L'utilizzo degli ultrasuoni guidati l'impianto cellulare diretto del tessuto per l'istituzione degli xenotrapianti del tumore metastatico biologicamente rilevanti

L'obiettivo di questo metodo è quello di stabilire xenotrapianti ortotopici di cancro biologicamente rilevanti per studi preclinici. Le cellule di neuroblastoma derivate dal paziente vengono iniettate nella ghiandola surrenale murina mediante guida ecografica senza chirurgia a cielo aperto o recupero prolungato. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande critiche nella biologia del cancro e nella ricerca traslazionale, come gli studi sull'evoluzione del tumore, le risposte terapeutiche nel microambiente nativo e le metastasi.

Tale conoscenza migliorerebbe notevolmente l'affidabilità degli studi preclinici e faciliterebbe la scoperta di farmaci. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è derivata dal paziente, diretta ai tessuti, efficiente e affidabile nella produzione di un modello xenografato ortotopico per la ricerca sulla terapia del cancro. A dimostrare le fasi critiche della procedura saranno Sahiti Chukkapalli, un tecnico senior e nostro responsabile di laboratorio, insieme a Tina Thomas, ricercatrice nel nostro laboratorio.

Generare una singola sospensione di cellule tumorali derivata dal paziente dal tessuto tumorale utilizzando un kit di dissociazione tumorale. Inizia trasferendo circa mezzo grammo di tessuto tumorale in un piatto di coltura cellulare da 100 millimetri contenente cinque millilitri di tampone RPMI integrato con enzima. Quindi, usa le forbici e le pinze per tessuti per tritare il tumore in piccoli pezzi da due a quattro millimetri.

Pipettare la miscela tumorale in una provetta dissociatrice e chiudere la provetta. Capovolgere il tubo, fissarlo al manicotto di un dissociatore tissutale e dissociare il tessuto utilizzando il programma appropriato. Dopo la dissociazione, incubare la sospensione di cellule tumorali su un rack rotante a 37 gradi Celsius per un'ora.

Triturare la sospensione cellulare ogni 15 minuti durante l'incubazione. Dopo l'incubazione, trasferire la sospensione cellulare in una nuova provetta conica da 50 millilitri e aggiungere 10 millilitri di RPMI. Quindi, centrifugare la sospensione cellulare a 314 g per cinque minuti.

Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e sospendere il pellet in cinque millilitri di RPMI. Passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 micron e raccogliere la soluzione filtrata in una provetta fresca da 50 millilitri. Dopo aver lavato il colino con cinque millilitri di terreno RPMI, centrifugare la sospensione cellulare a 314 g per cinque minuti per raccogliere un pellet.

Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Quindi, sospendere il pellet in RPMI per ottenere una concentrazione finale di quattro volte 10 alle cinque celle per 10 microlitri di volume. Trasferire cinque microlitri di questa sospensione cellulare per iniezione in una provetta nuova e lo stesso volume di matrice della membrana basale per ottenere 10 microlitri di soluzione cellulare per ogni iniezione e metterla su ghiaccio.

Trasferire il mouse sulla piattaforma di imaging con il lato addominale rivolto verso il basso. Montare e fissare il cono nasale per mantenere l'anestesia con isoflurano. Iniziare la procedura di impianto utilizzando una lozione depilatoria e un rasoio per depilare la parte posteriore e il fianco di un topo NSG immunodeficiente di sei-otto settimane adeguatamente anestetizzato.

Applicare un unguento ottico sugli occhi dell'animale per evitare che si secchi. Quindi, fissa il mouse con del nastro adesivo per evitare qualsiasi movimento involontario. Successivamente, utilizzare la visualizzazione ecografica per identificare il fegato murino, la vena cava, la milza, il rene sinistro e la ghiandola surrenale sinistra adiacente.

Caricare una siringa di Hamilton refrigerata, dotata di ago di piccolo diametro, con 10 microlitri di soluzione cellulare. Quindi, sotto guida ecografica, ha inserito delicatamente un catetere raffreddato calibro 22 attraverso la pelle e il muscolo della schiena, direttamente nella ghiandola surrenale sinistra per fornire un canale per l'iniezione cellulare. Rimuovere l'ago e lasciare il catetere in posizione.

La visualizzazione della ghiandola surrenale durante l'inserimento del catetere, insieme all'ago e alla sua traiettoria, è fondamentale per garantire lesioni minime alle strutture e agli organi circostanti e una minore morbilità murina. Quindi, guidare la siringa attraverso il catetere posizionato al centro della ghiandola surrenale. Poiché la siringa viene guidata attraverso il catetere, è importante mantenere la stabilità del catetere e osservare l'avanzamento dell'ago.

Si noti che l'ago stesso si estende per circa due millimetri oltre la terminazione del catetere, la sua posizione è facilmente visibile all'ecografia. Iniettare le cellule nel tessuto surrenale mirato. Lasciare l'ago in posizione per uno o due minuti per consentire alla matrice della membrana basale di solidificarsi.

Dopo che la matrice della membrana basale si è solidificata, rimuovere lentamente l'ago, seguito dalla rimozione del catetere. Infine, metti il topo in una gabbia di recupero fino a quando non riacquista sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale prima di tornare alla gabbia di casa. L'ecografia monitora la progressione tumorale in vivo.

Questa immagine mostra un'immagine ecografica della ghiandola surrenale, una settimana dopo l'iniezione. Qui, l'imaging a luminescenza di un topo iniettato con neuroblastoma una settimana dopo l'iniezione, mostra letture non indicative di attecchimento tumorale. Dopo due settimane, l'ecografia mostra l'attecchimento e la progressione del tumore in un'area di circa 40 millimetri quadrati.

La bioluminescenza a due settimane dopo l'iniezione ha mostrato una luminosità che misurava da 10 alla settima, il che è indicativo dell'assorbimento cellulare e della crescita tumorale correlati ai risultati degli ultrasuoni. L'ecografia otto settimane dopo l'iniezione ha mostrato una crescita continua del tumore con una misurazione dell'area superiore a 100 millimetri quadrati. Ancora una volta, la bioluminescenza ha confermato i risultati dell'ecografia con un aumento dei livelli di radianza da 10 a nove.

L'ecografia 3D del tumore ha mostrato un volume superiore a 100 millimetri cubi, la linea di base che il nostro laboratorio utilizza per l'avvio degli studi terapeutici preclinici. Tumore asportato di dimensioni superiori a un centimetro, correlato con misurazioni ecografiche e segnali di luminescenza. Questo terreno fornisce la dimostrazione di come stabilire con successo xenografie ortotopiche surrenaliche con cellule di neuroblastoma derivate da pazienti, utilizzando la guida ecografica.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di 12 minuti per iniezione se eseguita correttamente.