L'utilizzo degli ultrasuoni guidati l'impianto cellulare diretto del tessuto per l'istituzione degli xenotrapianti del tumore metastatico biologicamente rilevanti
25 maggio 2018
Qui, presentiamo un protocollo per utilizzare iniezione ultrasuono-guida del neuroblastoma (NB) e cellule (ES) il sarcoma di Ewing (stabilito linee cellulari e cellule tumorali derivate dal paziente) biologicamente rilevanti siti per creare modelli preclinici affidabili per il cancro ricerca.
L'obiettivo di questo metodo è quello di stabilire xenotrapianti ortotopici di cancro biologicamente rilevanti per studi preclinici. Le cellule di neuroblastoma derivate dal paziente vengono iniettate nella ghiandola surrenale murina mediante guida ecografica senza chirurgia a cielo aperto o recupero prolungato. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande critiche nella biologia del cancro e nella ricerca traslazionale, come gli studi sull'evoluzione del tumore, le risposte terapeutiche nel microambiente nativo e le metastasi.
Tale conoscenza migliorerebbe notevolmente l'affidabilità degli studi preclinici e faciliterebbe la scoperta di farmaci. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è derivata dal paziente, diretta ai tessuti, efficiente e affidabile nella produzione di un modello xenografato ortotopico per la ricerca sulla terapia del cancro. A dimostrare le fasi critiche della procedura saranno Sahiti Chukkapalli, un tecnico senior e nostro responsabile di laboratorio, insieme a Tina Thomas, ricercatrice nel nostro laboratorio.
Generare una singola sospensione di cellule tumorali derivata dal paziente dal tessuto tumorale utilizzando un kit di dissociazione tumorale. Inizia trasferendo circa mezzo grammo di tessuto tumorale in un piatto di coltura cellulare da 100 millimetri contenente cinque millilitri di tampone RPMI integrato con enzima. Quindi, usa le forbici e le pinze per tessuti per tritare il tumore in piccoli pezzi da due a quattro millimetri.
Pipettare la miscela tumorale in una provetta dissociatrice e chiudere la provetta. Capovolgere il tubo, fissarlo al manicotto di un dissociatore tissutale e dissociare il tessuto utilizzando il programma appropriato. Dopo la dissociazione, incubare la sospensione di cellule tumorali su un rack rotante a 37 gradi Celsius per un'ora.
Triturare la sospensione cellulare ogni 15 minuti durante l'incubazione. Dopo l'incubazione, trasferire la sospensione cellulare in una nuova provetta conica da 50 millilitri e aggiungere 10 millilitri di RPMI. Quindi, centrifugare la sospensione cellulare a 314 g per cinque minuti.
Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e sospendere il pellet in cinque millilitri di RPMI. Passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 micron e raccogliere la soluzione filtrata in una provetta fresca da 50 millilitri. Dopo aver lavato il colino con cinque millilitri di terreno RPMI, centrifugare la sospensione cellulare a 314 g per cinque minuti per raccogliere un pellet.
Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Quindi, sospendere il pellet in RPMI per ottenere una concentrazione finale di quattro volte 10 alle cinque celle per 10 microlitri di volume. Trasferire cinque microlitri di questa sospensione cellulare per iniezione in una provetta nuova e lo stesso volume di matrice della membrana basale per ottenere 10 microlitri di soluzione cellulare per ogni iniezione e metterla su ghiaccio.
Trasferire il mouse sulla piattaforma di imaging con il lato addominale rivolto verso il basso. Montare e fissare il cono nasale per mantenere l'anestesia con isoflurano. Iniziare la procedura di impianto utilizzando una lozione depilatoria e un rasoio per depilare la parte posteriore e il fianco di un topo NSG immunodeficiente di sei-otto settimane adeguatamente anestetizzato.
Applicare un unguento ottico sugli occhi dell'animale per evitare che si secchi. Quindi, fissa il mouse con del nastro adesivo per evitare qualsiasi movimento involontario. Successivamente, utilizzare la visualizzazione ecografica per identificare il fegato murino, la vena cava, la milza, il rene sinistro e la ghiandola surrenale sinistra adiacente.
Caricare una siringa di Hamilton refrigerata, dotata di ago di piccolo diametro, con 10 microlitri di soluzione cellulare. Quindi, sotto guida ecografica, ha inserito delicatamente un catetere raffreddato calibro 22 attraverso la pelle e il muscolo della schiena, direttamente nella ghiandola surrenale sinistra per fornire un canale per l'iniezione cellulare. Rimuovere l'ago e lasciare il catetere in posizione.
La visualizzazione della ghiandola surrenale durante l'inserimento del catetere, insieme all'ago e alla sua traiettoria, è fondamentale per garantire lesioni minime alle strutture e agli organi circostanti e una minore morbilità murina. Quindi, guidare la siringa attraverso il catetere posizionato al centro della ghiandola surrenale. Poiché la siringa viene guidata attraverso il catetere, è importante mantenere la stabilità del catetere e osservare l'avanzamento dell'ago.
Si noti che l'ago stesso si estende per circa due millimetri oltre la terminazione del catetere, la sua posizione è facilmente visibile all'ecografia. Iniettare le cellule nel tessuto surrenale mirato. Lasciare l'ago in posizione per uno o due minuti per consentire alla matrice della membrana basale di solidificarsi.
Dopo che la matrice della membrana basale si è solidificata, rimuovere lentamente l'ago, seguito dalla rimozione del catetere. Infine, metti il topo in una gabbia di recupero fino a quando non riacquista sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale prima di tornare alla gabbia di casa. L'ecografia monitora la progressione tumorale in vivo.
Questa immagine mostra un'immagine ecografica della ghiandola surrenale, una settimana dopo l'iniezione. Qui, l'imaging a luminescenza di un topo iniettato con neuroblastoma una settimana dopo l'iniezione, mostra letture non indicative di attecchimento tumorale. Dopo due settimane, l'ecografia mostra l'attecchimento e la progressione del tumore in un'area di circa 40 millimetri quadrati.
La bioluminescenza a due settimane dopo l'iniezione ha mostrato una luminosità che misurava da 10 alla settima, il che è indicativo dell'assorbimento cellulare e della crescita tumorale correlati ai risultati degli ultrasuoni. L'ecografia otto settimane dopo l'iniezione ha mostrato una crescita continua del tumore con una misurazione dell'area superiore a 100 millimetri quadrati. Ancora una volta, la bioluminescenza ha confermato i risultati dell'ecografia con un aumento dei livelli di radianza da 10 a nove.
L'ecografia 3D del tumore ha mostrato un volume superiore a 100 millimetri cubi, la linea di base che il nostro laboratorio utilizza per l'avvio degli studi terapeutici preclinici. Tumore asportato di dimensioni superiori a un centimetro, correlato con misurazioni ecografiche e segnali di luminescenza. Questo terreno fornisce la dimostrazione di come stabilire con successo xenografie ortotopiche surrenaliche con cellule di neuroblastoma derivate da pazienti, utilizzando la guida ecografica.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di 12 minuti per iniezione se eseguita correttamente.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per l'iniezione guidata da ultrasuoni di cellule di neuroblastoma e sarcoma di Ewing in modelli murini. Questa tecnica mira a stabilire modelli oncologici preclinici affidabili che riflettano il microambiente tumorale nativo.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Oncoologia
- Ricerca preclinica
Sfondo
- Le cellule tumorali derivate dal paziente forniscono un modello più accurato per lo studio del cancro.
- Gli xenotrapi ortotopici sono essenziali per comprendere il comportamento del tumore in un contesto nativo.
- La guida ecografica permette un'iniezione precisa senza intervento chirurgico invasivo.
- Questo metodo può migliorare l'affidabilità degli studi preclinici.
Scopo dello studio
- Creare modelli di cancro biologicamente rilevanti per la ricerca.
- Studiare l'evoluzione tumorale e le risposte terapeutiche.
- Facilitare la scoperta di farmaci attraverso modelli preclinici migliorati.
Metodi Utilizzati
- Iniezione guidata da ultrasuoni di cellule di neuroblastoma.
- Iniezione nella ghiandola surrenale di topo.
- Utilizzo di cellule tumorali derivate da pazienti.
- Tecnica non invasiva per ridurre al minimo il tempo di recupero.
Risultati principali
- Stabilimento con successo di xenotrapianti ortotopici.
- Dimostrata efficienza e affidabilità del metodo.
- Forniti spunti sul comportamento del tumore in un microambiente nativo.
- Agevolati ulteriori studi sulle risposte terapeutiche e sulla metastasi.
Conclusioni
- Il metodo di iniezione guidata da ultrasuoni è efficace per la ricerca sul cancro.
- I modelli derivati dai pazienti migliorano la rilevanza degli studi preclinici.
- Questa tecnica può contribuire in modo significativo agli sforzi di scoperta di farmaci.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La creazione di xenotrapianti tumorali metastatici biologicamente rilevanti mediante impianto cellulare guidato da ultrasuoni e diretto al tessuto affronta una lacuna fondamentale nei modelli preclinici di oncologia, consentendo una riproduzione accurata dei microambienti tumorali e del comportamento metastatico. Questo approccio minimamente invasivo aumenta la fiducia predittiva negli studi di risposta terapeutica e di metastasi, sostenendo decisioni di portafoglio basate sulla valutazione del rischio nella scoperta di farmaci oncologici. La riproducibilità e l'allineamento traslazionale del metodo ne fanno un asset strategico per i percorsi di R&S aziendali volti a ridurre i rischi associati alle attività oncologiche nelle fasi iniziali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase della Scoperta e Validazione del Target
- Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche in un microambiente tumorale nativo.
- Consente la validazione funzionale del bersaglio modellando la diffusione metastatica e l'evoluzione del tumore.
- Migliora la fiducia predittiva nella selezione dei candidati e nel triage del portafoglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Facilita la preparazione di modelli di xenotrapianto ortotopici validati per test di efficacia successivi.
- Fornisce letture quantitative e riproducibili della crescita tumorale e delle metastasi mediante imaging ecografico e bioluminescenza.
- Permette l'allestimento scalabile e minimamente invasivo di modelli per la valutazione di composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea modelli preclinici alla biologia delle malattie umane utilizzando cellule derivate da pazienti e impianto in tessuti specifici.
- Permette una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica, consentendo la valutazione longitudinale della progressione tumorale e della risposta terapeutica.
- Riduce il rischio di traduzione clinica modellando comportamenti metastatici clinicamente rilevanti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo di xenotrapianto guidato da ultrasuoni si inserisce nel percorso di scoperta oncologica, dalla validazione precoce del bersaglio fino agli studi preclinici di efficacia, consentendo la generazione di modelli robusti per l'identificazione dei composti promettenti e la ricerca traslazionale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la riduzione del rischio meccanicistico modellando la crescita tumorale in contesti tissutali naturali.
- Screening: Fornisce modelli standardizzati e riproducibili con output di imaging quantitativi per lo screening di composti.
- Analisi: Fornisce misurazioni longitudinali della dimensione del tumore e della bioluminescenza per confrontare diverse condizioni terapeutiche.
- Ricerca traslazionale: Collega la fase di scoperta a quella preclinica consentendo sistemi di modelli derivati da pazienti e pertinenti alla malattia.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma adattabile a diversi tipi di cancro e fonti cellulari per un'ampia utilità nella ricerca e sviluppo.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nei modelli oncologici.
- Valore operativo: Standardizza e semplifica l'allestimento dei modelli con minima morbilità animale e rapido recupero.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale mediante un aumento della rilevanza del modello.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione e la progressione rischi-adjustata delle attività oncologiche sulla base di dati allineati alla traslazionalità.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'imaging ecografico e nelle tecniche chirurgiche su piccoli animali.
- Necessita dell'accesso a piattaforme di imaging, kit per la dissociazione cellulare e infrastrutture per l'analisi della bioluminescenza.
- Richiede una standardizzazione tra team diversi per garantire riproducibilità e confrontabilità dei dati.
- Adattabile a diversi tipi di cancro e a linee cellulari sia stabilite che derivate da pazienti.
- Limitato dalla necessità di formazione specializzata e di attrezzature per imaging necessarie per un impianto e un monitoraggio precisi.
