Name: Tutta Monte immunofluorescenza e quantificazione del follicolo delle ovaie coltivati del topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Scopri l'immunofluorescenza su organo intero e la quantificazione automatizzata dei follicoli in ovaie coltivate di topo. Questo metodo preserva l'architettura tridimensionale e semplifica gli studi di biologia riproduttiva.

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Ringraziamo Rebecca Williams e Johanna Dela Cruz da BRC di Cornell, l'Imaging e Andrew Recknagel per utili suggerimenti e assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato da istituti nazionali di sovvenzione di salute S10-OD018516 (per Imaging Facility cornelliano), T32HD057854 a j.c.b. e R01-GM45415 per J.C.S.

Cornell University istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) ha approvato tutti i metodi descritti qui, sotto protocollo 2004-0038 JCS.
1. preparazione di strumenti e mezzi di coltura
<ol><li>Pulire l'area di lavoro pulito con candeggina al 10% e lasciare che la candeggina rimanere sulla superficie della zona di lavoro per almeno 5 min. Dopo 5 minuti, rimuovere la candeggina in eccesso con carta pulita asciugamani e 70% di etanolo (EtOH). Pulire il microscopio per dissezione accuratamente con 70% EtOH. Nota: È importante che l'area di lavoro essere almeno semi-sterile per evitare la contaminazione delle colture d'organo.</li>
	<li>Avvolgere pulite pinze e le forbici con un tovagliolo di carta inumidito con 70% EtOH fino al momento dell'uso. Nota: Gli strumenti di dissezione ideale possono variare secondo l'età/dimensioni dell'ovaia. Risultati migliori si ottengono utilizzando un tagliente micro dissezione scissor, due pinze punta fine (sia la numero 5 o 55) e un micro dissezione Forbici iris.</li>
	<li>In un tubo conico, portare 50 mL di terreni di coltura dell'ovaia e riscaldare a bagnomaria a 37 ° C.<ol>
<li>Per rendere il terreno di coltura di ovaio4, supplemento 1 x dispositivo essenziale minimo (MEM) con 10% siero bovino fetale (FBS), 25 mM (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES), 100 unità/mL di penicillina, 100 µ g/mL di streptomicina, 0,25 µ g/mL Amfotericina B (ad es., 45 mL di MEM, 5 mL di calore inattivato FBS, 1,25 mL di HEPES e 0,5 mL di brodo di x 100 di penicillina, streptomicina e amfotericina B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare piatti e inserti prima la cultura dell'ovaia.<ol>
<li>In una cappa di coltura del tessuto, aggiungere 1 mL di terreno di coltura dell'ovaia ad una piastra di coltura del tessuto di 35 mm.</li>
		<li>Pre-immersione inserire membrana con terreno di coltura. Aggiungi media sufficiente, di solito circa 0,55 mL al bene, alla piastra di coltura del tessuto di vettore 24 pozzetti e posto una coltura cellulare inserire nel pozzo. Assicurarsi che la membrana dell'inserto non tocca il supporto.</li>
		<li>Preparare il numero di piastre di 35 mm e pozzetti con inserti di cultura cellulare secondo il numero previsto di ovaie nell'esperimento. Posizionare le piastre di 35 mm contenente 1 mL di terreno di coltura e della placca 24 pozzetti contenenti terreni di coltura e inserti in un 37 ° C e 5% CO2atmosferica incubatore di2 O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Organizzare un piatto caldo accanto all'ambito di dissezione e impostare la temperatura a 37 ° C. Mantenere a 37 ° C, 5% CO2 e l'incubatore di2 O atmosferica è vicino alla sala di dissezione.</li>
</ol>2. ovaia dissezione e coltura di organo
Nota: Le ovaie possono essere sezionate a temperatura ambiente, purché l'esposizione alla temperatura non ideale è minima.
<ol><li>Eutanasia i topi femminili postnatale giorno 5, per decapitazione, uno alla volta. Nota: L'eutanasia dovrà svolgersi secondo le linee guida IACUC presenti presso la struttura dove viene eseguita la ricerca.</li>
	<li>Spruzzare l'animale con 70% EtOH. Metti l'animale nella parte superiore il tovagliolo di carta asciutto sotto il microscopio di dissezione. Mettere un piatto di coltura del tessuto 35 mm contenenti terreni di coltura di ovaio vicino il microscopio di dissezione.</li>
	<li>Con pinze o forbici iris micro dissezione, fare un'incisione attraverso la pelle dell'animale e nella cavità addominale, prestando attenzione a non per tagliare negli intestini. Spingere gli intestini fuori della cavità addominale e individuare le ovaie. Estrarre le ovaie e metterli nella piastra di coltura del tessuto 35 mm contenenti terreni di coltura.</li>
	<li>Una volta che le ovaie sono state sezionate dall'animale, è possibile aumentare l'ingrandimento del microscopio dissezione al fine di visualizzare meglio le ovaie e qualsiasi tessuto allegata. Con pinze a punta fine di pulire, rimuovere tutto il tessuto non-ovarico, come bursa e tessuto adiposo. Prestare attenzione a mantenere le ovaie intatte quando si rimuove il tessuto ovarico-non associato.</li>
	<li>Una volta che le ovaie sono isolate, inserire la coppia gli inserti di cultura delle cellule pre-impregnati della placca 24 pozzetti (fare riferimento ai passaggi 1.4.2 e 1.4.3) e regolare il volume del mezzo per assicurare che è sufficiente mantenere l'organo umido (senza completamente sommergendola). Attenzione: Fare attenzione a non fare un buco nella membrana dell'inserto cultura cellulare quando si trasferiscono le ovaie.</li>
	<li>Posto espiantati organi in un 37 ° C e 5% CO2atmosferica incubatore di O2 .</li>
	<li>Ripetere i passaggi da inserire 2.1-2.6 fino a quando le ovaie di ciascun animale sono sezionate e posto sulla coltura delle cellule della piastra 24 pozzetti contenenti il terreno di coltura dell'ovaia.</li>
	<li>Modifica il terreno di coltura dell'ovaia ogni 2 giorni, usando riscaldato aliquote media dell'ovaia da bagnomaria a 37 ° C e procedere alla parte 3 del protocollo nel punto desiderato tempo sperimentale.</li>
</ol>3. fissazione del tessuto
<ol><li>In una provetta conica da 15 mL, preparare la paraformaldeide al 4% (PFA) in tampone fosfato salino (PBS): 1x (ad esempio, aggiungere 2 mL di grado di microscopia elettronica PFA 16% a 6 mL di PBS 1X). Attenzione: PFA è una sostanza pericolosa e deve essere gestito sotto una cappa chimica.</li>
	<li>Difficoltà le ovaie coltivate, senza rimuovere il tessuto dall'inserto di cultura, coprendo il tessuto con la soluzione preparata di PFA 4%. Sigillare i bordi della piastra con adesivo di plastica (per evitare l'evaporazione) e posto i campioni a 4 ° C durante la notte. Nota: Al fine di facilitare la manipolazione e l'integrità del tessuto, evitare spostando le ovaie dall'inserto di cultura cellulare durante tutta la procedura. Coltivate ovaie attaccate alla superficie dell'inserto sono vantaggiose per la movimentazione senza danneggiare o perdere l'organo.</li>
	<li>Sciacquare il tessuto 3 x con 70% EtOH e o procedere con il passo 4.1 o negozio in scintillazione fiale riempita con 70% EtOH a 4 ° C fino a ulteriore elaborazione. Nota: Se usando il tessuto in modo endogeno che esprimono le proteine fluorescenti, conservare i campioni con 70% EtOH può ridurre notevolmente il segnale. In alternativa, tessuto può essere risciacquato e conservato in PBS con 0,2% di sodio azide (NaN3). NaN3 , tuttavia, è altamente tossico e rappresenta un pericolo di inalazione seria. Rendere la soluzione di riserva nella cappa fumi e gestire indossando appropriati indumenti personali come un cappotto e nitrile guanti di laboratorio.</li>
</ol>4. l'intero Monte immunofluorescenza
<ol><li>Posizionare il tessuto fisso in 1X PBS a RT per un minimo di 4 h prima del passaggio di permeabilizzazione 4.3.</li>
	<li>Preparazione della soluzione di permeabilizzazione e soluzione bloccante.<ol>
<li>Preparare la soluzione di permeabilizzazione come descritto. Di PBS 1X, aggiungere 0,2% di alcol polivinilico (PVA), soluzione di 0,1% sodio boroidruro (NaBH4) (da 12 wt.% in soluzione di idrossido di sodio (NaOH) 14 M) e 1,5% glicole polietilenico tert -octylphenyl etere (detergente tensioattivo non ionico). In una provetta conica da 50 mL, aggiungere 5 mL di PBS: 10x, 0,1 g di PVA, 50 µ l di NaBH4e 750 µ l di detergente tensioattivo non ionico, quindi aggiungere ultrapura fino a 50 mL di acqua e agitare bene a temperatura ambiente fino a quando il composto è completamente in soluzione.</li>
		<li>Preparare soluzione bloccante come descritto. Per PBS 1X, aggiungere 0,1% tensioattivi non ionici detergente, 0,15% di 2,5 M glicina, pH 7.4, siero di capra normale 10%, 3% albumina di siero bovino (BSA), 0,2% NaN3, 100 unità/mL di penicillina, 100 µ g/mL di streptomicina e 0,25 µ g/mL di amfotericina B. preparare una soluzione stock di 2.5 M glicina sciogliendo 93,8 g di glicina in acqua ultrapura ad un volume finale di 500 mL (pH 7,4) e una soluzione di riserva del 10% NaN3 sciogliendo 5 g in 50 mL di acqua distillata; quindi, in una provetta conica da 50 mL preparare la soluzione di blocco aggiungendo 5 mL di PBS 1x 10, 50 µ l di detergente tensioattivo non ionico, 750 µ l di soluzione madre di glicina, 5 mL di siero di capra, 1,5 g di BSA, 1 mL di soluzione madre di NaN3 e 0,5 mL di brodo di x 100 di penicillina, streptomicina e amfotericina B. Aggiungere acqua distillata fino ad un volume finale di 50 mL e siringa filtro la soluzione finale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimuovere e scartare il PBS 1X dal flaconcino e quindi aggiungere sufficiente soluzione di permeabilizzazione per immergere completamente le ovaie. Il campione viene posto in soluzione di permeabilizzazione su agitatore orbitale (ad esempio, nutator) a temperatura ambiente per 4 h. Nota: Il tempo di incubazione può variare in funzione dello spessore dell'organo.</li>
	<li>Sostituire la soluzione di permeabilizzazione con sufficiente soluzione bloccante per sommergere completamente le ovaie. Sigillare il flaconcino con l'adesivo di plastica e lasciare il tessuto in incubazione per un minimo di 12 ore a temperatura ambiente su agitatore orbitale.</li>
	<li>Preparare la diluizione di anticorpo primario in soluzione bloccante secondo il datasheet del costruttore. Nota: Si noti che non tutti gli anticorpi sono compatibili con l'agente di compensazione. Il volume medio necessario per campione è circa 750 µ l.<ol>
<li>Per la quantificazione degli ovociti, utilizzare TAp63 (marcatore nucleare dell'ovocita) e MVH (marcatore citoplasmatica delle cellule di germe). Nota: Gli anticorpi utilizzati nelle immagini di immunofluorescenza sono mouse anti-p63 e coniglio anti-MVH). La soluzione di anticorpo primario può essere riutilizzato 2 volte o più se conservato a 4 ° C tra protocolli di colorazione e gestito correttamente per evitare la crescita batterica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Collocare l'inserto contenente il tessuto in una piastra a 24 pozzetti e aggiungere circa 750 µ l di soluzione di anticorpo primario. Garantire che le ovaie sono completamente sommerse. Sigillare la piastra con adesivo di plastica per minimizzare evaporazione e lasciare il tessuto incubando per 4 giorni a temperatura ambiente su agitatore orbitale.</li>
	<li>Preparare la soluzione di lavaggio.<ol>
<li>Preparare la soluzione di lavaggio come descritto. Fare 1X PBS, aggiungere 0,2% PVA e 0,15% detergente tensioattivo non ionico. In una provetta conica da 50 mL, aggiungere 5 mL di PBS: 10x, 0,1 g di PVA, 75 µ l di detergente tensioattivo non ionico e acqua ultrapura fino ad un volume finale di 50 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimuovere la diluizione di anticorpo primario e aggiungere una generosa quantità di soluzione di lavaggio. Assicurarsi sempre di immergere le ovaie. Consentire le ovaie in ammollo nella soluzione durante la notte a temperatura ambiente su agitatore orbitale.</li>
	<li>Sostituire la soluzione di lavaggio e incubare su agitatore orbitale per 2 ore o più.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 4.9 una ulteriore tempo.</li>
	<li>Preparare la diluizione di anticorpo secondario nella soluzione di blocco. Nota: Gli anticorpi secondari utilizzati sono anti-topo 488 tintura fluorescente generato in capra e anti-coniglio 594 tintura fluorescente generato in capra. Vedere il punto 4.5. il volume medio necessario per campione.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di lavaggio dalle ovaie e aggiungere la soluzione di anticorpo secondario. Proteggere i campioni dalla luce (piastra di avvolgere con carta stagnola) e sigillare la piastra con adesivo di plastica per minimizzare evaporazione. Incubare i campioni su agitatore orbitale a temperatura ambiente per 2 giorni. Nota: Continuare a proteggere i campioni dalla luce utilizzando il foglio di alluminio durante tutte le fasi di incubazione successiva.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di anticorpo secondario dai campioni e aggiungere la soluzione di lavaggio. Incubare su agitatore orbitale per 8 h. Nota: Se si desidera la macchiatura 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI), aggiungere 50 ng/mL di DAPI per la prima fase di lavaggio (~ 8 ore di incubazione).</li>
	<li>Sostituire la soluzione di lavaggio per un lavaggio durante la notte.</li>
	<li>Mentre si prepara la soluzione di schiarimento (Vedi sezione 5), sostituire il pernottamento con fresca la soluzione di lavaggio e mantenere i campioni su agitatore orbitale a temperatura ambiente.</li>
</ol>5. ovaia di compensazione e di Imaging
<ol><li>Preparare ScaleS(0) soluzione di compensazione.<ol>
<li>Preparare ScaleS(0) compensazione soluzione10 aggiungendo reagenti nella proporzione specificata: 40% D-(-) sorbitolo (w/v), 10% glicerolo, urea 4,3 M e 20% di dimetilsolfossido (DMSO), pH 8.1 (ad es. in una provetta conica da 50 mL, aggiungere 2,5 mL di glicerolo, 10 g di sorbitolo , 5 mL di DMSO e 12 mL di urea 9 M per un volume totale di 25 mL. Mescolare la soluzione di inversione a 50 ° C per 30 min e degassare prima dell'uso).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di lavaggio e immergere i campioni in soluzione di compensazione. Per ottenere risultati migliori mantenere campioni su agitatore orbitale.</li>
	<li>Sostituire la soluzione di schiarimento 2 volte al giorno fino a quando il tessuto diventa trasparente (circa 2 giorni).</li>
	<li>Una volta che il tessuto è deselezionato, preparare il campione per l'imaging rimuovendo con cura la membrana inserto contenente le ovaie coltivate con una multa punta di bisturi e posizionando il campione su un vetrino.</li>
	<li>Procedere per i campioni su un microscopio in grado di sezionamento ottico di imaging.</li>
</ol>6. ovocita quantificazione
Nota: Ci sono molti programmi di diversi computer che sono in grado di quantificare le cellule. Descritto di seguito è un protocollo per la quantificazione degli ovociti utilizzando il pacchetto di elaborazione di immagine non-commerciale, FIJI-ImageJ14.
<ol><li>Utilizzando una proiezione bidimensionale intensità massima della serie immagine dello stack Z -per i marcatori cellulari specifici di interesse (senza il canale DAPI), convertire l'immagine in un'immagine di 8 bit bianca e nero sotto tipo in discesa l'immagine dal menu.</li>
	<li>Sotto il menu a discesa immagine , selezionare la scheda di regolazione e quindi selezionare soglia.</li>
	<li>Regolare manualmente la soglia ad un livello che meglio identifica ogni ovocita individuo. Una volta determinato il livello, fare clic su applica per generare un'immagine in bianco e nero. Una volta completato, è possibile quantificare il campione delineating usando l'icona ovale o Freehand . Nota: Figi-ImageJ ha diverse opzioni per ottimizzare l'immagine che verrà utilizzata per la quantificazione delle particelle. Per esempio, nel processo di | Binario scheda, ci sono diverse opzioni che possono essere utilizzati per migliorare la rilevazione di ciò che sarà conteggiato. In Figura 4, le opzioni utilizzate per meglio individuare follicoli era Erode, seguita da riempire i buchie infine spartiacque.</li>
	<li>Selezionare dal menu a discesa analizza , analizza le particelle. Impostare i parametri secondo la risoluzione desiderata.</li>
</ol>

<ol><li>O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Revised+Protocol+for+In+Vitro+Development+of+Mouse+Oocytes+from+Primordial+Follicles+Dramatically+Improves+Their+Developmental+Competence%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">A Revised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves Their Developmental Competence.</a> Biology of Reproduction. 68 (5), 1682-1686 (2003).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Lo studio della riproduzione dei mammiferi richiede utilizzando e quantificare le cellule specializzate che non sono ordinariamente favorevoli alla coltura delle cellule. Tuttavia, sistemi di coltura ex vivo sono efficaci a mantenere dell'ovaia e del follicolo vitalità1,15. Durante la coltura di ovaio, il tessuto richiede una maggiore superficie per lo scambio di sostanze nutritive tramite diffusione. Di conseguenza, 5 - giorno vecchio mouse ovaie sono i...

Al fine di studiare la composizione cellulare e caratteristiche morfologiche delle ovaie dei mammiferi, gli scienziati spesso si affidano in vivo esperimenti seguiti dalla macchiatura immunohistological delle ovaie di paraffina. Più recentemente comunque, coltura di organo intero ovaio ha dimostrato di essere un'alternativa efficace per studiare la funzione ovarica1,2,3,4 perché la tecnica può essere accoppiata con migliore visualizzazione e strumenti di quantificazione. Tradizionalmente, analisi della morfologia ovarica dipende dalla ricostruzione tridimensionale ovarico architettura dalla paraffina sezioni di serie, ma, oltre ad essere laboriosa e richiede tempo, sezionamento in serie del tessuto paraffina non garanzia di ricostruzione adeguata dell'organo, e sezioni sono spesso persi o mis-ordinati nel processo.
Oltre le sfide tecniche associate di sezionamento seriale, ci sono inoltre variazioni nei metodi abitualmente utilizzati per quantificare numeri follicolo per ovaia5,6. La variabilità metodologica attualmente utilizzata altera la meta-analisi della riserva ovarica attraverso studi5,7. Ad esempio, numeri di follicolo da articoli di ricerca diversi possono variare da 10 volte o più tra simili età inerente allo sviluppo all'interno di un ceppo specifico6. Queste grandi differenze nella quantificazione riferito follicolo possono portare a confusione e hanno ostacolato i confronti Croce-Studio. Sperimentalmente, gli approcci tradizionali alla quantificazione del follicolo da sezioni di serie vengono eseguiti da follicoli di un numero predeterminato di sezioni di conteggio (ad esempio, ogni quinto, decimo, o altra sezione). Variabilità nei conteggi di follicolo utilizzando questo approccio deriva non solo dalla periodicità in quali sezioni sono contati, ma anche da variazioni di spessore della sezione e l'esperienza tecnica nella generazione di sezioni di serie5,6. Oltre alla sua variabilità, un altro svantaggio del taglio di tessuto tradizionale è che il sezionamento delle ovaie piccole dagli animali giovani è particolarmente difficile e dipende molto dal tessuto orientamento8.
Il protocollo sottostante descrive un ovaio ordinariamente usato cultura tecnica1 ma migliora notevolmente sulla quantificazione del follicolo tradizionale sostituendo sezionamento fisico con il tessuto di compensazione e sezionamento ottico mediante microscopia confocale8 ,9. Pulizia con immersione del tessuto (senza la necessità di transcranial aspersione o elettroforesi) in un - e sorbitolo-a base di urea soluzione (ad es., ScaleS(0)10) si è rivelato compatibile con immunostaining e ammessi per la riduzione del tempo di compensazione senza compromettere la profondità dell'imaging. Altri metodi segnalati (ad es., ScaleA28,10, SeeDB11, clean12e ClearT212) sono più tempo che consumano o non consentono approfondita risoluzione ottica del campione. Sezionamento ottico è vantaggioso perché è meno laborioso e mantiene l'architettura tridimensionale7,8 dell'organo. Un altro vantaggio di questo approccio è che la preparazione dei campioni non richiede costosi reagenti per cancellare il tessuto e può essere condotta con relativa facilità.
In particolare, il protocollo descritto è stato ottimizzato per le ovaie coltivati del topo al quinto giorno postnatale ma è stato condotto su ovaie che vanno dal giorno postnatale 0 - 10. Il metodo si avvale di un sistema di cultura dell'ovaia in cui il tessuto naturalmente si attacca alla membrana su cui è coltivato, facilitando l'utilizzo dell'organo e manipolazione. Il sistema di cultura descritto può essere utilizzato per mantenere explanted ovaie per fino a 10 giorni e di valutare come le diverse condizioni sperimentali possono interferire con ovocita sopravvivenza13. La procedura di quantificazione descritta viene eseguita utilizzando il pacchetto FIJI-ImageJ14 di elaborazione delle immagini non commerciali e può essere condotta sulla maggior parte dei personal computer. Inoltre, immagini utilizzate per la quantificazione possono essere reso ampiamente disponibile per la comunità scientifica, consentendo in tal modo futura meta-analisi.

<table><tbody><tr><td>Forbice per micro dissezione 4,5", punte dritte e affilate</td><td>Roboz</td><td>RS-5912</td><td>Forbice per micro dissezione</td></tr><tr><td>Pinze stile gioielliere 4-3/8", stile 5</td><td>Integra Miltex</td><td>17-305X</td><td>Pinze a punta fine</td></tr><tr><td>Micro Forbici per iride 4", punte dritte e affilate</td><td>Integra Miltex</td><td>18-1618</td><td>Forbice per micro dissezione a iride o forbice a molla per micro dissezione</td></tr><tr><td>1X Minimal Terreni essenziali (MEM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11090-081</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale</td><td>bovino Corning</td><td>35011CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>antibiotico-antimicotico (100X)</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td>utilizzato nel passaggio 1.3.1</td></tr><tr><td>Piatto trattato con coltura tissutale da 35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&commercio; Piastra portante a 24 pozzetti per inserti per colture cellulari</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>141006</td><td>Dimensione dei pori: 8&mu; m</td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>15710</td><td>soluzione al 16%</td></tr><tr><td>1X soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Nutator mixer GyroTwister&trade;</td><td>Agitatore tridimensionale</td> <td>Labnet</td><td>S1000-A-B</td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>VWR</td><td>103219-578</td><td></td></tr><tr><td>Albume sierico bovino (BSA)</td><td>VWR</td><td>97061-416</td><td></td></tr><tr><td>Aziduro di sodio (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di boroidruro di sodio (NaBH4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452904-25ML</td><td>Utilizzare la soluzione, piuttosto che il compresse o in polvere&nbsp;</td></tr><tr><td>Alcool polivinilico (PVA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136-250G</td><td>Triton solubile a freddo</td></tr><tr><td>in acqua&commercio; X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443-100ML</td><td>polietilenglicole terz-ottilfeniletere</td></tr><tr><td>Filtri per siringhe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>725-2520</td> Siringhe <td>da 25 mm</td></tr><tr><td>10 ml BD</td><td></td><td>309695</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-p63 per topo (4A4)</td><td>Biocare Medical</td><td>CM 163A</td><td>Diluizione 1:500</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-MVH di coniglio</td><td>Abcam</td><td>ab13840</td><td>Diluizione 1:600</td></tr><tr><td>Alexa Fluor® capra anti-topo 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11032</td><td>Diluizione 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor® capra anti-coniglio 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11034</td><td>Diluizione 1:1000</td></tr><tr><td>4,6-Diamidino-2-fenilindolo (DAPI)&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>D-(-)sorbitolo&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240850-100G</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-5X10ML</td><td></td></tr><tr><td>FIJI-ImageJ</td><td></td><td></td><td>Software di elaborazione delle immagini</td></tr><tr><td>Pipette monouso per il trasferimento di immagini in plastica</td><td>VWR</td><td>414044-034</td><td></td></tr></tbody></table>

tutta monte immunofluorescenza e quantificazione del follicolo delle ovaie coltivati del topo

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Ricerca nel campo della biologia riproduttiva nei mammiferi spesso coinvolge valutare la salute generale delle ovaie e testicoli. In particolare, nelle femmine, fitness ovarico è spesso valutata da visualizzare e quantificare i follicoli e gli ovociti. Perché l'ovaio è un tessuto tridimensionale opaco, gli approcci tradizionali richiedono faticosamente affettare il tessuto in numerose sezioni di serie al fine di visualizzare le cellule in tutto l'intero organo. Inoltre, poiché la quantificazione di questo metodo implica, generalmente, segnando solo un sottoinsieme delle sezioni separate dal diametro approssimativo di un ovocita, è incline ad inesattezza. Qui, un protocollo è descritto che invece utilizza organo intero tessuto compensazione e colorazione di immunofluorescenza delle ovaie del mouse per visualizzare i follicoli e gli ovociti. Rispetto ad approcci più tradizionali, questo protocollo è vantaggioso per la visualizzazione di celle all'interno dell'ovaio per numerose ragioni: 1) l'ovaio rimane intatto in tutta la preparazione del campione e trattamento; 2) piccole ovaie, che sono difficili da sezione, possono essere esaminate con facilità; 3) cellulare quantificazione avviene più facilmente e con precisione; e 4) l'intero organo imaged.

Questo protocollo comprende 6 fasi principali dopo la dissezione delle ovaie, come indicato nella Figura 1. Figura 2 , Figura 3 , Figura 4 evidenziare le caratteristiche più innovative del presente protocollo, che includono l'ottimizzazione del tessuto di compensazione per le ovaie e la quantificazione di ovocita inte...

Qui, presentiamo un protocollo per quantificare i follicoli nelle ovaie colte di giovani topi senza sezionamento seriale. Mediante immunofluorescenza di intero organo e tessuto di compensazione, sezionamento fisico viene sostituito con sezionamento ottico. Questo metodo di preparazione del campione e visualizzazione mantiene l'integrità dell'organo e facilita la quantificazione automatizzata di cellule specifiche.

Tutta Monte immunofluorescenza e quantificazione del follicolo delle ovaie coltivati del topo

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere immagini di ovaie intere in coltura compatibili con la quantificazione automatica dei follicoli. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia riproduttiva, come ad esempio come diverse condizioni interferiscono con la fitness ovarica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è meno laboriosa e mantiene l'architettura tridimensionale dell'organo.Sebbene questo metodo sia stato ottimizzato per le ovaie di topo in coltura al quinto giorno postnatale, può essere applicato anche ad altre età e tessuti come le gonadi embrionali o i testicoli di topi giovani. Inizia con una superficie di lavoro pulita. Strofinare con candeggina al dieci percento e lasciare che la candeggina rimanga sulla superficie dell'area di lavoro per almeno cinque minuti.Dopo cinque minuti, rimuovere la candeggina in eccesso con carta assorbente pulita ed etanolo al 70%. Pulire accuratamente il microscopio da dissezione con etanolo al 70% e posizionare un tovagliolo di carta asciutto sul tavolino. Avvolgere pinze e forbici pulite con un tovagliolo di carta inumidito con etanolo al 70%.Quindi preparare 50 millilitri di terre

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Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Questo protocollo descrive la coltura primaria / co-coltura di topo tessuto ovarico, con ovaie di topi neonati e singoli follicoli ovarici di topi prepuberi. Le tecniche di coltura supportano sviluppo in modo altamente fisiologico, consentendo studio dell'effetto di agenti estrinseci sulla ovaio, e di interazioni tra follicoli ovarici.

Cultura e co-coltura di mouse ovaie e follicoli ovarici

Colture del tessuto ovarici possono essere utilizzati come modelli di atresia di sviluppo, l'ovulazione e follicolo pilifero e indicare i meccanismi regolatori dei processi dinamici ovarici.

Coltura del tessuto ovarico per visualizzare fenomeni nell'ovaia di Mouse

Qui descriviamo, confrontiamo e confrontiamo due diverse tecniche per un accurato conteggio follicolo dei tessuti ovarico del topo fissi.

Enumerazione accurata del follicolo nelle ovaie di topo adulto

Qui, presentiamo un protocollo ottimizzato per l'imaging di intere ovaie per analisi quantitative e qualitative utilizzando immunocolorazione a montaggio intero, microscopia multifotonica e visualizzazione e analisi 3D. Questo protocollo supporta un'elaborazione ad alto rendimento, affidabile e ripetibile applicabile per tossicologia, diagnostica clinica e saggi genomici della funzione ovarica.

Immunofluorescenza dell'ovaio intero, clearing e microscopia multifotonica per l'analisi quantitativa 3D della riserva ovarica in via di sviluppo nel topo

Il protocollo qui descritto descrive in dettaglio l'induzione di un programma emogenico nei fibroblasti embrionali di topo attraverso la sovraespressione di un insieme minimo di fattori di trascrizione. Questa tecnologia può essere tradotta nel sistema umano per fornire piattaforme per studi futuri sull'emopoiesi, la malattia ematologica e il trapianto di cellule staminali ematopoietiche.

Riprogrammazione fibroblasti embrionali di topo con fattori di trascrizione per indurre un programma Hemogenic

Vi presentiamo un metodo per l'isolamento e la cultura del dotto di Wolff mouse (WD). Abbiamo anche dimostrare una procedura dettagliata per tutto il monte immunocolorazione di coltura / WD appena isolate con anticorpi con tag fluorescenza. Insieme, queste tecniche consentono lo studio dello sviluppo WD, spiralatura, e differenziazione.

Organo cultura e monte intero immunofluorescenza colorazione di mouse di Wolff Condotti

Sviluppo di ciglia è vitale per l'organogenesi corretto. Questo protocollo descrive un metodo ottimizzato per etichettare e visualizzare le cellule ciliate di zebrafish.

Visualizzazione di cellule Multiciliated in Zebrafish attraverso un protocollo combinato di tutta Monte fluorescente ibridazione In Situ e immunofluorescenza

In questo protocollo, abbiamo descritte le tecniche per la corretta dissezione di Arabidopsis fiori e silique, alcune tecniche di base di schiarimento e selezionato le procedure per intero-monta le osservazioni delle strutture riproduttive di colorazione.

Intero-monta schiarimento e colorazione delle silique e organi del fiore di Arabidopsis

Qui, descriviamo un protocollo per immunofluorescenza intero supporto e basate su immagine quantitativa analisi volumetrica degli embrioni del mouse in fase precoce. Presentiamo questa tecnica come un potente approccio qualitativamente e quantitativamente valutare strutture cardiache durante lo sviluppo e proponiamo che possa essere ampiamente adattabile ad altri sistemi dell'organo.

Analisi quantitativa intero-monta immunofluorescenza delle popolazioni di cellule progenitrici cardiache in embrioni di topo

L'ovaio di Drosophila è un sistema eccellente modello per studiare lo sviluppo di nicchia delle cellule staminali. Anche se i metodi per la dissezione ovaie larvale e adulte sono stati pubblicati, le dissezioni pupal ovaia richiedono tecniche differenti che non sono stati pubblicati in dettaglio. Qui descriviamo un protocollo per la dissezione, colorazione e montaggio pupale ovaie.

Dissezione e colorazione delle ovaie Pupal Drosophila

Scopri l'immunofluorescenza su organo intero e la quantificazione automatizzata dei follicoli in ovaie coltivate di topo. Questo metodo preserva l'architettura tridimensionale e semplifica gli studi di biologia riproduttiva.

Tutta Monte immunofluorescenza e quantificazione del follicolo delle ovaie coltivati del topo

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