Tutta Monte immunofluorescenza e quantificazione del follicolo delle ovaie coltivati del topo

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere immagini di ovaie intere in coltura compatibili con la quantificazione automatica dei follicoli. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia riproduttiva, come ad esempio come diverse condizioni interferiscono con la fitness ovarica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è meno laboriosa e mantiene l'architettura tridimensionale dell'organo.

Sebbene questo metodo sia stato ottimizzato per le ovaie di topo in coltura al quinto giorno postnatale, può essere applicato anche ad altre età e tessuti come le gonadi embrionali o i testicoli di topi giovani. Inizia con una superficie di lavoro pulita. Strofinare con candeggina al dieci percento e lasciare che la candeggina rimanga sulla superficie dell'area di lavoro per almeno cinque minuti.

Dopo cinque minuti, rimuovere la candeggina in eccesso con carta assorbente pulita ed etanolo al 70%. Pulire accuratamente il microscopio da dissezione con etanolo al 70% e posizionare un tovagliolo di carta asciutto sul tavolino. Avvolgere pinze e forbici pulite con un tovagliolo di carta inumidito con etanolo al 70%.

Quindi preparare 50 millilitri di terreno di coltura ovarica in una provetta conica e scaldare in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Dopo che il terreno si è riscaldato, preparare le piastre e gli inserti aggiungendo prima un millilitro di terreno di coltura ovarica a piastre di coltura tissutale da 35 millimetri. Quindi aggiungere circa 0,55 millilitri di terreno ai pozzetti di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti e posizionare un inserto in ciascun pozzetto contenente terreno.

Assicurarsi che le membrane tocchino il fluido. Posizionare le piastre da 35 millimetri e la piastra di supporto da 24 pozzetti in un incubatore a 37 gradi Celsius, al cinque percento di anidride carbonica e ossigeno atmosferico. Quindi posizionare una piastra calda accanto al cannocchiale di dissezione e impostare la temperatura a 37 gradi Celsius.

Se l'incubatore per coltura tissutale non si trova vicino all'area di dissezione, posizionare sulla piastra riscaldante una delle piastre per coltura tissutale da 35 millimetri contenenti terreni di coltura ovarica. Quindi iniziare la dissezione spruzzando la femmina appena soppressa con etanolo al 70% e posizionarla sopra il tovagliolo di carta asciutto sotto il microscopio di dissezione. Dopo aver praticato un'incisione nella cavità addominale, estrudere l'intestino e individuare le ovaie.

Estrarre le ovaie e metterle nel terreno di coltura nel piatto da 35 millimetri. Una volta sezionate le ovaie, aumentare l'ingrandimento del microscopio di dissezione per visualizzare meglio le ovaie e l'eventuale tessuto attaccato. Con una pinza a punta fine pulita, rimuovere tutto il tessuto non ovarico come la borsa e il tessuto adiposo senza danneggiare le ovaie.

Quindi, posizionare ogni paio di ovaie su un inserto di coltura cellulare pre-imbevuto e regolare il volume del terreno per assicurarsi che sia sufficiente a mantenere umido l'organo senza immergerlo completamente. Posizionare gli organi espiantati in un incubatore a 37 gradi Celsius, al cinque percento di anidride carbonica e ossigeno atmosferico. Al momento sperimentale desiderato, rimuovere il terreno di coltura ovarica dalla piastra e fissare le ovaie coltivate sull'inserto coprendo il tessuto con una soluzione di PFA al quattro percento appena preparata.

Sigillare i bordi della piastra con una pellicola di paraffina per evitare l'evaporazione e posizionare i campioni a quattro gradi Celsius durante la notte. Sciacquare il fazzoletto tre volte con etanolo al 70%. Quindi conservare in fiale di scintillazione riempite con etanolo al 70% a quattro gradi Celsius fino a ulteriore lavorazione.

Iniziare la colorazione rimuovendo l'etanolo al 70% dalle fiale e lavando il tessuto fissato con PBS a temperatura ambiente agitando per un minimo di quattro ore. Dopo aver rimosso il PBS, aggiungere una soluzione di permeabilizzazione sufficiente per immergere completamente le ovaie. Porre su un agitatore orbitale e incubare a temperatura ambiente per quattro ore.

Sostituire la soluzione di permeabilizzazione con una soluzione bloccante sufficiente a sommergere completamente le ovaie. Quindi incubare i flaconcini sigillati a temperatura ambiente per un minimo di 12 ore su un agitatore orbitale. Dopo il blocco, posizionare gli inserti in una piastra a 24 pozzetti e aggiungere circa 750 microlitri di soluzione di anticorpi primari assicurandosi che le ovaie siano completamente sommerse.

Quindi posizionare la piastra sigillata sull'agitatore orbitale e incubare per quattro giorni a temperatura ambiente. Dopo quattro giorni, rimuovere l'anticorpo primario e aggiungere una generosa quantità di soluzione di lavaggio. Lavare le ovaie durante la notte.

Il giorno successivo, sostituire con una soluzione di lavaggio fresca e incubare sull'agitatore orbitale per due ore o più. Dopo i lavaggi, aggiungere la soluzione di anticorpi secondari. Proteggere i campioni dalla luce e incubare su un agitatore orbitale a temperatura ambiente per due giorni.

Dopo due giorni, rimuovere la soluzione di anticorpi secondari dai campioni e aggiungere la soluzione di lavaggio. Iniziare preparando la soluzione di compensazione ScaleS0. Mescolare la soluzione per inversione e incubare a 50 gradi Celsius per 30 minuti.

Degassare la soluzione di pulizia ScaleS0. Quindi rimuovere la soluzione di lavaggio dalle ovaie immunocolorate. Aggiungere la soluzione di compensazione.

Coprire la piastra con un foglio di alluminio e rimetterla nell'agitatore orbitale. È estremamente importante essere pazienti durante le fasi di colorazione e pulizia. Una volta che il tessuto è diventato trasparente, utilizzare un bisturi a punta sottile per rimuovere con cura le membrane dell'inserto contenenti le ovaie in coltura.

Posizionare il campione su un vetrino e coprire delicatamente il campione con un vetrino coprioggetti. Quindi procedere all'imaging dei campioni su un microscopio in grado di sezionare otticamente. Questa immagine mostra un'ovaia postnatale del quinto giorno che non è stata liberata.

Qui, l'ovaio viene mostrato un'ora dopo l'aggiunta della soluzione schiarente. L'ovaio inizierà a diventare traslucido entro pochi minuti dall'immersione in una soluzione di chiarezza. È possibile il sezionamento ottico delle ovaie in coltura senza clearing, ma le cellule profonde all'interno del tessuto hanno un segnale difficile da differenziare dal fondo, che impedisce la corretta quantificazione degli ovociti.

Al contrario, questa immagine rappresentativa mostra un campione autorizzato in cui è possibile la quantificazione degli ovociti in tutto l'organo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che gli anticorpi devono diffondersi attraverso il tessuto; Pertanto, i tessuti più spessi richiederanno un tempo di incubazione più lungo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come coltivare, colorare e immaginare intere ovaie.

Il testo descrive l'uso di un software gratuito, Fiji ImageJ, che può essere utilizzato per una semplice quantificazione dei follicoli. Non dimenticare che lavorare con paraformaldeide e azoturo di sodio può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario adottare sempre precauzioni come l'uso di cappe chimiche e dispositivi di protezione individuale.