la vescica. Nota: Il peso dei topi tra 8 settimane e 6 mesi di età solitamente varia tra 15 e 30 g. Pyrilamine maleato inibisce il rilascio di istamina endogena, che altrimenti sarebbe promuovere perdita vascolare indipendentemente l'agente da testare.</li>
	<li>Posizionare il mouse in una camera di calore di 37 ° C per 10 min promuovere la vasodilatazione. In alternativa, utilizzare una lampada di calore adatto focalizzata sulla coda per promuovere la vasodilatazione se è consentito l'uso di una lampada di calore dagli orientamenti etici locali.</li>
	<li>Spostare un mouse contemporaneamente a un dispositivo di ritenuta del mouse e strofinare la coda con etanolo al 70% per pulire l'area di iniezione e promuovere ulteriormente la vasodilatazione.</li>
	<li>Utilizzare una siringa sterile da 1 mL con ago 30g per amministrare 100 µ l blu di Evans per via endovenosa attraverso la vena caudale (Figura 1B). Immediatamente applicare pressione al sito di iniezione tenendo la coda tra un dito e il pollice per prevenire le emorragie. Nota: Visualizzazione della vena della coda può essere migliorata da dirigere la luce alla zona di iniezione. Ulteriori dettagli sull'esecuzione di iniezioni endovenose nella vena della coda del mouse possono essere trovato in un protocollo pubblicato18.</li>
	<li>Consentire la tintura di circolare per 30 min.</li>
</ol>3. stimolare Hyperpermeability vascolare
<ol><li>Utilizzando soluzioni sterili in un flusso laminare, diluire l'agente d'induzione permeabilità di interesse ad una concentrazione che consente la dose finale deve essere consegnato in un volume di 20 µ l. Nota: L'esperimento di esempio illustrato nella Figura 1-Figura 2, che VEGFA è usato per stimolare hyperpermeability vascolare ad una concentrazione di 2,5 ng / µ l di PBS, producendo una dose totale di 50 ng e PBS viene utilizzato come un controllo del veicolo.</li>
	<li>Caricare l'agente d'induzione permeabilità di interesse e il controllo del veicolo in separato 2 sterile 300 µ l siringhe con ago 31G. Caricare la soluzione sufficiente per iniettare ogni mouse con 20 µ l della soluzione in triplice copia (cioè preparare 60 µ l di agente e veicolo per mouse, più volume aggiuntivo per tenere conto per volume morto dell'ago).</li>
	<li>Anestetizzare il primo mouse per essere testato con isoflurano (3% per induzione di anestesia fino a che il riflesso di raddrizzamento e il mouse non risponde agli stimoli esterni e 1,5% per la manutenzione di anestesia, assicurandosi che il mouse ha i ritmi respiratori costanti).</li>
	<li>Iniettare per via intradermica 20 µ l dell'agente promotore permeabilità nel fianco del mouse (Figura 1). Assicurarsi che l'ago sia ad un angolo di 15° per la pelle. Verifica per la formazione di una bolla rialzata all'interno della pelle che indica un'iniezione di successo. Ripetere l'iniezione intradermica a 2 siti aggiuntivi, un minimo di 1 cm.</li>
	<li>Ruotare il mouse per esporre il fianco 2 e ripetere triplicate iniezioni con la soluzione di controllo veicolo. Registrare sulla carta la posizione di ogni sito di iniezione per facilitarne l'identificazione per la successiva raccolta di campioni di pelle. Nota: Maneggiare la pelle del topo con cautela in questa fase; ad esempio, evitare di pizzicare la pelle durante l'esecuzione di iniezioni intradermiche.</li>
	<li>Tornare il mouse iniettato alla sua gabbia a casa e controllare il mouse fino a quando si recupera la coscienza (di solito entro pochi secondi) e si muove intorno alla gabbia.</li>
	<li>Mentre il primo mouse recupera, immediatamente ripetere i passaggi da 3.3 e 3.5 con il mouse secondo, e così via (fino a 6 topi al massimo per ogni sessione). Tenere traccia del tempo che ogni mouse è stato iniettato per regolare l'ora in cui procedere al passaggio successivo.</li>
</ol>4. quantificazione di blu di Evans accumulati all'interno del derma
<ol><li>Abbattere ogni mouse di dislocazione cervicale 20 min dopo che ha ricevuto le iniezioni intradermiche, osservando lo stesso ordine in cui i topi sono stati iniettati. Nota: La durata di perdita vascolare può variare a seconda dell'agente d'induzione permeabilità utilizzato, e, di conseguenza, il tempo tra l'iniezione intradermica e abbattimento potrebbe essere necessario ottimizzare.</li>
	<li>Luogo ogni abbattuti del mouse sulla sua schiena e perno i piedi su una tavola di sughero avvolto con un panno pulito (Figura 1).</li>
	<li>Utilizzando le forbici smussate, praticare un'incisione verticale di circa 3-4 cm dalla parte inferiore dell'addome fino al petto di topo morto. Con un bisturi e pinze, stuzzicare via la pelle da entrambi i fianchi per rivelare il lato interno del derma e siti di accumulo di blu di Evans (Figura 1E). Appuntare giù la pelle flaccida e rimuovere il grasso dalle regioni intorno al sito di perdite con un bisturi. Se necessario, prendere una foto rappresentativa per dimostrare la grandezza di perdita di blu di Evans nella pelle.</li>
	<li>Usando un bisturi e pinze, accise regioni della pelle che comprende il colorante blu di Evans trapelato per ogni sito iniettato con l'agente d'induzione permeabilità o veicolo. Nota: fare attenzione a dimensioni simili regioni della pelle per assicurarsi che, alle successive 4.7 di passaggio, una parte simile del volume formammide sarà essere adsorbita da ogni campione di pelle, consentendo la tintura estratta da diluire in un volume simile di formammide rimanente per asportare . La mappa di iniezione registrata nel passaggio 3.5 vi aiuterà a definire l'area da essere asportata.</li>
	<li>Ogni campione viene posto in una provetta da 1,5 mL ed etichettato di conseguenza, assicurandosi che ogni campione poggia sul fondo del tubo. Conservare i campioni a - 20 ° C fino all'utilizzo ulteriore. Se l'elaborazione immediatamente, seguire la procedura riportata di seguito.</li>
	<li>Asciugare i campioni di pelle durante la notte mettendo tubi aperti in forno o nel pozzo di un blocco di riscaldamento a 55 ° C.</li>
	<li>Per estrarre il colorante blu di Evans, aggiungere 250 µ l di formamide deionizzata ai campioni in una cappa, chiudere i tubi. Assicurarsi che i campioni di pelle sono tutti coperti da formammide e incubare per una notte in un forno o un blocco di riscaldamento a 55 ° C.</li>
	<li>Centrifugare i campioni in una centrifuga da banco a massima velocità (> 10.000 x g) per 40 min.</li>
	<li>In una cappa, trasferire 100 µ l del supernatante contenente colorante da ciascun campione in un pozzo separato di una piastra a 96 pozzetti trasparente, piatto fondo (Figura 2A).</li>
	<li>Picco di misura assorbanza di blu di Evans a 620 nm con una lettura di riferimento di 740 nm in uno spettrofotometro. Nota: 620 nm è l'assorbanza del picco di blu di Evans, mentre 740 nm non è assorbito dal blu di Evans e funge da una lunghezza d'onda di riferimento.</li>
	<li>Media le letture di assorbanza delle iniezioni triplice copia dello stesso agente o veicolo per ogni mouse per rappresentare la variabilità tecnica (Figura 2B).</li>
	<li>Calcolare la differenza di piega delle letture da agente d'induzione permeabilità rispetto al controllo del veicolo (Figura 2).</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nessun conflitto di interessi per dichiarare.

Dalla sua prima descrizione nel 195217, il dosaggio di Miles ha fornito i ricercatori con un metodo relativamente rapido, semplice e affidabile per lo studio dei meccanismi molecolari di hyperpermeability vascolare. Ad esempio, il dosaggio di Miles è stato utilizzato per testare la capacità e/o potenza di diversi agenti per indurre hyperpermeability19,20,21 o per testare l'efficacia di hyperpermeability blocco agenti8 ,22,23. Come altro esempio, gli agenti che inducono la permeabilità vascolare sono stati testati in topi geneticamente modificati ed i loro comandi littermate per determinare i requisiti di specifici recettori e proteine per hyperpermeability indotta da legante di trasduzione del segnale le risposte10,11,12,13,14,15,20,23. Diverse versioni modificate del dosaggio Miles da allora sono state usate, ad esempio per quanto riguarda il tracciante utilizzato. Così, blu di Evans è stato sostituito in alcuni studi con fluorescenza-labeled destrani di diverse dimensioni o microsfere11,13.
Il vantaggio principale del dosaggio Miles su altri saggi per studiare i meccanismi vascolari hyperpermeability è che è relativamente facile da eseguire e non richiede costose attrezzature. Inoltre, come tecnica di in vivo , questa perdita vascolare di modelli di analisi nel contesto dei vasi sanguigni intatti, al contrario di misurazione perdita attraverso in vitro dosaggi come trans bene le analisi di flusso o trans endoteliale resistenza elettrica ( Saggi TEER), che si concentrano, esclusivamente, sul monostrato endoteliale. I saggi alternativi in vivo di hyperpermeability vascolare possono differire del dosaggio di Miles qui descritto utilizzando un percorso di consegna diverso per l'agente d'induzione hyperpermeability o analizzando la perdita vascolare in siti diversi, per esempio di consegna sistemica di un agente tramite vena caudale seguita da esame di perdita vascolare nei polmoni o la trachea11,13,15. Una limitazione del dosaggio Miles è che l'iniezione intradermica di determinati agenti potrà, in linea di principio, anche influenzare la pressione sanguigna e il flusso oltre alla rottura della barriera endoteliale e, pertanto, anche indirettamente influisce sulla permeabilità vascolare. Tuttavia, questo test recentemente è stato indicato per misurare la permeabilità vascolare indotta da VEGF-A indipendentemente dagli effetti sulla pressione arteriosa sistemica15. Un'altra limitazione del dosaggio Miles è che letti vascolari in tessuti differenti possono rispondere diversamente a permeabilità-Promozione agenti e i risultati ottenuti con un dosaggio di Miles nella pelle possono, quindi, non essere rappresentante, ad esempio, di ciò che avviene nella polmone o il cervello.
Età e il peso dell'animale possono influenzare la perdita osservata nell'analisi della Miles. Per ridurre al minimo l'effetto di queste variabili, i ricercatori devono utilizzare littermates o similmente dimensioni e topi come controlli invecchiati. Quando si valutano i mutanti del topo per un particolare gene di interesse, topi devono essere generati attraverso un eterozigote contro littermates di strategia e wildtype eterozigoti allevamento utilizzati come controlli. Inoltre, si consiglia di utilizzare anestetici gas rapidamente reversibili, come isoflurano, per evitare di vasocostrizione, che è stato descritto per qualche farmaco anestetico somministrato tramite iniezioni parenterali24,25. L'iniezione di blu di Evans in vena caudale laterale del mouse è un passo fondamentale in questo protocollo e può notevolmente influenzare la qualità dei dati e esperimento. Così, i ricercatori devono essere competenti nell'esecuzione di iniezioni di vena di coda e sarà probabilmente bisogno di precedente esperienza o pratica prima di iniziare che le miglia saggio sperimentare. In alternativa, i ricercatori potrebbero utilizzare altre vie endovenosa per recapitare Evans blu, come l'iniezione di retro-orbitale se essi vengono vissuti con esso. Iniezione intradermica di permeabilità-promuovere soluzioni possono causare danni di agente indipendente per la pelle. Pertanto, iniezioni intradermiche non deve superare i 20 µ l di volume, dovrebbero sempre essere effettuate in presenza dell'inibitore dell'istamina e normalizzate a iniezioni di controllo del veicolo.
Il dosaggio di Miles è stato utilizzato da molti ricercatori per valutare componenti il VEGF-A della via di segnalazione, ad esempio, perché permeabilità vascolare indotta da VEGF-una causa di ascite nel cancro pazienti16 e visione-alterando l'edema in parecchi neovascolare occhio malattia7. Così, noi ed altri abbiamo usato l'analisi di Miles per confrontare il VEGF-A perdita vascolare indotta in topi geneticamente modificati per la mancanza di componenti specifici del VEGF-A segnalazione cascata12,13,14, 15 , 20 , 23. il nostro studio recente utilizzando questo approccio ha rivelato che l'isoforma patologica principale di VEGF-A, VEGF165, segnali attraverso un complesso di VEGFR2 e NRP1, in cui il dominio citoplasmatico di NRP1 promuove l'attivazione di chinasi-mediata di ABL di chinasi della famiglia SRC per evocare una risposta di hyperpermeability14. VEGFA, inoltre, promuove la crescita dei vasi sanguigni e potrebbe, pertanto, essere utilizzato terapeuticamente per ripristinare il flusso sanguigno ai tessuti ischemici se sue attività hyperpermeability potrebbe essere specificamente inibita. Ricerca delucidare il meccanismo molecolare che dirige il VEGF-A risposte delle cellule endoteliali vascolari verso hyperpermeability vascolare potrebbe, pertanto, individuare percorsi che possono essere manipolate in modo selettivo per inibire patologico VEGF-A ha indotto l'edema nelle malattie, come il cancro o malattia ischemica dell'occhio. Il dosaggio di Miles senza dubbio continuerà a essere un metodo utile per sostenere questi e molti altri tipi di studi funzionali per delucidare molecolari regolatori ed effettori della hyperpermeability vascolare.

La funzione primaria del sistema cardiovascolare è quello di consentire il trasferimento di gas, nutrienti e prodotti di scarto tra la circolazione e tessuti in tutti gli organi. Vasi sanguigni hanno organo-specifici livelli di permeabilità basale per consentire tali scambi1. Per esempio, i vasi sanguigni nel rene sono altamente permeabili, mentre la barriera ematoencefalica costituisce un'interfaccia altamente impenetrabile, stretto2,3,4. Le cellule endoteliali che formano il rivestimento interno dei vasi sanguigni forniscono una barriera fisica tra la circolazione e tessuti sottostanti e regolano la permeabilità vascolare in un modo di organo-specific. Tuttavia, determinati stimoli causano un crollo parziale della barriera endoteliale per aumentare lo stravaso di fluido dalla circolazione nell'interstizio sopra i livelli basali di1. Tale hyperpermeability è osservata, per esempio, ai luoghi del trauma dei tessuti, nell'infiammazione, nei tumori, durante la sepsi, in occhi con malattia neovascular o nel cervello e nel cuore, quando ischemia del tessuto si verifica a causa di un ictus o un infarto miocardico, rispettivamente 5 , 6 , 7 , 8. quando cronicamente elevati, hyperpermeability conduce all'edema, che a sua volta provoca danni ai tessuti, come la perdita della visione nell'occhio malattia9. Così, la modellazione della risposta vascolare hyperpermeability è auspicabile per la comprensione dei meccanismi che aumentano la permeabilità endoteliale e per testare l'efficacia degli agenti progettati per inibire questo.
Il dosaggio di Miles è una tecnica ben consolidata, comunemente usata e relativamente semplice che misura perdita vascolare in vivo come una misura di surrogato del hyperpermeability vascolare. Anche se essa non tener conto ad aggravare i fattori che possono aumentare la perdita vascolare indipendentemente dal regolamento barriera endoteliale, quali pressione sanguigna o flusso sanguigno, il dosaggio di Miles è generalmente pensato per fornire un metodo affidabile per valutare la permeabilità-modulazione attività di sostanze e identificare i mediatori di segnalazione che promuovono la loro attività. Di conseguenza, il dosaggio di Miles è stato parte integrante di numerosi studi che hanno identificato mediatori di hyperpermeability vascolare e dei loro meccanismi di azione10,11,12,13, 14,15, ad esempio il fattore di crescita endoteliale vascolare VEGF-A che è stato originariamente identificato come il fattore di permeabilità vascolare VPF16.
Originariamente sviluppato da miglia e miglia per studiare la permeabilità vascolare in cavie17, loro dosaggio è stato successivamente adattato all'utilizzo di topi, che sono ora l'organismo modello di scelta per delucidare i meccanismi molecolari della permeabilità vascolare regolamento a causa della loro idoneità squisita di manipolazione genetica. Brevemente, colorante blu di Evans è per via endovenosa iniettato in topi adulti e ammessi a circolare per 30 minuti (Figura 1). Agenti d'induzione permeabilità contro controllo veicolo quindi vengono iniettati per via intradermica in più siti su opposti fianchi del mouse per indurre la perdita vascolare (Figura 1). Di conseguenza, colorante blu di Evans albumina extravasates e si accumula nel derma (Figura 1). Dopo umanamente abbattimento il mouse, blu di Evans è estratta dal derma e il livello di perdita vascolare calcolato come il rapporto del test al veicolo-indotte da sostanze di densità ottica (Figura 2).

<table><tbody><tr><td>Pirilamina maleato sale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5514-5G</td><td>Resuspend in PBS</td></tr><tr><td>Deionized Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4117</td><td>Utilizzare in cappa aspirante</td></tr><tr><td>Aghi per microlance 30g x 0,5"</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>305106</tr><tr><td>Plastipak sterile 1ml Luer</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>309659</tr><tr><td>Siringhe MicroFine sterili 0,3 ml - 8 mm - 30G&nbsp;</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>324826</tr><tr><td>Evans blu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Mouse retrattino</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera di calore</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tagliacapelli</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Merial</td><td>ap/drugs/220/96</td><td></td></tr><tr><td>Scalpal&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forbice</td><td></td><td></td><td></td>smussata</tr><tr><td>Pinze Provette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Eppendorf</td></tr><tr><td>Heatblock</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pannello di</td><td></td><td></td><td></td>sughero</tr><tr>Centrifuga <td></td><td></td><td></td><td>refrigerata da banco</td></tr><tr><td>Fattore di crescita endoteliale vascolare ricombinante 165</td><td>Reliatech</td><td>M30-004</td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione vascolari agenti d'induzione hyperpermeability nella pelle con il dosaggio di miles

Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

La funzione primaria dell'endotelio vascolare negli organismi vertebrati è di servire come una barriera tra il sangue e ogni tessuto del corpo, per cui la permeabilità dell'endotelio a cellule del sangue, macromolecole del plasma e l'acqua può essere adattata secondo il bisogno fisiologico. In alcune malattie, citochine e fattori di crescita vengono rilasciati che mirano la barriera endoteliale per aumentare transitoriamente la permeabilità vascolare; Tuttavia, la loro presenza prolungata può causare hyperpermeability vascolare cronica e quindi danneggiano il tessuto dell'edema. Il dosaggio di Miles è una tecnica di in vivo che permette ai ricercatori di studiare hyperpermeability vascolare attraverso la misurazione di proxy di perdita vascolare. Qui, forniamo un protocollo dettagliato su come eseguire questa procedura nel topo, che è l'organismo di modello più ampiamente usato per studiare la patologia e fisiologia dei mammiferi. La procedura prevede l'iniezione endovenosa di blu di Evans per etichettare l'albumina circolante seguita da multiple iniezioni intradermiche di agenti d'induzione permeabilità e soluzioni di controllo del veicolo in opposti fianchi del mouse. Di conseguenza, colorante blu di Evans perde gradualmente nel derma, dove si accumula e può essere estratta per quantificazione come perdita indotta dall'agente d'induzione permeabilità rispetto al veicolo. Il dosaggio di Miles può essere eseguito in wild-type o geneticamente modificati modelli murini e può essere combinato con drug administration per lo studio dei meccanismi molecolari che regolano la permeabilità vascolare e identificano gli agenti/bersagli in grado di indurre o il blocco hyperpermeability.

Abbiamo usato l'analisi di Miles per valutare la capacità del VEGF-A di indurre perdita vascolare rispetto al controllo del veicolo (PBS) in topi C57/Bl6 wildtype. Qui, indichiamo un rappresentanza esperimento utilizzando topi selvatici stimolati con l'iniezione intradermica di 20 µ l di soluzione contenente 50 ng di VEGF-A in PBS o veicolo PBS solo. Un chiaro aumento nella perdita di colorante blu di Evans in campioni di pelle iniettato con VEGF-A rispetto a PBS era apparente in situ (Figura 1E) e dopo l'estrazione del colorante in formammide (Figura 2A). Quantificazione degli esperimenti multipli illustra che 50 ng di VEGF-A induce significativamente più Evans blu perdita di PBS da solo (Figura 2B), con una media 3 volte aumentare in perdita vascolare rispetto al veicolo (Figura 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig1.jpg"> Figura 1: induzione di perdita vascolare nell'analisi della Miles. Rappresentazione schematica (pannello superiore) e immagini corrispondenti (pannello inferiore) dei passaggi sequenziali durante l'esecuzione del test di Miles nel topo. (A) Pyrilamine maleato è iniettato intraperitonealmente per impedire il rilascio di istamina endogena 10-30 minuti prima dell'iniezione endovenosa (B) di 100 µ l 1% Evans blue nella coda della vena del mouse. (C), 30 min più tardi, vascolare perdita è indotta tramite l'iniezione intradermica dell'agente (50 ng di VEGF-A; verde cerchi) contro controllo veicolo (PBS; cerchi bianchi). (D, E) Per accedere ai siti di accumulo di blu di Evans, il mouse è abbattuti 20 minuti dopo le iniezioni intradermiche e la pelle di entrambi i fianchi dissecato e appuntato giù. i.p.: intraperitoneale; i.v.: endovenosa; i.d.: intradermica; scala bar, 1 cm. <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig1large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig2.jpg"> Figura 2: quantificazione di perdita vascolare nell'analisi della Miles. Evans (A) colorante blu viene estratta in formammide da campioni di pelle ottenuti da ogni iniezione intradermica nella Figura 1 e caricato in una piastra a 96 pozzetti per lettura con uno spettrofotometro dell'assorbanza. (B, C) Rappresentazione grafica delle letture di assorbanza da esperimenti multipli tracciando entrambi valori (B) l'assorbanza normalizzato (densità ottica, OD) di entrambi l'agente d'induzione permeabilità (VEGF-A; scuro verde cerchi) e veicolo (PBS; grigio Cerchi), o (C) modifica la piega in OD per l'agente rispetto al veicolo (barre di errore: SEM). Le letture di assorbanza della triplice copia PBS e campioni di VEGF-A mostrato in (A) sono una media e mostrate in (B, C) come cerchi bianchi o verde, rispettivamente. <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Qui, presentiamo un protocollo per misurare la perdita vascolare indotta dalla somministrazione intradermica di agenti di promozione di permeabilità nella pelle murina. Questa tecnica può essere utilizzata per determinare la capacità delle molecole di promuovere o inibire la perdita vascolare o per studiare i meccanismi molecolari che regolano la permeabilità vascolare.

Valutazione vascolari agenti d'induzione Hyperpermeability nella pelle con il dosaggio di Miles

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la perdita vascolare nel derma del topo che è indotta dall'iniezione intradermica di agenti che promuovono la permeabilità. Questa procedura può aiutare a rispondere a domande chiave sulla regolazione della permeabilità vascolare in vivo, ad esempio quali molecole possono stimolare o inibire la perdita vascolare e quali sono le vie di segnalazione coinvolte. Il vantaggio principale di questa procedura è che è veloce e relativamente semplice e utilizza principalmente reagenti e materiali di laboratorio comuni.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle malattie con edema patologico. In particolare, i ricercatori possono utilizzare questo test per identificare nuovi bersagli molecolari e per testare farmaci rilevanti per la loro capacità di inibire la permeabilità vascolare in modo relativamente rapido e semplice. Preparare soluzioni separate dell'inibitore dell'istamina pirilammina maleato e del colorante blu di Evans, entrambi in soluzione salina allo 0,9%.Lavorando poi in una cappa a flusso laminare, sterilizzare le soluzioni passando attraverso un filtro da 0,22 micrometri. Caricare le due soluzioni in siringhe separate da un millilitro dotate di aghi da 30 gauge. Quindi, posiziona il mouse.Quindi inclinare il mouse in modo tale che la testa sia diretta verso il suolo e l'addome verso l'alto. Dopo che il topo è stato posizionato, somministrare 10 microlitri per grammo di peso corporeo di soluzione di pirilamina maleato mediante iniezione intraperitoneale. Successivamente, per favorire la vasodilatazione, posizionare il topo in una camera termica a 37 gradi Celsius per 10 minuti.Quindi sposta il mouse su un fermatore per mouse. Quindi, strofinare la coda con etanolo al 70% per un'ulteriore vasodilatazione. Somministrare 100 microlitri di soluzione di colorante blu Evans per via endovenosa attraverso la vena caudale.Per prevenire il sanguinamento, tenere rapidamente la coda tra un dito e il pollice e applicare pressione nel sito dell'iniezione. L'iniezione endovenosa di colorante blu Evans nella vena caudale del topo è un passaggio difficile e critico all'interno di questa procedura. Di conseguenza, è essenziale che i ricercatori siano competenti nell'esecuzione di questa iniezione prima di procedere con il resto della procedura.L'accertamento delle competenze richiederà una pratica preliminare. Utilizzare soluzioni sterili di soluzione salina tamponata con fosfato per diluire il reagente VEGF in modo tale che il volume finale della dose sia di 20 microlitri. Quindi caricare il reagente che induce la permeabilità al VEGF e il controllo del veicolo in due siringhe separate da 300 microlitri dotate di aghi da 31 gauge.Mantenere l'ago a un angolo di 15 gradi con la pelle e iniettare 20 microlitri di VEGF per via intradermica nel fianco del topo. Individuare una bolla in rilievo all'interno della pelle per convalidare l'avvenuta iniezione. Eseguire iniezioni intradermiche in due siti aggiuntivi distanti almeno un centimetro l'uno dall'altro.Quindi ruotare il mouse per esporre il secondo fianco e ripetere le iniezioni in triplicato con la soluzione del veicolo. Conservare un registro cartaceo per ciascuno dei siti di iniezione e l'ora in cui la procedura di iniezione è terminata. Quindi trasferisci il mouse nella gabbia di casa.Continua a monitorare il topo finché non riprende conoscenza e inizia a muoversi nella gabbia. Lasciare agire la soluzione VEGF per 20 minuti prima di chiamare il mouse. A questo punto, iniettare in sequenza VEGFA e veicolo in tutti i topi seguendo la stessa procedura.Dopo 20 minuti, posiziona ogni topo soppresso sulla schiena e appunta le zampe su una bacheca di sughero avvolta in un fazzoletto pulito. Successivamente, con l'aiuto di forbici smussate, praticare un'incisione verticale lunga tre o quattro centimetri dal basso addome al petto del topo morto. Quindi usa una pinza e un bisturi per stuzzicare la pelle da entrambi i lati del fianco.Utilizzare il bisturi per rimuovere il grasso se presente nelle regioni intorno al sito di perdita. Quindi utilizzare la pinza e il bisturi per asportare le regioni della pelle con il colorante blu Evans fuoriuscito. Le regioni cutanee asportate devono essere di dimensioni simili.Trasferire i campioni di pelle in provette da 1,5 millilitri ed etichettare di conseguenza. Asciugare il campione posizionando la provetta aperta in un blocco termico per una notte. Al termine dell'essiccazione, aggiungere 250 microlitri di formamide deionizzata al campione in una cappa aspirante.Chiudere il coperchio del tubo e metterlo in un blocco termico durante la notte per estrarre il colorante Evans. Centrifugare i campioni a una dose di 10.000 g o superiore per 40 minuti in una centrifuga da banco. Dopo la centrifugazione, trasferire 100 microlitri di ciascun surnatante contenente colorante dal campione centrifugato nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti funzionante in una cappa aspirante.Leggere l'assorbanza del blu di Evans utilizzando uno spettrofotometro. Per studiare la perdita vascolare indotta dal VEGF, al topo vengono iniettati 50 nanogrammi di VEGFA in soluzione salina tamponata con fosfato o solo soluzione salina tamponata con fosfato come veicolo. L'immagine mostra un aumento dell'accumulo di colorante blu Evans fuoriuscito nei campioni di pelle iniettati con VEGFA rispetto al controllo del veicolo in situ.Questa immagine della piastra a 96 pozzetti mostra il colorante blu Evans caricato estratto in formamide dal campione di pelle. Questo grafico mostra i valori di assorbanza normalizzati di campioni VEGFA accoppiati e di controllo solo veicolo. Il grafico mostra che l'iniezione di 50 nanogrammi di VEGFA aumenta significativamente la perdita di colorante Evans rispetto al solo veicolo.Questo grafico è ottenuto dopo aver quantificato le variazioni di piegatura della densità ottica per il VEGFA rispetto ai campioni di veicoli. Il grafico mostra un aumento medio di tre volte della perdita vascolare dopo la somministrazione di VEGFA rispetto al solo veicolo. Una volta padroneggiata, la parte principale di questa tecnica può essere eseguita in due ore se eseguita correttamente.Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante normalizzare la perdita vascolare indotta dall'agente in perdita vascolare indotta dal veicolo in modo da tenere conto della perdita vascolare aspecifica e della variazione tra i topi. Questa procedura può essere combinata con altri metodi, come la somministrazione di farmaci, al fine di rispondere a domande come se una proteina possa essere mirata a inibire la permeabilità vascolare. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia vascolare per esplorare i meccanismi molecolari dell'iperpermeabilità vascolare nei topi geneticamente modificati, identificando i componenti chiave di segnalazione necessari per la perdita vascolare.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indurre e misurare la perdita vascolare nel derma del topo.

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