Valutazione vascolari agenti d'induzione Hyperpermeability nella pelle con il dosaggio di Miles
19 giugno 2018
Qui, presentiamo un protocollo per misurare la perdita vascolare indotta dalla somministrazione intradermica di agenti di promozione di permeabilità nella pelle murina. Questa tecnica può essere utilizzata per determinare la capacità delle molecole di promuovere o inibire la perdita vascolare o per studiare i meccanismi molecolari che regolano la permeabilità vascolare.
L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la perdita vascolare nel derma del topo che è indotta dall'iniezione intradermica di agenti che promuovono la permeabilità. Questa procedura può aiutare a rispondere a domande chiave sulla regolazione della permeabilità vascolare in vivo, ad esempio quali molecole possono stimolare o inibire la perdita vascolare e quali sono le vie di segnalazione coinvolte. Il vantaggio principale di questa procedura è che è veloce e relativamente semplice e utilizza principalmente reagenti e materiali di laboratorio comuni.
Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle malattie con edema patologico. In particolare, i ricercatori possono utilizzare questo test per identificare nuovi bersagli molecolari e per testare farmaci rilevanti per la loro capacità di inibire la permeabilità vascolare in modo relativamente rapido e semplice. Preparare soluzioni separate dell'inibitore dell'istamina pirilammina maleato e del colorante blu di Evans, entrambi in soluzione salina allo 0,9%.
Lavorando poi in una cappa a flusso laminare, sterilizzare le soluzioni passando attraverso un filtro da 0,22 micrometri. Caricare le due soluzioni in siringhe separate da un millilitro dotate di aghi da 30 gauge. Quindi, posiziona il mouse.
Quindi inclinare il mouse in modo tale che la testa sia diretta verso il suolo e l'addome verso l'alto. Dopo che il topo è stato posizionato, somministrare 10 microlitri per grammo di peso corporeo di soluzione di pirilamina maleato mediante iniezione intraperitoneale. Successivamente, per favorire la vasodilatazione, posizionare il topo in una camera termica a 37 gradi Celsius per 10 minuti.
Quindi sposta il mouse su un fermatore per mouse. Quindi, strofinare la coda con etanolo al 70% per un'ulteriore vasodilatazione. Somministrare 100 microlitri di soluzione di colorante blu Evans per via endovenosa attraverso la vena caudale.
Per prevenire il sanguinamento, tenere rapidamente la coda tra un dito e il pollice e applicare pressione nel sito dell'iniezione. L'iniezione endovenosa di colorante blu Evans nella vena caudale del topo è un passaggio difficile e critico all'interno di questa procedura. Di conseguenza, è essenziale che i ricercatori siano competenti nell'esecuzione di questa iniezione prima di procedere con il resto della procedura.
L'accertamento delle competenze richiederà una pratica preliminare. Utilizzare soluzioni sterili di soluzione salina tamponata con fosfato per diluire il reagente VEGF in modo tale che il volume finale della dose sia di 20 microlitri. Quindi caricare il reagente che induce la permeabilità al VEGF e il controllo del veicolo in due siringhe separate da 300 microlitri dotate di aghi da 31 gauge.
Mantenere l'ago a un angolo di 15 gradi con la pelle e iniettare 20 microlitri di VEGF per via intradermica nel fianco del topo. Individuare una bolla in rilievo all'interno della pelle per convalidare l'avvenuta iniezione. Eseguire iniezioni intradermiche in due siti aggiuntivi distanti almeno un centimetro l'uno dall'altro.
Quindi ruotare il mouse per esporre il secondo fianco e ripetere le iniezioni in triplicato con la soluzione del veicolo. Conservare un registro cartaceo per ciascuno dei siti di iniezione e l'ora in cui la procedura di iniezione è terminata. Quindi trasferisci il mouse nella gabbia di casa.
Continua a monitorare il topo finché non riprende conoscenza e inizia a muoversi nella gabbia. Lasciare agire la soluzione VEGF per 20 minuti prima di chiamare il mouse. A questo punto, iniettare in sequenza VEGFA e veicolo in tutti i topi seguendo la stessa procedura.
Dopo 20 minuti, posiziona ogni topo soppresso sulla schiena e appunta le zampe su una bacheca di sughero avvolta in un fazzoletto pulito. Successivamente, con l'aiuto di forbici smussate, praticare un'incisione verticale lunga tre o quattro centimetri dal basso addome al petto del topo morto. Quindi usa una pinza e un bisturi per stuzzicare la pelle da entrambi i lati del fianco.
Utilizzare il bisturi per rimuovere il grasso se presente nelle regioni intorno al sito di perdita. Quindi utilizzare la pinza e il bisturi per asportare le regioni della pelle con il colorante blu Evans fuoriuscito. Le regioni cutanee asportate devono essere di dimensioni simili.
Trasferire i campioni di pelle in provette da 1,5 millilitri ed etichettare di conseguenza. Asciugare il campione posizionando la provetta aperta in un blocco termico per una notte. Al termine dell'essiccazione, aggiungere 250 microlitri di formamide deionizzata al campione in una cappa aspirante.
Chiudere il coperchio del tubo e metterlo in un blocco termico durante la notte per estrarre il colorante Evans. Centrifugare i campioni a una dose di 10.000 g o superiore per 40 minuti in una centrifuga da banco. Dopo la centrifugazione, trasferire 100 microlitri di ciascun surnatante contenente colorante dal campione centrifugato nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti funzionante in una cappa aspirante.
Leggere l'assorbanza del blu di Evans utilizzando uno spettrofotometro. Per studiare la perdita vascolare indotta dal VEGF, al topo vengono iniettati 50 nanogrammi di VEGFA in soluzione salina tamponata con fosfato o solo soluzione salina tamponata con fosfato come veicolo. L'immagine mostra un aumento dell'accumulo di colorante blu Evans fuoriuscito nei campioni di pelle iniettati con VEGFA rispetto al controllo del veicolo in situ.
Questa immagine della piastra a 96 pozzetti mostra il colorante blu Evans caricato estratto in formamide dal campione di pelle. Questo grafico mostra i valori di assorbanza normalizzati di campioni VEGFA accoppiati e di controllo solo veicolo. Il grafico mostra che l'iniezione di 50 nanogrammi di VEGFA aumenta significativamente la perdita di colorante Evans rispetto al solo veicolo.
Questo grafico è ottenuto dopo aver quantificato le variazioni di piegatura della densità ottica per il VEGFA rispetto ai campioni di veicoli. Il grafico mostra un aumento medio di tre volte della perdita vascolare dopo la somministrazione di VEGFA rispetto al solo veicolo. Una volta padroneggiata, la parte principale di questa tecnica può essere eseguita in due ore se eseguita correttamente.
Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante normalizzare la perdita vascolare indotta dall'agente in perdita vascolare indotta dal veicolo in modo da tenere conto della perdita vascolare aspecifica e della variazione tra i topi. Questa procedura può essere combinata con altri metodi, come la somministrazione di farmaci, al fine di rispondere a domande come se una proteina possa essere mirata a inibire la permeabilità vascolare. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia vascolare per esplorare i meccanismi molecolari dell'iperpermeabilità vascolare nei topi geneticamente modificati, identificando i componenti chiave di segnalazione necessari per la perdita vascolare.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indurre e misurare la perdita vascolare nel derma del topo.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per misurare la permeabilità vascolare nella pelle murina indotta da agenti che promuovono la permeabilità. La tecnica aiuta a comprendere la regolazione della permeabilità vascolare e gli effetti di varie molecole.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Biologia vascolare
- Farmacologia
- Medicina sperimentale
Sfondo
- La permeabilità vascolare è cruciale in vari processi fisiologici e patologici.
- Comprendere i meccanismi della permeabilità vascolare può informare le strategie terapeutiche per le malattie con edema.
- Reagenti di laboratorio comuni vengono utilizzati in questa procedura.
- L'esecuzione rapida e semplice lo rende accessibile per i ricercatori.
Obiettivo dello studio
- Misurare gli effetti degli agenti che promuovono la permeabilità sulla perdita vascolare.
- Identificare bersagli molecolari per inibire la permeabilità vascolare.
- Esplorare le vie di segnalazione coinvolte nella regolazione vascolare.
Metodi utilizzati
- Iniezioni intradermiche e intravenose di agenti nei topi.
- Utilizzo del Colorante Blu Evans per quantificare la perdita vascolare.
- Monitoraggio e registrazione dei siti di iniezione e dei risultati.
- Centrifugazione e analisi spettrofotometrica dei campioni.
Principali risultati
- Il VEGF aumenta significativamente la perdita vascolare rispetto al controllo veicolo.
- L'analisi quantitativa mostra un aumento triplo della perdita con VEGFA.
- La procedura può essere completata in circa due ore.
- La normalizzazione dei dati di perdita è essenziale per risultati accurati.
Conclusioni
- Questa tecnica fornisce informazioni sulla biologia vascolare e sulla regolazione della permeabilità.
- Può essere combinata con altri metodi per migliorare la ricerca sulla permeabilità vascolare.
- Studi futuri possono sfruttare questo protocollo per testare nuovi agenti terapeutici.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
The Miles assay enables biopharma teams to quantify vascular hyperpermeability in vivo, supporting target validation for edema-related pathologies. By measuring dye leakage as a functional readout, the method provides mechanistic insight into permeability-regulating pathways. This accelerates de-risking of vascular targets and supports go/no-go decisions in preclinical programs focused on vascular stability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by identifying molecules that stimulate or inhibit vascular leakage in a disease-relevant system.
- Operational Value: Uses common laboratory reagents and standardized procedures to enable reproducible target engagement assessment.
- Predictive Value: Quantifies fold-change in leakage (e.g., three-fold increase with VEGFA) to support mechanistic de-risking and pathway clarification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing baseline vascular permeability responses.
- Operational Value: Enables assay standardization through normalization to vehicle control, reducing inter-animal variability.
- Scalability: Supports platform reuse across multiple agents and genetic models for comparative permeability profiling.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by modeling vascular hyperpermeability in murine dermis, a key site of edema formation.
- Operational Value: Facilitates translational continuity from discovery through preclinical validation via quantitative leakage readouts.
- Risk Mitigation: Informs risk-adjusted advancement decisions by identifying agents capable of inducing or blocking hyperpermeability.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target identification to preclinical evaluation, providing functional vascular permeability data that informs lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of permeability-promoting or -inhibiting agents through direct measurement of dye extravasation.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs via spectrophotometric analysis of extracted Evans Blue dye, enabling compound comparison.
- Analytics: Generates normalized leakage metrics (e.g., fold-change over vehicle) that help teams compare conditions and assess target modulation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling a pathophysiological process relevant to edema-inducing diseases.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across projects studying vascular regulators, reducing redundant model development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by linking molecular agents to functional vascular outcomes.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through controlled injection protocols and data normalization.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in vascular permeability pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of vascular targets based on functional leakage data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine handling, intravenous and intradermal injection techniques.
- Dependent on access to spectrophotometry, centrifuges, and sterile filtration equipment.
- Necessitates cross-team standardization of injection sites, timing, and dye extraction protocols.
- Adaptation considerations include genetic model variability and agent solubility in delivery vehicles.
- Practical limitations include technical difficulty of tail vein injection and dye extraction variability, as noted in source material.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:01
Intravenous Injection of Evans Blue Dye
2:48
Stimulation of Vascular Hyperpermeability
4:27
Quantification of the Accumulated Evans Blue within the Dermis
6:22
Results: Use of the Miles Assay to Detect Vascular Leakage Triggered by Intradermal Injection of VEGF into C57/BI6 Mice
7:39
Conclusion
