Name: Lutilizzo degli ultrasuoni guidati limpianto cellulare diretto del tessuto per listituzione degli xenotrapianti del tumore metastatico biologicamente rilevanti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Impara l'iniezione guidata da ultrasuoni di cellule di neuroblastoma nel surrene murino per creare xenotrapianti ortotopici. Questo metodo non invasivo migliora l'affidabilità degli studi preclinici e facilita la scoperta di farmaci oncologici.

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Questo lavoro ha ricevuto sostegno da Robert Wood Johnson Foundation/Amos medica sviluppo programma, Taubman ricerca docenti e la sezione di chirurgia pediatrica, The University of Michigan. Gli autori desiderano ringraziare Kimber Converso-Baran e Dr. Marcus Jarboe per l'assistenza con procedure di iniezione ultrasuono e la piattaforma di imaging. Ringraziamo Paul Trombley per la sua assistenza con grafica di figura. Ringraziamo anche il reparto di radiologia presso l'Università del Michigan per l'uso del centro per l'Imaging molecolare e il nucleo di Imaging del tumore, che sono in parte supportata da NIH di centro completo del cancro, concedere P30 CA046592. L'Università del Michigan fisiologia Phenotyping Core che è in parte sostenuto da finanziamenti provenienti dal NIH (OD016502) e il centro cardiovascolare Frankel. L'autenticazione di linea cellulare è stato fatto a IDEXX Rica Bioresearch strutture, Columbia, MO. Ringraziamo Tammy Stoll, Dr. Rajen Mody e il programma di oncologia tumore solido Mott. Nostri pazienti e le famiglie con gratitudine sono riconosciute per la loro ispirazione, il coraggio e il supporto continuo della nostra ricerca.

Tutto il lavoro è stato fatto in conformità con la University of Michigan, Institutional Review Board (HUM 00052430) ed è conforme alle procedure approvate dal Comitato Università sull'uso e la cura degli animali (UCUCA). L'unità per laboratorio di medicina animale (ULAM) ha supervisionato la cura degli animali.
Tutto il lavoro è stato fatto con l'approvazione da The University of Michigan, Institutional Review Board (HUM 00052430) ed è conforme a tutte le norme di comitato etico di ricerca umana. Le cellule umane sono considerate essere un materiale potenzialmente a rischio biologico, quindi seguire tutte le precauzioni speciali e accordo con le richieste dal proprio istituto. NSG topi sono gravemente immunocompromessi e suscettibile di malattia causata da batteri che si trovano comunemente nell'ambiente. Utilizzare sempre rigorosa tecnica sterile durante la preparazione di materiali per l'impianto ed eseguire le iniezioni.
1. coltura cellulare
<ol><li>Stabilite linee cellulari umane NB (SH-SY5Y, SK-N-BE2 e IMR32) di crescere in terreno minimo essenziale, completati con 10% siero bovino fetale, la glutamina 2mm, 100 unità/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina. Integrare le cellule IMR32 ulteriormente con 1 mM di piruvato e 0,075% NaHCO3. Mantenere tutte le celle a 37 ° C, 5% CO2 e confluenza di 70-80%.
</li>
	<li>Crescere le linee delle cellule ES umane (TC32, A673, Beyonce-25 e A4573) in medium RPMI supplementato con 10% siero bovino fetale e 6 mM L-glutammina. Mantenere tutte le celle a 37 ° C, 5% CO2 al 70-80% confluenza.
</li>
	<li>Inviare tutte le linee cellulari per l'autenticazione. Nota: L'autenticazione delle cellule avviene presso una struttura esterna, consultare i riconoscimenti.</li>
</ol>2. preparazione di cellule primarie del tumore paziente-derivato
<ol><li>Con il consenso del paziente e del parere conforme, vendemmia scartato tessuto di tumore umano NB da pazienti sottoposti a resezione chirurgica per controllo locale e il trasporto al laboratorio in soluzione di archiviazione di tessuto per la conservazione. Nota: Tutti i campioni dei pazienti sono de-identificati e gestiti conformemente agli orientamenti Institutional Review Board.</li>
	<li>Generare una sospensione di cellule di cancro singolo paziente-derivato (UMNBL001, UMNBL002) dal tessuto del tumore usando un kit di dissociazione del tumore. Trasferire circa 0,5 g di tumore a una piastra di coltura delle cellule di mm 100 contenente 5 mL di tampone di RPMI, 200 µ l di enzima H, 100 µ l di enzima R e 25 µ l di enzima A dal kit di dissociazione umane del tumore.</li>
	<li>Tritare il tumore in piccoli pezzi (2-4 mm) con delle forbici, pinze. Mescolare questi frammenti con le soluzioni al punto 2.2.</li>
	<li>Pipettare la miscela del tumore in un tubo di dissociatore e chiudere il tubo. Capovolgere la provetta e attaccarsi a manicotto del dissociatore di tessuto. Eseguire il programma h_tumor_01.</li>
	<li>Incubare la sospensione delle cellule del tumore ottenuta sopra a 37 ° C per 1 h su una griglia rotante con triturazione intermittente ogni 15 min.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare per una nuova provetta conica 50 mL e aggiungere 10 mL di RPMI. Centrifugare la sospensione cellulare a 314 x g per 5 min.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e sospendere il pellet in 5 mL di RPMI. Passare questa soluzione attraverso un colino di cella di 40 µm e raccogliere la soluzione tesa in un tubo conico di fresca 50 mL. Questo filtro una volta con 5 mL di terreno RPMI di lavare e centrifugare la miscela a 314 x g per 5 min raccogliere un pellet.</li>
	<li>Misurare la densità delle cellule usando un emocitometro15. Sospendere il pellet ottenuto dall'alto in RPMI per ottenere una concentrazione finale di 4 × 105 cellule/10 µ l. Prendere 5 µ l di sospensione cellulare e 5 µ l di matrigel a fare 10 µ l di soluzione di cella per ogni iniezione. Nota: Quantità di RPMI utilizzato dipende la misura di densità cellulare. Ad esempio, se la densità delle cellule misurata del pellet ottenuti è di 4 x 105 celle, è possibile sospendere il pellet in 10 µ l di RPMI.</li>
</ol>3. luciferase Tagging delle cellule tumorali
<ol><li>Fare 10 mL di media di trasduzione con 5 mL di surnatante virale EF1a-Luc2-IRES-mCherry e 5 mL di media delle cellule staminali. Aggiungere 7,5 µ l di 1x polybrene.</li>
	<li>Mix 5 × 106 cellule tumorali in media di trasduzione e piastra a piastra di attacco ultra-low di 100 mm. Incubare a 37 ° C e 5% CO2 durante la notte. Nota: Come piastre di ancoraggio basso sono utilizzati, le cellule non aderirà alla piastra.</li>
	<li>Dopo 24 h, portare il piatto di 100 mm contenenti cellule sotto cofano di coltura del tessuto e trasferire il composto in una provetta conica da 15 mL. Centrifugare la sospensione cellulare a 314 x g per 5 min ottenere il pellet cellulare. Lavare il pellet cellulare una volta con 1 mL di tampone fosfato salino (PBS): 1x e sospendere il pellet cellulare in 1 mL di HBSS contenente 1% siero bovino fetale (FBS).<ol>
<li>Ordinare celle luciferasi basate sul segnale di GFP-positive sulla fluorescenza-attivato delle cellule ordinamento analisi (FACS). Piastra le cellule ordinate il 100mm coltura di tessuti trattati piatto e mantengono la confluenza di 70-80%, 37 ° C e 5% CO2 fino a quando richiesto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Confermare la luciferasi segnale con kit di saggio di luciferasi. Piastra 10 x 104 ordinati cellule per pozzetto in un illuminometer 96 compatibile piastra ed incubare le cellule durante la notte a 37 ° C e 5% CO2. Dopo 24 h, portare la piastra ben 96 a temperatura ambiente e aggiungere il reagente Steady-Glo ai media coltivate in pozzi in rapporto 1:1. Consentire alle cellule di lisare per 5 min e leggere luminescenza in spettrofotometro.</li>
	<li>Portare il piatto di 100 mm sotto una cappa di coltura del tessuto. Scartare i surnatante media. Lavare le cellule una volta con 2 mL di PBS 1X.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di tripsina 0,25% e riporre il piatto di 100 mm nell'incubatore per 2-3 min. Dopo 2-3 min, controllare per rimetterli cellule sotto il microscopio e aggiungere 8 mL di RPMI per disattivare tripsina.</li>
	<li>Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 314 x g per 5 min ottenere una pallina. Scartare il surnatante. Lavare il pellet cellulare con 1 mL di PBS 1X, sospendere il pellet in 5 mL di RPMI e determinare la densità delle cellule usando un emocitometro15. Centrifugare yhe restanti soluzione cella a 314 x g per 5 min ottenere una pallina.</li>
	<li>Sospendere il pellet in RPMI per ottenere una concentrazione di 4 x 105 cellule/10 µ l. Prendere 5 µ l di sospensione cellulare e 5 µ l di matrigel a fare 10 µ l di soluzione di cella per ogni iniezione.</li>
</ol>4. ultrasuono guida della ghiandola surrenale (NB) o Sub renale capsula (ES) dell'impianto
Nota: Tutte le procedure di ultrasuoni vengono eseguite utilizzando un alta risoluzione in vivo imaging system. Per le procedure descritte, è stato usato il trasduttore, che ha una frequenza centrale di 40 MHz e una larghezza di banda di 22-55 MHz.
<ol><li>Utilizzare topi NSG immune-carenti di 6-8-settimana-vecchio per tutte le procedure di iniezione.</li>
	<li>Chill il matrigel e autoclavati Siringhe Hamilton con ago 27G (1.25"), e cateteri 22G (diametro esterno 0,9 mm, 25 mm di lunghezza) durante la notte a 4 ° C.</li>
	<li>Posto la soluzione di cella preparata nel passaggio 3 il ghiaccio.</li>
	<li>Anestetizzare i topi in una camera di induzione utilizzando 2% isoflurano O2 consegnato a 2 L/min. Nota: Un'anestesia adeguata è determinata con la mancanza di movimento attivo e il mantenimento della respirazione spontanea.</li>
	<li>Una volta anestetizzato, depilare la schiena e il fianco degli animali utilizzando un rasoio e lozione per capelli rimozione (ad esempio Nair).</li>
	<li>Trasferire l'animale alla piattaforma di imaging con addominali laterali verso il basso, dove il naso dell'animale è inserito in un musetto e protetta durante l'inspirazione isoflurano.</li>
	<li>Posto unguento ottico negli occhi dell'animale per evitare l'essiccazione. Il mouse in luogo per impedire qualsiasi movimento involontario del nastro.</li>
	<li>Identificare il fegato murino, vena cava, milza, rene sinistro e ghiandola surrenale sinistra adiacente utilizzando visualizzazione di ultrasuono.</li>
	<li>Utilizzare guanti sterili, mascherina e cappuccio per la protezione personale e la manutenzione di condizioni di sterilità. Sotto guida ecografica, delicatamente inserire un catetere 22g attraverso la pelle e muscolo direttamente nella ghiandola surrenale sinistra per fornire un canale per iniezione cellulare. Rimuovere l'ago e lasciare il catetere in posizione.</li>
	<li>Carico una siringa Hamilton refrigerata con un ago piccolo calibro con 10 µ l di soluzione di cella, quindi Guida la siringa stereotactically attraverso il catetere posizionato al centro della ghiandola surrenale.</li>
	<li>Iniettare le cellule nel tessuto adrenale mirato. Lasciare l'ago in posizione per 1-2 min consentire il matrigel impostare. Rimuovere lentamente l'ago, seguita dalla rimozione del catetere.</li>
	<li>Rimettere i topi nella loro gabbia e assicurarsi che il mouse riprende conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale. Nota: a causa della natura come minimo dilagante di questa tecnica, dolore post procedurale è minimo, ma ancora monitorati su base giornaliera con topi salute controlli. "deve essere seguita con una frase:"se inaspettati segni di dolore o angoscia sono si identificate nel corso di un esperimento, consultare con il vostro apparecchio istituzionale supporto veterinario per informazioni riguardanti l'analgesia o altre cure mediche. 
</li>
</ol>

<ol><li>Sanmamed, M. F., Chester, C., Melero, I., Kohrt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+optimal+murine+models+to+investigate+immune+checkpoint+blockers+and+their+combination+with+other+immunotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Defining the optimal murine models to investigate immune checkpoint blockers and their combination with other immunotherapies.</a> Ann Oncol. 27 (7), 1190-1198 (2016).</li>
<li>Fidler, I. J., Hart, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+diversity+in+metastatic+neoplasms%3A+origins+and+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Biological diversity in metastatic neoplasms: origins and implications.</a> Science. 217 (4564), 998-1003 (1982).</li>
<li>Bibby, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+models+of+cancer+for+preclinical+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation.</a> Eur J Cancer. 40 (6), 852-857 (2004).</li>
<li>Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+Models+are+Necessary+to+Predict+Therapy+of+Transplantable+Tumors+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Orthotopic Models are Necessary to Predict Therapy of Transplantable Tumors in Mice.</a> Cancer Metastasis Rev. 17 (3), 279-284 (1998).</li>
<li>Daniel, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primary+xenograft+model+of+small-cell+lung+cancer+reveals+irreversible+changes+in+gene+expression+imposed+by+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro.</a> Cancer Res. 69 (8), 3364-3373 (2009).</li>
<li>Khanna, C., Jaboin, J. J., Drakos, E., Tsokos, M., Thiele, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologically+relevant+orthotopic+neuroblastoma+xenograft+models%3A+Primary+adrenal+tumor+growth+and+spontaneous+distant+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Biologically relevant orthotopic neuroblastoma xenograft models: Primary adrenal tumor growth and spontaneous distant metastasis.</a> In Vivo. 16 (2), 77-85 (2002).</li>
<li>Stewart, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+human+orthotopic+neuroblastoma+xenograft%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a human orthotopic neuroblastoma xenograft.</a> Dev Biol. 407, 344-355 (2015).</li>
<li>Jäger, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimally+Invasive+Establishment+of+Murine+Orthotopic+Bladder+Xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts.</a> J. Vis. Exp. (84), e51123(2014).</li>
<li>Teitz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+Models+for+Neuroblastoma%3A+Establishing+a+Baseline+for+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Preclinical Models for Neuroblastoma: Establishing a Baseline for Treatment.</a> PLoS ONE. 6 (4), e19133(2011).</li>
<li>Braekeveldt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroblastoma+patient-derived+orthotopic+xenografts+retain+metastatic+patterns+and+geno-+and+phenotypes+of+patient+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Neuroblastoma patient-derived orthotopic xenografts retain metastatic patterns and geno- and phenotypes of patient tumours.</a> International Journal of Cancer. 136 (5), 252-261 (2015).</li>
<li>Van Noord, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-directed+Implantation+Using+Ultrasound+Visualization+for+Development+of+Biologically+Relevant+Metastatic+Tumor+Xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Tissue-directed Implantation Using Ultrasound Visualization for Development of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts.</a> In Vivo. 31 (5), 779-791 (2017).</li>
<li>Vormoor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Preclinical+Orthotopic+Xenograft+Model+of+Ewing+Sarcoma+and+Other+Human+Malignant+Bone+Disease+Using+Advanced+In+Vivo+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Development of a Preclinical Orthotopic Xenograft Model of Ewing Sarcoma and Other Human Malignant Bone Disease Using Advanced In Vivo Imaging.</a> PLoS ONE. 9 (1), e85128(2014).</li>
<li>Hakky, T. S., Gonzalvo, A. A., Lockhart, J. L., Rodriguez, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Ewing+sarcoma+of+the+kidney%3A+a+symptomatic+presentation+and+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Ther+Adv+Urol%22%5BJournal%5D)">Primary Ewing sarcoma of the kidney: a symptomatic presentation and review of the literature.</a> Ther Adv Urol. 5 (3), 153-159 (2013).</li>
<li>Cheng, H., Clarkson, P. W., Gao, D., Pacheco, M., Wang, Y., Nielsen, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+Antibodies+Targeting+CSF1+Impede+Macrophage+Recruitment+in+a+Xenograft+Model+of+Tenosynovial+Giant+Cell+Tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Sarcoma%22%5BJournal%5D)">Therapeutic Antibodies Targeting CSF1 Impede Macrophage Recruitment in a Xenograft Model of Tenosynovial Giant Cell Tumor.</a> Sarcoma. 2010, 174528(2010).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology%22">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology</a>. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno alcuna informazioni integrative.

Ultrasuono-guida l'impianto delle cellule NB ed ES è un metodo efficace e sicuro per stabilire gli xenotrapianti murini affidabili per studi preclinici nella biologia del cancro. Fondamentale per il successo di ultrasuono-guida del tessuto-mirati l'impianto è la presenza e la disponibilità di personale qualificato con esperienza nella localizzazione anatomica dell'organo di interesse e nella iniezione stereotactic delle cellule del tumore.
La dissociazione del tessuto del tumore si è rivelata ...

Modelli animali dello xenotrapianto sono strumenti essenziali per studi preclinici di terapie anticancro. Gli xenotrapianti murini standard si basano sull'impianto sottocutaneo fianco delle cellule, fornire un sito efficiente e facilmente accessibile per controllare la crescita del tumore. Lo svantaggio dei modelli sottocutanei è la loro mancanza di caratteristiche biologiche del tumore-specifici, che possono limitare la loro potenziale riprodurrsi per metastasi1. Tali limitazioni sono superate mediante l'utilizzo degli xenotrapianti di orthotopic in quale tumore le cellule sono innestate in siti di tessuto nativo, fornendo un microambiente pertinente con potenziale metastatico2. Modelli di xenotrapianto ortotopici mantengono originale caratteristiche biologiche e forniscono modelli affidabili per droga preclinici discovery3,4. Le cellule tumorali utilizzate per l'impianto diretto di tessuto sono linee cellulari stabilizzate o cellule paziente-derivate da tumori di pazienti. Gli xenotrapianti stabiliti da linee cellulari del cancro possono esibire alta divergenza genetica del tumore primario rispetto al paziente gli xenotrapianti derivata5. Detto questo, l'istituzione degli xenotrapianti orthotopic paziente-derivato è diventato lo standard preferito per testare nuove terapie nella scoperta della droga di cancro.
Nel neuroblastoma (NB) di cancro pediatrico, modelli di xenotrapianto ortotopici ricapitolano biologia del tumore primario e sviluppano metastasi ai tipici siti di NB diffondere6,7. NB si sviluppa nella ghiandola adrenale o lungo la catena simpatica paravertebral. I metodi più comuni di orthotopic impianto richiedono procedure chirurgiche trans-addominale aperte. Tali metodi sono spesso noiosi, hanno un'elevata morbilità animale e periodi di recupero complesso. Ecografia ad alta risoluzione è stato recentemente utilizzato per l'impianto diretto di tessuto delle cellule del tumore nello sviluppo di diversi modelli murini per cancro ricerca8,9. La tecnica è affidabile, riproducibile, efficiente e sicuro per la creazione di tumore metastatico pertinenti xenotrapianti10,11.
L'istituzione degli xenotrapianti di cancro pediatrico di ultrasuono-guida destinazione organo ago e localizzazione impianto di linee cellulari e cellule tumorali paziente-derivato è dimostrata11. La tecnica è stata utilizzata per NB mirati alla ghiandola surrenale murina. Sarcoma di Ewing (ES) è principalmente un cancro osseo, comunemente-veduto nelle ossa lunghe come il femore e le ossa pelviche12. Rapporti di caso hanno dimostrato che per determinare se la crescita di un cancro principalmente osseous è realizzabile in tessuto renale, una posizione capsulare renale sub è stato scelto per l'impianto di orthotopic13. L'impianto delle cellule capsulare renale sub delle cellule del tumore è stata utilizzata come un promettente modello per studiare le metastasi spontanee per ES14.

<table><tbody><tr><td>Mice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NOD-SCID</td><td>Charles River</td><td>394</td><td></td></tr><tr><td>NSG</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5557</td><td></td></tr><tr><td>Cell Line&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NB</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IMR-32</td><td>ATCC</td><td>CCL-127</td><td>Linea cellulare di neuroblastoma umano</td></tr><tr><td>SH-SY5Y</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td>Linea cellulare di neuroblastoma umano</td></tr><tr><td>SK-N-Be2</td><td>ATCC</td><td>CRL-2271</td><td>Linea cellulare di neuroblastoma umano consolidata</td></tr><tr><td>ES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC32&nbsp;</td><td></td><td></td> COGcell.ORG <td>Linea cellulare per sarcoma di Ewing umana</td></tr><tr><td>A673</td><td>COGcell.ORG</td><td></td><td>Linea cellulare per sarcoma di Ewing umana</td></tr><tr><td>CHLA-25</td><td>COGcell.ORG</td><td></td><td>Linea cellulare per sarcoma di Ewing umana</td></tr><tr><td>A4573</td><td>COGcell.ORG</td><td></td><td>Linea cellulare per sarcoma di Ewing umana</td></tr> <tr><td>Cell Line media </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD BioSciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Dissociazione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strumenti di dissezione</td><td>KentScientific</td><td>INSMOUSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>Kit di dissociazione del tumore umano&nbsp;</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td></td></tr><tr><td>dissociatore MACS delicato MACS</td><td>Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>delicato MACS C provette</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare</td><td>Corning</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Luciferase Tagging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lenti-GFP1 virus</td><td>Università del Michigan,</td> kit di analisi della glo-luciferasi costante del <td>virus della luciferasi del nucleo</td><td></td> vettoriale</tr><tr><td></td><td>Promega</td><td>E2510</td><td></td></tr><tr><td>Bioluminescenza Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ivis Sistema di imaging dello spettro</td><td>PerkinElmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin</td><td>Promega</td><td>E160X</td><td></td></tr><tr><td>Anesthetic </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano inalato&nbsp;</td><td>Piramal Critical Care Inc</td><td>66794-0017-25</td><td></td></tr><tr><td>Iniezione guidata da ultrasuoni</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100 Imaging ad alta risoluzione</td><td>Vevo</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe Hamilton (ago calibro 27)</td><td>Hamilton</td><td>80000</td><td></td></tr><tr><td>22 Gauge Angiocatheter</td><td>BD Biosciences</td><td>381423</td><td></td></tr><tr><td>Unguento ottico</td><td>Principali prodotti farmaceutici</td><td>301909</td><td></td></tr><tr><td>Nair</td><td>Church & Dwight Co</td><td></td><td>Agente di depilazione</td></tr><tr><td>Aquasonic 100 Gel di trasmissione degli ultrasuoni</td><td>Parker</td><td></td><td>Gel per ultrasuoni</td></tr><tr><td>Istologia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD99</td><td>DAKO</td><td>M3601</td><td>Anticorpo primario</td></tr><tr><td>Tirosina idrossilasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2928</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>primario Anticorpo secondario del polimero HRP</td><td>Biocare</td><td>BRR4056KG</td><td></td></tr><tr><td><forte>Miscellanea</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10H</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Provette per microcentrifuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>P1000</td><td>pipetta Eppendorf</td><td></td><td></td>Pipetta 3120000062</tr><tr><td>P200</td><td>Eppendorf</td><td>3120000054</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette P1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-375E</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette P200</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-375D</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta portatile Drummond</td><td></td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>bilancia digitale per animali&nbsp;</td><td>KentScientific</td><td>SCL-1015</td><td></td></tr><tr><td>Calibri</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-664-16</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di attacco basse a 6 pozzetti</td><td>Corning</td><td>07-200-601</td><td></td></tr><tr><td>Piastre trattate con coltura tissutale da 10 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr></tbody></table>

l'utilizzo degli ultrasuoni guidati l'impianto cellulare diretto del tessuto per l'istituzione degli xenotrapianti del tumore metastatico biologicamente rilevanti

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

Test preclinici di terapie anticancro si basa su modelli di xenotrapianto pertinenti che imitano le tendenze innate del cancro. Modelli standard fianco sottocutaneo vantaggi procedurali facilità e la capacità di progressione del tumore monitor e risposta senza imaging invasivo. Tali modelli sono spesso incoerenti nei test clinici traslazionale e con limitate caratteristiche biologicamente rilevanti con bassa propensione a produrre metastasi, come c'è una mancanza di un microambiente nativo. In confronto, modelli di xenotrapianto ortotopici presso siti nativi del tumore sono stati indicati per imitare il microambiente tumorale e replicare le caratteristiche di malattia importante come diffusione metastatica distante. Questi modelli richiedono spesso noiose procedure chirurgiche con periodi prolungati di tempo e recupero anestetici. Per risolvere questo problema, i ricercatori del cancro hanno recentemente utilizzato tecniche di iniezione ultrasuono-guida per stabilire modelli di xenotrapianto del cancro per gli esperimenti preclinici, che permette per istituzione rapida e affidabile di tessuto-regia di modelli murini. Visualizzazione di ultrasuono fornisce anche un metodo non invasivo per la valutazione longitudinale del tumore attecchimento e crescita. Qui, descriviamo il metodo per iniezione ultrasuono-guida delle cellule tumorali, che utilizzano la ghiandola surrenale per NB e capsula renale sub per ES. Questo approccio mini-invasivo supera l'impianto noioso chirurgia a cielo aperto delle cellule tumorali nel tessuto-specifici percorsi di crescita e di metastasi e sporadicamente periodi di recupero morboso. Descriviamo l'utilizzo di linee cellulari stabilizzate e di linee cellulari derivate paziente per iniezione ortotopico. Pre-fatte kit commerciali sono disponibili per la dissociazione del tumore e luciferasi tagging delle cellule. Iniezione di sospensione cellulare utilizzando Consiglio di immagine fornisce una piattaforma come minimo dilagante e riproducibile per la creazione di modelli preclinici. Questo metodo viene utilizzato per creare modelli preclinici affidabili per altri tumori, come la vescica, fegato e pancreas, esemplificando il suo potenziale non sfruttato per numerosi modelli di cancro.

Utilizzando le procedure presentate, impianto ecoguidato di NB cellule nella ghiandola adrenale è stato fatto in una procedura dedicata sala attrezzata con un tavolo operatorio riscaldato. Rilievi di braccio e il piede sono stati disposti per monitoraggio attività del cuore murino (Figura 1A). L'animale è rimasto anestetizzato sotto utilizzando il cono di naso inalazione isoflurane. Usando una sonda di ultrasuono ad alta definizione, il rene di sinistra è sta...

Qui, presentiamo un protocollo per utilizzare iniezione ultrasuono-guida del neuroblastoma (NB) e cellule (ES) il sarcoma di Ewing (stabilito linee cellulari e cellule tumorali derivate dal paziente) biologicamente rilevanti siti per creare modelli preclinici affidabili per il cancro ricerca.

L'utilizzo degli ultrasuoni guidati l'impianto cellulare diretto del tessuto per l'istituzione degli xenotrapianti del tumore metastatico biologicamente rilevanti

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

L'obiettivo di questo metodo è quello di stabilire xenotrapianti ortotopici di cancro biologicamente rilevanti per studi preclinici. Le cellule di neuroblastoma derivate dal paziente vengono iniettate nella ghiandola surrenale murina mediante guida ecografica senza chirurgia a cielo aperto o recupero prolungato. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande critiche nella biologia del cancro e nella ricerca traslazionale, come gli studi sull'evoluzione del tumore, le risposte terapeutiche nel microambiente nativo e le metastasi.Tale conoscenza migliorerebbe notevolmente l'affidabilità degli studi preclinici e faciliterebbe la scoperta di farmaci. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è derivata dal paziente, diretta ai tessuti, efficiente e affidabile nella produzione di un modello xenografato ortotopico per la ricerca sulla terapia del cancro. A dimostrare le fasi critiche della procedura saranno Sahiti Chukkapalli, un tecnico senior e nostro responsabile di laboratorio, insieme a Tina Thomas, ricercatrice nel nostro laboratorio.Generare una singola sospensione di cellule tumorali derivata dal paziente dal tessuto tumorale utilizzando un kit di dissociazione tumorale.

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In questo video, le cellule di melanoma di derivazione umana vengono impiantate per via sottocutanea nella regione del fianco di un topo immunocompromesso. Il modello PDX consente l'indagine preclinica delle cellule di melanoma che ricapitolano meglio l'eterogeneità del tumore e l'aggressività del melanoma osservate in condizioni in vivo.

Modellazione di xenotrapianti derivati da pazienti: una tecnica per generare modelli murini di melanoma

La tecnica istituita per inoculare ortotopici xenotrapianti carcinoma vescicale invasivo primarie richiede laparotomia e la mobilitazione della vescica. Questa procedura infligge significativa morbilità sui topi, è tecnicamente difficile e richiede molto tempo. Abbiamo quindi sviluppato una alta precisione, approccio percutaneo utilizzando guida ecografica.

Mini-Invasiva Istituzione di murini ortotopico vescica Xenotrapianti

Questo protocollo descrive la generazione di modelli di xenotrapianto ortotopico derivati dal paziente infondendo inmodo vesicalmente cellule carcinoma a cellule urotemaliali o cellule di cancro colorettale intra-rettale in diabete/grave non obesi immunodeficienza (NOD/SCID) per la crescita primaria del tumore e metastasi spontanee sotto l'influenza delle cellule stromali del linfonodo, che imitano la progressione delle malattie metastatiche umane.

Modelli di Xenotrapianto ortotopico derivati dal paziente per carcinoma a cellule uroteliali umane e crescita del tumore del tumore colorettale e metastasi spontanea

I modelli murini xenoma uvea-hettale del fegato umano ortotopico sono stati creati utilizzando tecniche di impianto ortotopico chirurgico con pezzi tumorali derivati dal paziente e tecniche di iniezione di aghi con linee cellulari di melanoma uveale umano coltivate.

Generazione di una piattaforma di Melanoma Uvenoma Uvenoft umano del fegato in topi immunodeficienti

Descriviamo un protocollo per l'impianto guidato ad ultrasuoni di linee cellulari adenocarcinoma pancreatiche derivate da murini direttamente nel sito tumorale nativo. Questo approccio ha portato a tumori pancreatici rilevabili dalla scansione a ultrasuoni entro 2-4 settimane dall'iniezione, e ha ridotto significativamente la proporzione di semina delle cellule tumorali sulla parete peritoneale rispetto all'impianto ortotopico chirurgico.

Impianto ortotopico a ultrasuoni dell'adenocarcinoma dugalese Murine

Qui presentiamo un protocollo per testare l'efficacia delle terapie mirate selezionate in base alla trucco genomico di un tumore. Il protocollo descrive l'identificazione e la convalida dei riarrangiamenti strutturali del DNA, l'innesto dei tumori dei pazienti nei topi e il test delle risposte ai farmaci corrispondenti.

Test delle terapie mirate nel cancro utilizzando l'analisi dell'alterazione strutturale del DNA e gli Xenogrini derivati dal paziente

I modelli di metastasi ossee non sviluppano metastasi in modo uniforme o con un'incidenza del 100%. L'iniezione diretta di cellule tumorali intra-ossee può provocare l'embolizzazione del polmone. Presentiamo la nostra tecnica di modellazione dei tumori ossei primari e delle metastasi ossee utilizzando l'impianto di innesto tumorale solido nell'osso, portando a attecchimento e crescita riproducibili.

Modellazione dei tumori ossei primari e delle metastasi ossee con impianto di innesto tumorale solido nell'osso

I modelli PDX di metastasi del sistema nervoso centrale rappresentano le caratteristiche fenotipiche e molecolari delle metastasi umane, rendendoli modelli eccellenti per studi preclinici. Qui viene descritto come stabilire i modelli PDX e le vie di inoculazione meglio utilizzate per gli studi preclinici.

L'istituzione e l'utilizzo di modelli di xenotrapianto derivati dal paziente di metastasi del sistema nervoso centrale

Presentiamo un protocollo per generare un modello di carcinoma pancreatico ortotopico minimamente invasivo mediante iniezione ecoguidata di cellule tumorali pancreatiche umane e il successivo monitoraggio della crescita tumorale in vivo mediante imaging ecografico.

Generazione di uno xenotrapianto ortotopico di cellule tumorali pancreatiche mediante iniezione guidata da ultrasuoni

Questo protocollo descrive un metodo efficiente e non chirurgico per l'impianto ortotopico di xenotrapianti derivati da pazienti con carcinoma mammario nei topi. La tecnica prevede la dissociazione enzimatica del tumore seguita da un'iniezione diretta nei cuscinetti adiposi mammari, consentendo un impianto ad alto rendimento. La convalida completa garantisce la fedeltà del modello, facilitando studi rigorosi su vari sottotipi di cancro al seno.

Dissociazione ad alto rendimento e impianto ortotopico di xenotrapianti derivati da pazienti con carcinoma mammario

L'obiettivo di questo protocollo è fornire ai ricercatori una tecnica altamente riproducibile per le impianti intracraniche.

Impianto intracranico stereotassico di linee cellulari xenoinnestate derivate dal paziente con glioblastoma nei topi

Impara l'iniezione guidata da ultrasuoni di cellule di neuroblastoma nel surrene murino per creare xenotrapianti ortotopici. Questo metodo non invasivo migliora l'affidabilità degli studi preclinici e facilita la scoperta di farmaci oncologici.

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L'utilizzo degli ultrasuoni guidati l'impianto cellulare diretto del tessuto per l'istituzione degli xenotrapianti del tumore metastatico biologicamente rilevanti

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