Name: Un piccolo modello animale di aspersione epatica normotermica Ex Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Scopri la perfusione epatica normotermica ex vivo nel ratto per valutare e riparare la funzione epatica. Questo modello semplice e replicabile utilizza la pegilata-catalasi per mitigare i danni da conservazione.

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Questo lavoro è stato supportato dal NIH T32AI 106704-01A1 e dal fondo di Flesch T. per trapianto dell'organo, aspersione, ingegneria e rigenerazione presso la Ohio State University.

Tutte le procedure sono state effettuate secondo le linee guida di istituzionale Animal Care e Consiglio nazionale delle ricerche di guida per la cura umana e l'uso di animali di laboratorio (IACUC) e ha subito l'approvazione del Comitato di Ohio State University IACUC.
1. il primo set-up
<ol><li>
Preparare la soluzione di perfusione combinando le seguenti: 86 mL di 25% di albumina, 184 mL di media Williams', 30 mL di penicillina/streptomicina (10 U/mL penicillina e 0,01 mg/mL di streptomicina), insulina (50 U/L), eparina (0.01 U/mL), L-Glutammina (0,292 g/L), e idrocortisone (0,010 g/L) per un volume totale di 300 mL. Per il perfusato base e gruppo PEG-CAT, aggiungere 625 U/mL di PEG-CAT.
	<ol>
<li>Il tampone di perfusato utilizzando tris (idrossimetil) amminometano (THAM) a pH 7,4. Utilizzare una macchina di gas del sangue arterioso per confermare il pH di perfusato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Impostare il circuito (Figura 1).
	<ol>
<li>Accendere il bagno d'acqua più calda e impostarlo a 37 ° C. Consentire la camera di organo per riscaldarsi.</li>
		<li>Versare il perfusato misto e tamponato nel serbatoio e avviare la circolazione. Nota: Il perfusato menzionato in questo passaggio è stato preparato al punto 1.1.1.</li>
		<li>Accendere il gas ossigenante (95% di ossigeno e 5% anidride carbonica) per il contatore di flusso attraverso l'ossigenatore in linea.</li>
		<li>Attivare il software di raccolta dati e fare clic su "start" per registrare per tutta la durata dell'esperimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Impostare il microscopio operatorio e la sala operatoria (Figura 2).
	<ol>
<li>Accendere tutte le apparecchiature compreso la scheda scaldavivande, elettrocauterizzazione e l'anestesia e segni vitali (cuore tasso e saturazione dell'ossigeno) apparecchiature di monitoraggio. Nota: Le impostazioni di microscopio variano a seconda il microscopio utilizzato e possono essere regolate per la comodità dell'utente.</li>
		<li>Riempire la siringa di anestesia da 10 mL con 10 mL di liquido isoflurano per inalazione (peso molecolare 184,5 g/mol) e inserire nell'unità di anestesia.</li>
		<li>Posizionare una siringa da 0,5 mL di eparina (50 U), strumenti chirurgici, 4-0 e 7-0 di seta sutura, tamponi di cotone sterile e spugne garza 4 x 4 cm non tessuta in modo appropriato (Figura 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare la camera di isoflurane.</li>
</ol>2. induzione dell'anestesia
<ol><li>Indossare i seguenti dispositivi di protezione individuale (PPE): maschera chirurgica, guanti chirurgici, abito USA e getta.</li>
	<li>Pesare il ratto. Nota: Usiamo ratti Sprague-Dawley tra 250 – 350 g.</li>
	<li>Accendere il compressore ossigeno e isoflurano. Mettere il topo, dopo deve essere pesato, nella camera di isoflurano e fissare il coperchio. Inducono anestesia utilizzando 6% isoflurane consegnata con 2 L/min di ossigeno. Nota: La dose esatta isoflurano utilizzata dipenderà il sistema di anestesia specifico utilizzato.</li>
	<li>Utilizzare clippers elettronico per clip capelli addominale dell'animale.
</li>
	<li>Sostituire l'animale nella camera di isoflurane.</li>
	<li>Accendere l'unità di anestesia in sala operatoria.</li>
	<li>Rimuovere il ratto dalla camera di isoflurane quando l'anestesia è completamente indotta. Confermare la profondità dell'anestesia utilizzando un pizzico di punta.</li>
</ol>3. gara d'appalto
<ol><li>
Preparare il bracciale portale 16 G (Figura 3).
	<ol>
<li>Iniziare con un angiocatheter 16 G. Tagliare una sezione di 7 mm di tubo. Determinare il punto medio della sezione 7 mm dalla misura 3,5 mm. Incise a metà e togliere la metà anteriore del tubo.</li>
		<li>Utilizzare una pinza emostatica per schiacciare questa parte ora piatta. Utilizzare un accendino per sciogliere l'altra estremità del angiocatheter per creare un labbro. Non collocare la punta direttamente in fiamma o bruceranno.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparare la cannula del dotto biliare.
	<ol>
<li>Prendete un angiocath di 27 G e tagliare fuori la porta di iniezione lasciando solo il catetere. Collegare questo ad una sezione di 10 cm del tubo cannular 27 G.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posizione il topo con il naso nel cono di naso di anestesia e le quattro estremità, immobilizzate. Monitorare i segni vitali collegando il monitor alla estremità posteriori di sinistra. Eseguire un pizzico di punta per confermare appropriata profondità dell'anestesia. Continuare l'anestesia al 4% isoflurane (per gli animali che pesano > 250 g).</li>
	<li>Spruzzare dell'addome dell'animale con alcool isopropilico al 70%. Lasciare per asciugare. Posizionare un telino sterile sopra l'animale.</li>
	<li>Fare un'incisione del midline al xifoideo al pube utilizzando sharp forbici e si estende attraverso la pelle (Figura 4). Delicatamente immettere il peritoneo e incidere il muscolo. Fare attenzione a non danneggiare la vescica in funzione inferiore di questa incisione e fegato in funzione superiore di questa incisione.</li>
	<li>Estendere l'incisione lateralmente a sinistra e a destra a forma di croce a livello del bordo inferiore del fegato.</li>
	<li>Girare l'anestesia fino al 2% (per animali di peso > 250 g).</li>
	<li>Ritrarre il processo xifoideo mediante una fascetta di zanzara curvo e le costole utilizzando le coste divaricatori (Figura 5).</li>
	<li>Tagliare il falciformi, frenico e legamenti gastroepatico con forbici affilate.</li>
	<li>Individuare e cravatta-off la vena frenica con una sutura di 7-0 come vicino alla sua origine possibile prevenire le infiltrazioni.</li>
	<li>Eviscerate il ratto usando un applicatore sterile di cotone inumidito e avvolgere l'intestino in garza inumidita con soluzione salina 0.9%. Fare attenzione a non per allungare il sistema vascolare del piccolo intestino.</li>
	<li>Sezionare sopra la vena cava inferiore (IVC) per rimuovere il tessuto in eccesso. Sezionare dietro il IVC appena superiore alla biforcazione e passare un ciclo di una sutura seta 4-0 per un uso successivo (Figura 6).</li>
	<li>Ritrarre il rene di destra per fornire l'esposizione alla vena surrenalica destra. Ritrarre il lobo di destra del fegato superiormente con una garza. Legare la vena adrenale di destra con una sutura in seta 7-0 più vicino il IVC come possibile e cauterizzare attraverso esso distale alla cravatta (Figura 7).</li>
	<li>Accuratamente sezionare la vena splenica, legarlo fuori con due punti di sutura seta 7-0 e tagliare attraverso di esso tra i due punti di sutura.</li>
	<li>Legare e legare ulteriori vene con sutura seta 7-0 per la lunghezza supplementare sulla vena portale, se necessario. Nota: Ci sono a volte piccoli rami di infrahepatic IVC tra il fegato inferiore e la vena surrenalica destra.</li>
	<li>Sezionare intorno all'arteria gastroduodenale, legare l'arteria gastroduodenale con una sutura in seta 7-0 e legare l'arteria gastroduodenale.</li>
	<li>Sezionare intorno all'arteria epatica e quindi posizionare una 7-0 sutura seta cravatta intorno ad esso (Figura 8).</li>
	<li>
Sezionare il dotto biliare.
	<ol>
<li>Controllare la lunghezza del dotto biliare. Legare il dotto biliare all'estremità distale utilizzando una sutura in seta 7-0. Inserire un ciclo di una sutura seta 7-0 intorno il dotto biliare prossimalmente possibile.</li>
		<li>Tagliare un buco che è la metà del diametro del condotto con piccole forbici e posizionare un catetere di 27 G nel dotto biliare prossimale. Legare il catetere in posizione mediante una sutura di cravatta sandalo romano (Figura 9).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Iniettare 0,5 mL di eparina (50 U) la vena del pene o IVC dell'animale usando un ago 27G. Nota: Una siringa da insulina 27 G può anche essere utilizzata invece.</li>
	<li>Morsetto e fissare il IVC utilizzando precedentemente posizionata la sutura seta 4-0.</li>
	<li>Fissare l'arteria epatica utilizzando precedentemente posizionata la sutura seta 7-0.</li>
	<li>Morsetto fuori vena portale utilizzando una clip microsurgical. Incannulare la vena portale utilizzando un angiocatheter 22 G. A livello della vena portale con 60 mL di freddo fisiologica 0,9% con eparina 1 mL (100 U) fino al fegato blanches (Figura 10). Nota: Se il fegato non scottate immediatamente può essere massaggiata con applicatori con punta di cotone sterile.</li>
	<li>Esporre il suprahepatic IVC e tagliare attraverso di esso come alta al petto come possibile.</li>
	<li>Eseguire un'epatectomia come segue. Tagliare intorno al diaframma, tagliare l'arteria epatica, tagliare il IVC, tagliare la vena portale, tagliare qualsiasi ulteriori legamenti ed estrarre il fegato. Posizionare il fegato in ghiaccio freddo normale soluzione salina 0,9% (Figura 11).</li>
	<li>Posto un polsino vascolare 16g nella vena portale (Figura 12). Posizionare il fegato sul circuito di perfusione epatica normotermica ex vivo .</li>
</ol>4. Ex Vivo normotermica aspersione del fegato
Nota: Il perfusato usato qui era preparato al protocollo punto 1.1.1.
<ol><li>Inserire la cannula della vena portale nella vena portale con risvolto (Figura 13).</li>
	<li>Durante il posizionamento di cannula della vena portale, mantenere il flusso del perfusato attraverso il circuito a 2 mL/min per iniziare. Guardare il monitor per eventuali picchi di pressione della vena portale; Ciò potrebbe indicare la nave ha sono occluse e riposizionamento della cannula è necessaria.</li>
	<li>Sutura nella cannula IVC per il flusso di ritorno del perfusato utilizzando una sutura in seta 7-0.</li>
	<li>Una volta che entrambi cannule sono a posto, iniziare a girare il flusso a 1 mL/min fino a raggiunta una pressione fisiologica nella gamma di 10 – 16 cmH2O.</li>
	<li>
Prendere un campione di 1 mL da pre- e post-porte a 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 e 240 min di aspersione. Dividere il campione 1 mL in due campioni di 0,5 mL. Nota: 0,5 mL di questo verrà utilizzato nel passaggio di protocollo 4.5.1 e 0,5 mL verrà essere utilizzato nel passaggio di protocollo 4.5.2.<ol>
<li>Snap congelare 0,5 mL di questo campione in provette criogeniche in azoto liquido.</li>
		<li>Eseguire un'analisi di gas del sangue arterioso utilizzando il restante 0,5 mL di perfusato.</li>
		<li>Dopo aver eseguito l'analisi di gas del sangue in ogni momento (0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 e 240 min) esaminare i livelli di pH e buffer il perfusato come bisogno di tornare a pH 7,4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>A conclusione di 4 h di aspersione, scollegare il fegato dal circuito di perfusione. Dividere il fegato in segmenti di 0,5 g. Snap congelare il tessuto epatico in tubi criogenici in azoto liquido.</li>
</ol>5. post-esperimento analisi
<ol><li>
Determinare alanina aminotransferasi (ALT) livello nel perfusato a 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 e 240 min utilizzando un kit commerciale saggio colorimetrico.
	<ol>
<li>In breve, incubare il perfusato con i reagenti di mix di reazione a 37 ° C per 60 min. misurare la densità ottica i valori a 570 nm utilizzando un lettore di micropiastre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
0,5 g di tessuto epatico con 100 µ l di tampone di lisi di omogeneizzare e analizzare il tessuto lisato per l'adenosina trifosfato (ATP), glutatione (GSH) e malondialdeide (MDA).
	<ol>
<li>In breve, misura i livelli di ATP dei campioni di tessuto del fegato utilizzando un kit di analisi commerciale. Mescolare il campione con il tampone di reazione e incubare a temperatura ambiente per 30 min. misura la densità ottica a 570 nm utilizzando un lettore di micropiastre.</li>
		<li>Misurare i livelli GSH dei campioni di tessuto del fegato utilizzando un kit di analisi commerciale. Mescolare i campioni di tessuto con il cocktail di dosaggio. Misurare i valori di densità ottica a 405-414 nm.</li>
		<li>Misurare i livelli di MDA dei campioni di tessuto del fegato utilizzando un kit di analisi commerciale. Mescolare i campioni con TBA e calore a 95 ° C per 60 min. centrifuga reattivo e trasferire il surnatante in una piastra a 96 pozzetti. Misurare la densità ottica a 532 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
0,5 g di tessuto epatico con 100 µ l di tampone di lisi di omogeneizzare e analizzare il tessuto lisato per attività di caspase-3/7 relativa utilizzando un kit di analisi commerciale.
	<ol>
<li>Mescolare il tessuto lisato con il tampone di dosaggio del reagente di caspase-3-7 e incubare a temperatura ambiente per 30 min.</li>
		<li>Misurare il livello di fluorescenza in ogni pozzetto usando un lettore di micropiastre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Determinare il livello delle cellule apoptotiche nei campioni di tessuto del fegato utilizzando un kit di rilevazione del morte commerciale in situ .
	<ol>
<li>Pre-trattare la 0,5 g tessuto sezioni con 10 U/mL proteinasi K per 10 min e poi incubare con la miscela di reazione a 37 ° C per 60 min. eseguire l'analisi utilizzando un microscopio a fluorescenza.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Tutti gli autori segnalano che non hanno pertinenti informazioni integrative.

C'è una scarsità significativa dei documenti non autografo del fegato per i trapianti e in risposta i criteri dei donatori sono stati espansi1,2,3,4,5. A causa della scarsità di donatori, NEVLP è stato introdotto come un metodo per valutare e modificare organo funzione6,7. Abbiamo progettato un modello...

Ci sono 14.578 pazienti in lista d'attesa per trapianto di fegato e circa 7.000 trapianti vengono eseguiti per anno1,2. In risposta a questa carenza significativa dei donatori, hanno ampliato i criteri per i donatori di fegato; Questi sono spesso indicati come organi marginali o donatori di criteri estesi e sono tenuti a svolgere meno bene dopo trapianto di allotrapianti di criteri standard, con più alti tassi di disfunzione dell'innesto primario e funzione di ritardo dell'innesto3, 4,5,6. Di conseguenza, NEVLP è stato introdotto come un metodo per valutare e modificare organo funzione6,7. Abbiamo progettato un modello del ratto di NEVLP e utilizzato questo modello per illustrare una delle sue potenziali applicazioni importanti – la sperimentazione di additivi di nuove molecole di perfusato del fegato.
NEVLP è stata valutata in murino (ratto) sia modelli porcine, così come in organi umani scartati6,8,9. I risultati delle prime prove umane di NEVLP sono stati anche recentemente pubblicati10. Sebbene l'aspersione ipotermica macchina chiaramente è diventato lo standard per la conservazione del rene, la temperatura alla quale macchina del fegato dovrebbe verificarsi perfusione è ancora discutibile. NEVLP ha proposti molti vantaggi rispetto ai ipotermico e perfusione subnormothermic. Questi includono lesioni ridotta conservazione, il ripristino della funzione normale dell'organo in condizioni fisiologiche, la capacità di valutare le prestazioni dell'organo e come una piattaforma per la riparazione dell'organo, ritocco e modifica7,11, 12,13,14,15,16,17.
Un numero significativo di studi siano stato completato utilizzando modelli NEVLP suine. Anche se questi modelli sono comparativamente poco costosi quando considerando modelli utilizzando scartato organi umani o test clinici umani, essi sono molto costosi rispetto al nostro piccolo animale NEVLP modello. Una componente significativa della per esperimento costo è il perfusato. Siamo in grado di completare un'aspersione di 4h con 300 mL di perfusato ad un costo relativamente basso. Inoltre, il costo di piccoli animali tra cui ratti è molto basso rispetto al costo dei suini.
In confronto ad altri modelli di NEVLP nel ratto, il modello presentato qui è relativamente semplice da implementare e ha una vasta gamma di applicazioni. Il circuito di perfusione può essere visto nella Figura 1. Il perfusato inizia nel perfusato serbatoio (1), che è un contenitore rivestito di acqua. Perfusato è tirato dal serbatoio di una pompa a rulli (2) e spinto in un windkessel (3) e poi l'ossigenatore (4). L'ossigenatore è impostata per gas controcorrente e flusso di perfusato per fornire uno scambio gas di massima. Il perfusato quindi procede a un riscaldamento della bobina (5) all'interno della camera di perfusione per assicurarsi che è a temperatura fisiologica, e un gorgogliatore (6) per prevenire l'aspersione di bolle d'aria ci sono pre-organo (7) e post-organo (8) porte di campione, che consentono il perfusato essere Campionati. Il perfusato poi entra il fegato attraverso la cannula della vena portale. La cannula della vena portale è collegata a un monitor di pressione che mappa i valori sul software di raccolta dati. Il perfusato poi esce il fegato attraverso la cannula IVC e sfocia il blocco equalizzatore di pressione (9). Infine, il perfusato è tirato dal blocco pressione indietro attraverso la pompa roller e svuotato nel serbatoio. Questo modello include aspersione continua alla vena portale e lascia fuori il flusso pulsatile per l'arteria epatica e la dialisi usati in alcuni altri modelli, ognuno dei quali richiede un circuito separato e aggiuntivo, ma in precedenza è stato dimostrato per non essere richiesto9,13.
Per esplorare l'aggiunta di una nuova molecola terapeutica al perfusato, abbiamo scelto l'enzima catalasi. Catalasi è un organismo saprofago endogeno di ROS che fa parte del meccanismo di difesa interno cellule per mitigare gli effetti di ROS18. Espressione di catalasi è aumentata di ischemia epatica riperfusione pregiudizio19. Sperimentale aggiunta della catalasi è stata dimostrata per diminuire ischemia-reperfusion dentro l'occhio, il cervello e il polmone20,21,22,23,24. PEGilazione ha dimostrato di destinazione catalasi per l'endotelio e aiuto nell'assorbimento della catalasi in cellule endoteliali25. PEG-CAT è stato somministrato per via sistemica con limitata efficacia nel ridurre la lesione di ischemia-riperfusione epatica; Tuttavia, abbiamo supposto che l'aggiunta di CHE PEG-CAT ad un circuito di perfusione d'organo isolato porterebbe a una migliore risultati26,27,28. Qui, si aggiunge il PEG-CAT alla nostra base perfusato e dimostrare la propria capacità ridurre lesioni conservazione del fegato.

<table><tbody><tr><td><forte>Perfusato</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8% Albumina CLS</td><td>Behring, Re di Prussia, PA</td><td>0053-7680-32</td><td></td></tr><tr><td>Williams Media</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>W1878</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Eli Lilly, Indianapolis, IL</td><td>0002-8215-91</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Fresnius Lab, Lago di Zurigo, IL</td><td>C504701</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>Idrocortisone</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>THAM</td><td>Hospira,</td> Inc,0409-1593-04 <td></td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicole - Catalasi</td><td>Sigma</td><td>Aldrich S9549 SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivi di protezione individuale </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgical Mask</td><td>Generic</td><td>N/A</td> Protective Cam Generic N/A <td></td></tr><tr><td>Surgical Gloves</td><td>Generic</td><td>N/A</td> Generic N/A<td></td></tr><tr><td>Liver Procurement</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>Sprague-Dawley Rat Harlan Sprague Dawley Inc.<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>250 -350 grammi</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio chirurgico</td><td>Leica</td><td>M500-N con</td> bombolette di carbone OHS <td></td></tr><tr><td></td><td>Kent Scientific</td><td>SOMNO-2001-8</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Piramal Healthcare</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Pressure-Lok Siringa analitica di precisione&nbsp;</td><td>Valco Instruments Co, Inc.</td><td>SOMNO-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Elettrobisturi</td><td>Macan</td><td>MV-7A</td><td></td></tr><tr><td>Cuscinetto Riscaldante</td><td>Braintree Scientific</td><td>HHP2</td><td></td></tr><tr><td>SomnoSuite Sistema di Anestesia per Piccoli Animali</td><td>Kent Scientific</td><td>SS-MVG-Module</td><td></td></tr><tr><td>PhysioSuite</td><td>Kent Scientific</td><td>PS-MSTAT-RT</td><td></td></tr><tr><td>Camera di isoflurano</td><td>Kent Scientific</td><td>SOMNO-0530LG</td><td></td></tr><tr><td>SurgiVet</td><td>Isotec</td><td>CDS 9000 Ossigeno da tavolo</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Praxair</td><td>98015</td><td></td></tr><tr><td>Divaricatori per costole</td><td>Kent Scientific</td><td>INS600240</td><td></td></tr><tr><td>GenieTouch</td><td>Kent Scientific</td><td>GenieTouch</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina normale</td><td>Baxter</td><td>NDC 0338-0048-04</td><td></td></tr><tr><td>Spugne non tessute 4x4</td><td>Criterio</td><td>104-2411</td><td></td></tr><tr><td>Cotton fioc sterili</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>1009175</td><td></td></tr><tr><td>U-100 Siringa da insulina calibro 27</td><td>Terumo</td><td>22-272328</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 5 ml</td><td>BD</td><td>REF 309603</td><td></td></tr><tr><td>Sutura di seta intrecciata 4-0</td><td>Deknatel, Inc.</td><td>198737LP</td><td></td></tr><tr><td>7-0 Sutura di seta intrecciata</td><td>Teleflex Medical</td><td>REF 103-S Cateteri</td><td></td></tr><tr><td>calibro 16</td><td>BBraun Introcan Safety</td><td>4252586-02</td><td></td></tr><tr><td>Cateteri calibro</td><td>14 BBraun Introcan Safety</td><td>4251717-02</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cannulare per dotto biliare</td><td>Altec</td><td>01-96-1727&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Componenti del circuito di perfusione epatica </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scaldabagno d'acqua</td><td>Lauda Ecoline Staredition</td><td>E103</td><td></td></tr><tr><td>Software di raccolta dati</td><td>ADInstruments&nbsp;</td><td>Labchart 7</td><td></td></tr><tr><td>Circuito di perfusione epatica</td><td>Harvard Apparatus</td><td>73-2901</td><td></td></tr><tr><td>Ossigenatore a membrana</td><td>Mediac SPA</td><td>M03069</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a rulli</td><td>Ismatec</td><td>ISM827B</td><td></td></tr><tr><td>Gas (95% di ossigeno e 5% di anidride carbonica)</td><td>Praxair</td><td>98015</td><td></td></tr><tr><td>Apparecchio Harvard</td> da<td>camera d'organo</td><td>ILP-2</td><td></td></tr><tr><td>1,8 mL Tubo criogenico Arcticle</td><td>USA Scientific</td><td>1418-7410</td><td></td></tr><tr><td>Mucasol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z637181</td><td></td></tr><tr><td>Strumenti microchirurgici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forbici piccole</td><td>Roboz</td><td>RS-5610</td><td></td></tr><tr><td>Forbici grandi</td><td>S & Pinze T</td><td>SAA-15</td><td></td></tr><tr><td>- S</td><td>& Pinze T</td><td>JFCL-7</td><td></td></tr><tr><td>- S</td><td>& T</td><td>FRAS-15 RM-8</td><td></td></tr><tr><td>Clip Applier</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5440</td><td></td></tr><tr><td>Forbici - non micro</td><td>FST 14958-11</td><td>14958-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinze - Punta dritta</td><td>S& T</td><td>FRS-15 RM8TC</td><td></td></tr><tr><td>Clip microchirurgica grande</td><td>Strumenti scientifici fini</td><td>18055-01</td><td></td></tr><tr><td>Clip microchirurgica piccola</td><td>Strumenti scientifici fini</td><td>18055-01</td><td></td></tr><tr><td>Clip microchirurgica piccola</td><td>Strumenti scientifici fini</td><td>18055-02</td><td></td></tr><tr><td>Clip microchirurgica piccola</td><td>Strumenti scientifici fini</td><td>18055-03</td><td></td></tr><tr><td>Morsetti per zanzare</td> piccoli<td>Analisi generica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>post-esperimento Attività </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alanina Aminotransferasi (ALT) Kit di test colorimetrico/fluorimetrico</td><td>BioVision</td><td>K752</td><td></td></tr><tr><td>Kit di test colorimetrico/fluorimetrico</td><td>BioVision</td><td>K35</td> 703002 4 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit di dosaggio per la perossidazione lipidica (MDA)</td><td>Abcam</td><td>ab118970</td><td></td></tr><tr><td>Sistemi di dosaggio Caspase-Glo 3/7</td><td>Promega</td><td>G8090</td><td></td></tr><tr><td>POLARstar OMEGA Lettore di micropiastre</td><td>BMG LABTECH</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

un piccolo modello animale di aspersione epatica normotermica ex vivo

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

C'è una scarsità significativa dei documenti non autografo del fegato per i trapianti, e in risposta ai criteri del donatore sono stati ampliati. Di conseguenza, perfusione normotermica ex vivo del fegato (NEVLP) è stato introdotto come un metodo per valutare e modificare la funzione dell'organo. NEVLP ha molti vantaggi rispetto ai ipotermico e subnormothermic perfusione tra cui ha ridotto la lesione di conservazione, il ripristino della funzione normale dell'organo in condizioni fisiologiche, valutazione delle prestazioni di organo e come piattaforma per la riparazione dell'organo , ritocco e la modifica. Modelli NEVLP sia murini che suini sono stati descritti. Dimostriamo un modello del ratto di NEVLP e utilizzare questo modello per mostrare una delle sue importanti applicazioni — l'uso di una molecola terapeutica aggiunta al perfusato del fegato. Catalasi è un organismo saprofago di ossigeno reattive endogene specie (ROS) e ha dimostrata di diminuire ischemia-reperfusion dentro l'occhio, il cervello e il polmone. PEGilazione ha dimostrato di catalasi all'endotelio di destinazione. Qui, abbiamo aggiunto pegilato-catalasi (PEG-CAT) al perfusato base e dimostrato la sua capacità di mitigare la ferita di conservazione del fegato. Un vantaggio del nostro modello NEVLP roditore è che è poco costoso rispetto ai modelli animali più grandi. Una limitazione di questo studio è che non include attualmente post-aspersione trapianto del fegato. Di conseguenza, stima della funzione del post-trapianto dell'organo non può essere fatta con certezza. Tuttavia, il modello di trapianto di fegato del ratto è ben consolidato e certamente potrebbe essere utilizzato in combinazione con questo modello. In conclusione, abbiamo dimostrato un modello NEVLP poco costoso, semplice e facilmente replicabile utilizzando ratti. Applicazioni di questo modello possono includere test perfusati romanzo e additivi di perfusato, software progettato per la valutazione dell'organo test ed esperimenti progettati per riparare organi.

È stato utilizzato un campione di dimensioni di tre ratti per gruppo. ALT è stata misurata a 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 e 240 min di aspersione. Abbiamo usato di Student t-test per confrontare i risultati tra il perfusato base e base perfusato più gruppi di PEG-CAT in ogni tempo. Comparando il perfusato base e base perfusato plus gruppi PEG-CAT, c'è significativamente inferiore (p &lt; 0,05) ALT nel perfusato base plus gruppo PEG-CAT a 150, 180, 210 e 240 min (<st...

C'è una carenza significativa donatore di fegato, e i criteri per i donatori di fegato sono stati ampliati. Perfusione normotermica ex vivo del fegato (NEVLP) è stato sviluppato per valutare e modificare la funzione dell'organo. Questo studio dimostra un modello del ratto di NEVLP e verifica la capacità di pegylated-catalasi, per attenuare la lesione di conservazione del fegato.

Un piccolo modello animale di aspersione epatica normotermica Ex Vivo

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dei trapianti e della conservazione degli organi. Le applicazioni di questo metodo includono la sperimentazione di nuovi perfusati e additivi per perfusato, il test di software progettato per la valutazione degli organi e l'esecuzione di esperimenti progettati per riparare gli organi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il modello di perfusione epatica normotermica ex vivo qui presentato è semplice, facilmente replicabile, a basso costo e ha un'ampia gamma di applicazioni.Inizia preparando il bracciale a portale calibro 16. Tagliare una sezione di tubo di cinque millimetri e determinare il punto medio della sezione misurando 2,5 millimetri. Incidere nel punto medio e rimuovere la metà anteriore del tubo.Usa un emostatico per schiacciare questa parte ora piatta. Usa un accendino per sciogliere l'altra estremità dell'angiocatheter per creare un labbro. Successivamente, preparare la cannula del dotto biliare tagliando la porta di iniezione da un angiolettico calibro 27, lasciando solo il catetere.Collegalo a una sezione di 10 centimetri di tubo della cannula calibro 27. Posizionare un ratto anestetizzato con il naso nel cono nasale dell'anestesia e le quattro estremità immobilizzate. Monitorare i segni vitali collegando il monitor all'estremità posteriore sinistra.Eseguire un pizzicamento delle dita dei piedi per confermare la profondità appropriata dell'anestesia. Spruzzare l'addome dell'animale con alcol isopropilico al 70% e lasciarlo asciugare. Metti un drappo sterile sull'animale.Quindi, dopo aver praticato un'incisione sulla linea mediana dallo xifoide al pube usando forbici affilate, entrare delicatamente nel peritoneo e incidere il muscolo. Estendere l'incisione lateralmente a sinistra e a destra per formare una croce a livello del bordo inferiore del fegato. A questo punto, abbassare l'anestesia con isoflurano al 2%Ritrarre il processo xifoideo utilizzando una pinza per zanzare curva e le costole utilizzando divaricatori costali.Quindi usa le forbici affilate per tagliare i legamenti falciformi, frenici e gastroepatici. Individuare e legare la vena frenica con una sutura 7-0 il più vicino possibile alla sua origine per evitare perdite. Quindi, usa un applicatore sterile con punta di cotone inumidita per eviscerare il ratto.Avvolgere l'intestino in una garza inumidita con soluzione fisiologica allo 0,9%, facendo attenzione a non distendere il sistema vascolare. Quindi sezionare la vena cava inferiore per rimuovere il tessuto in eccesso. Sezionare dietro l'IVC appena sopra la biforcazione e passare un anello di una sutura di seta 4-O per un uso successivo.Successivamente, ritrarre il rene destro per fornire esposizione alla vena surrenale destra e ritrarre il lobo destro del fegato superiormente con una garza. Legare la vena surrenalica destra con una sutura di seta 7-0 il più vicino possibile all'IVC e cauterizzarla distalmente al laccio. Quindi sezionare con cura la vena splenica.Legare con due suture di seta 7-0 e tagliarle tra le due suture. Dopo aver sezionato l'arteria gastroduodenale, legare l'arteria gastroduodenale con una sutura di seta 7-0 e legare. Quindi sezionare intorno all'arteria epatica e posizionare liberamente una cravatta di sutura di seta 7-0 attorno ad essa.Quindi, seziona il dotto biliare. Quindi controllare la lunghezza del dotto biliare, legarlo all'estremità distale e posizionare un anello di sutura attorno al dotto biliare e prossimalmente il più possibile. Usa piccole forbici per tagliare un foro che sia la metà del diametro del dotto e posiziona un catetere calibro 27 nel dotto biliare prossimalmente.Legare il catetere in posizione utilizzando una sutura per lacci di sandalo romano. Quindi, utilizzare un ago calibro 27 per iniettare 0,5 millilitri di eparina nella vena peniena, o IVC. Quindi clamp e lega l'IVC utilizzando la sutura di seta 4-0 precedentemente posizionata e lega l'arteria epatica utilizzando la sutura di seta 7-0 precedentemente posizionata.Ora, usa una clip microchirurgica per bloccare la vena porta. Incannulare la vena porta utilizzando un angiocatetere calibro 22 e sciacquare con 60 millilitri di soluzione fisiologica fredda allo 0,9% contenente 100 unità di eparina fino a quando il fegato non sbianca. Dopo aver lavato il fegato, esporre l'IVC sopraepatico e tagliarlo il più in alto possibile nel torace.Eseguire l'epatectomia tagliando intorno al diaframma e quindi tagliando l'arteria epatica, l'IVC, la vena porta e qualsiasi legamento aggiuntivo. Sollevare il fegato e posizionare una soluzione salina normale allo 0,9% ghiacciata. Infine, posizionare la cuffia vascolare calibro 16 nella vena porta e collegare il fegato al circuito di perfusione epatica normotermica ex vivo.Prima di iniziare ogni perfusione, è necessario eseguire un'ispezione visiva del circuito per identificare e danneggiare o accumulare componenti del circuito o tubi. Se c'è un accumulo di batteri o altre sostanze sul circuito, le parti devono essere sostituite o pulite. Iniziate facendo scorrere il perfusato a due millilitri al minuto.Osservare il monitor per eventuali picchi di pressione della vena porta, poiché ciò potrebbe indicare che il vaso è diventato occluso e richiedere il riposizionamento della cannula. Inserire la cannula della vena protale nella vena porta cuffiata per il flusso di ritorno del perfusato e suturare utilizzando una sutura di seta 7-0. Una volta posizionate entrambe le cannule, iniziare ad aumentare il flusso del perfusato di un millilitro al minuto fino a raggiungere la pressione fisiologica nell'intervallo da 10 a 16 centimetri di acqua.Rimuovere i campioni di un millilitro dalla pre-porta e dalla post-porta durante la perfusione. Dividere ogni campione da un millilitro in due campioni da 0,5 millilitri. Congelare a scatto una delle aliquote da 0,5 millilitri in provette criogeniche in azoto liquido ed eseguire un'analisi dei gas nel sangue arterioso utilizzando i restanti 0,5 millilitri di perfusato.Quindi, misurare il pH e tamponare il perfusato secondo necessità per tornare a pH 7,4. Dopo quattro ore di perfusione, scollegare il fegato dal circuito di perfusione. Dividere il fegato in segmenti da 0,5 grammi, trasferirlo in provette criogeniche e congelarlo in azoto liquido.L'ALT è stata misurata a zero, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 e 240 minuti di perfusione. C'è significativamente meno ALT nel gruppo base perfusato più PEG-CAT rispetto al perfuso base, che è mostrato in nero a 150, 180, 210 e 240 minuti. L'ATP tissutale è stato mantenuto nel gruppo base perfusato più PEG-CAT rispetto al gruppo base perfusato da solo.La produzione di MDA tissutale era significativamente più alta nel gruppo perfusato base rispetto al gruppo perfusato base più PEG-CAT. Il GSH totale è stato mantenuto nel gruppo base perfusato più PEG-CAT rispetto al gruppo base perfusato da solo. Ogni applicazione proposta di perfusione epatica normotermica ex vivo dovrà essere metodicamente testata in modelli animali prima di essere testata in organi umani scartati e poi in fegati umani.Il modello qui presentato è ideale in quanto è facilmente replicabile, elimina i test estranei ed è a basso costo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un modello di perfusione epatica ex vivo economico, facilmente replicabile e normotermico utilizzando i ratti.

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