Name: Una piattaforma di Microfluidic ad altissima velocità di trasmissione per il sequenziamento del genoma di cella singola (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Scopri un metodo microfluidico ad alto throughput per il sequenziamento del genoma di cella singola. Questa tecnica consente di analizzare decine di migliaia di cellule preservando l'eterogeneità genomica.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation attraverso un premio alla carriera (concessione numero DBI-1253293); il National Institutes of Health (NIH) (grant numeri HG007233-01, R01-EB019453-01, 1R21HG007233, DP2-AR068129-01, R01-HG008978); e la Defense Advanced Research Progetti Agenzia Living fonderie Program (numeri di contratto HR0011-12-C-0065, N66001-12-C-4211, HR0011-12-C-0066).

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Brevetti relativi a questo flusso di lavoro possono essere concessi in licenza a Bio di missione, di cui Adam R. Abate è azionista.

Il flusso di lavoro di microfluidica SiC-seq produce dati di sequenziamento del genoma di cella singola da migliaia di cellule batteriche. Codici a barre digitale calettati sui genomi di cellule incapsulate microgel consentono la deconvoluzione in silico di dati NGS in gruppi di codice a barre letture provenienti dalla stessa cellula. Un esperimento di controllo con una comunità microbica di composizione nota è necessario per valutare la purezza dei gruppi di codice a barre. Una grande frazione di gruppi di basso-purezza indica che il tasso di incapsulamento delle cellule è troppo alto o che ci sia contaminazione gocciolina significativi che si verificano durante le fasi di lavorazione di microfluidica. Secondo le statistiche di Poisson, i codici a barre e le cellule dovrebbero essere incapsulate in un rapporto di destinazione della 1 particella per ogni 10 gocce limitare la frequenza di più eventi di incapsulamento a meno di 5% di tutte le goccioline non vuoto. Un tasso di incapsulamento più elevato aumenta i tassi di doppietti in modo esponenziale, quindi la verifica del rapporto dell'incapsulamento durante il processo di dropmaking è di importanza critica. Gli utenti dovrebbero essere particolarmente prudenti di incapsulamento di più celle in una singola microgel perché letture da cellule diverse, condividendo la stessa sequenza di codici a barre non possono essere bioinformatically separati. Nel caso che la 1 cella riceve 2 diversi codici a barre, la purezza del gruppo di codice a barre è inalterata anche se le metriche di abbondanza sono distorta quando il conteggio di sequenza di codice a barre.
Contaminazione incrociata gocciolina può insorgere anche a causa delle condizioni non ottimali di fusione. Durante un'operazione di successo, il dispositivo di fusione di microfluidica (Figura 5) può abbinare controllably 1 goccia di codici a barre con 1 microgel ed un volume di reagente PCR. Le portate non-ideale si tradurrà in una gocciolina in abbinamento a rapporti non corretti: 1 codice a barre può essere accoppiato con 2 microgels, per esempio. Tutte le portate elencate nel protocollo sono destinate ad essere stime e potrebbero essere necessario essere regolata a seconda delle lievi variazioni nelle dimensioni di geometria e gocciolina di dispositivo. Gli utenti con accesso alle telecamere con capacità di registrazione ad alta velocità (> 10.000 fotogrammi/s) dovrebbe verificare la fusione goccia corretta all'inizio e nel corso dell'operazione microfluidica. Utenti senza accesso ad una macchina fotografica ad alta velocità è in grado di raccogliere un piccolo volume di output Unito e misurare manualmente le dimensioni delle gocce sotto un microscopio. La dimensione delle gocce deve essere uniforme: un eccesso di codici a barre non unite o gocce microgel indica che i tassi di reiniezione dovrebbero essere ridotto di conseguenza.
Diversi generali bisogna tener conto quando si maneggiano microgels e microgocce di preservare la loro integrità. Microgels, anche se meccanicamente robusta, deve essere sufficientemente raffreddato prima di rompersi e fasi per garantire completa gelificazione di lavaggio. Microgels non-sferiche sono un'indicazione che l'agarosio non era dato tempo sufficiente per solidificare. Quando si lava microgels, rallentare le sospensioni alla velocità necessaria per evitare una perdita di prodotto. Idrogel di agarosio ha un indice di rifrazione strettamente corrispondente a quello dell'acqua e può essere difficile da vedere in un tubo22, così gli utenti dovrebbero identificare attentamente il contorno di gel-liquido prima dell'aspirazione. Goccioline di acqua in olio sono suscettibili di coalescenza da accumuli di forze statiche23 su guanti da laboratorio e tubi. Per questo motivo, si consiglia di caricare le siringhe di reiniezione di goccia con le mani nude e nel trattamento di tutte le linee di reiniezione con una pistola anti-statica prima dell'innesco della pompa. Grandi goccioline si fusero possono essere rimosso lentamente ruotando le emulsioni in una siringa ed aspirare manualmente le gocce più grandi, che si accumulano nella parte superiore a causa della loro più grande forza capace di galleggiare.
SiC-seq è la prima tecnologia per dimostrare il sequenziamento del genoma unicellulare di > 50.000 cellule batteriche. Questa piattaforma offre significativi vantaggi nella velocità effettiva rispetto approcci esistenti e consente un campionamento più profondo delle comunità microbiche eterogenee. Ad oggi, microfluidica tecnologie per il sequenziamento del genoma di singola cellula hanno impiegato microchambers9 e micropozzetti24 per isolamento delle cellule e amplificazione, ma con volumi di produzione nella gamma di solo decine o centinaia di cellule. L'ordinamento di flusso delle singole cellule in wellplates5,6 non richiede nessuna strumentazione specializzata microfluidici ma possiede un throughput altrettanto basso. Dato che i campioni di suolo e acqua dall'ambiente hanno comunemente alfa diversità di > 1.000 alle specie livello25,26, SiC-seq è altamente vantaggiosa in virtù della sua abilità di campionare un numero molto maggiore di organismi. Il flusso di lavoro di SiC-seq è adattabile agli ingressi delle cellule da laboratorio cultura, l'ambiente naturale o un ospite vivente. Un campione di cellule necessario solo in una sospensione acquosa e privo di particelle di grandi dimensioni (> 10 µm) per essere adatto ad incapsulamento microfluidica. Ad esempio, il metodo è stato precedentemente applicato ad un campione di acqua di mare utilizzando una serie di lavaggio e filtraggio passaggi per pre-elaborare le cellule prima dell'incapsulamento17.
Il protocollo di SiC-seq genera una quantità relativamente scarsa di dati di sequenziamento da ogni singola cellula e potrebbe non essere adatto per tutte le applicazioni. Alcuni algoritmi di bioinformatica come de novo genoma assembly o variante di singolo nucleotide (SNV) chiamata richiedono profondità di copertura superiori di lavorare efficacemente. Invece, i gruppi di codice a barre possono essere cluster in silico di tassonomico binning metodi27 affinché gli algoritmi possono essere applicati su grandi insiemi di letture. L'efficienza complessiva relativamente basso di codici a barre del flusso di lavoro SiC-seq può presentare sfide in casi in cui la disponibilità dell'esempio di input è bassa. SiC-seq si basa su un passo di incapsulamento di Poisson-distribuito codice a barre, quindi circa il 10% delle cellule ricevono un codice a barre molecolare e sono amplificati durante il passaggio di preparazione finale biblioteca. Mentre questo è paragonabile ad altri regimi di barcoding basato su microdroplet10, gli utenti che lavorano con i campioni delle cellule preziose possono avere difficoltà a raggiungere il rendimento adeguato biblioteca per il sequenziamento e potrebbero essere necessario aumentare il numero di cicli PCR in finale passo di amplificazione. Un'altra potenziale soluzione per gli utenti con competenze di microfluidica è per ordinare goccioline barcode positivo dopo il passaggio PCR digitale, portando così l'efficienza complessiva di codici a barre > 85%28.
Un orientamento futuro potenziale per SiC-seq tecnologia sta adattando il flusso di lavoro per l'utilizzo con cellule di mammifero, aprendo la strada a nuovi studi clinici di cella singola. Ad esempio, un'analisi della variazione numero di copia tra singolo cancro cellule maggio avanzare la nostra comprensione del ruolo dell'eterogeneità in cancro patologia2. In alternativa, l'integrazione di SiC-seq con metodi esistenti di sondare ed arricchire le sequenze del DNA di interesse29 consentirebbe il sequenziamento di singola cellula mirato delle sottopopolazioni o rari ceppi di cellule. Con i campioni ambientali, geni all'interno di una via metabolica nota potrebbero essere mirati e analizzati contestualmente accanto alla confinate geni per identificare nuove isole genomiche. All'interno di un ambiente ospite umano, campioni di batteri patogeni di basso-titolo potrebbero essere isolati e sequenziato a livello di singola cellula per esaminare più da vicino le loro origini genotipiche di virulenza.

Il genoma serve come un modello di identità cellulare e funzione, che contiene la totalità di un organismo di codificazione potenziale. Una comprensione della biologia cellulare a livello del genoma può spiegare la diversità fenotipica osservata all'interno delle popolazioni eterogenee delle cellule. Questa eterogeneità è evidente nei sistemi biologici e ha vaste implicazioni per salute umana e la malattia. Ad esempio, variazioni del numero di copia genica tra le cellule del tumore sono collegati per l'evoluzione e la diffusione di cancro1,2. Nelle infezioni batteriche, Isole di patogenicità presente in una piccola frazione del genoma possono essere trasferiti in orizzontale e conducono alla proliferazione di batteri antibiotico-resistenti3,4. Una sfida primaria nello studio di genomi a livello di singola cellula è il basso quantità di DNA disponibile, come pure la necessità di analizzare migliaia di cellule per assaggiare la completa diversità dei genotipi. Per questi motivi, limitazioni nella velocità effettiva sperimentale hanno ostacolato l'efficacia degli studi unicellulare, differenziazione dei risultati verso le cellule più abbondanti. Tecniche di isolamento di singole cellule come flusso ordinamento5,6, pinzette ottiche7, infissione in bulk gel8e microfluidica9 sono capaci di elaborare centinaia di cellule per il sequenziamento; Tuttavia, questo rappresenta solo una piccola frazione della maggior parte dei campioni. Un metodo per il sequenziamento del genoma unicellulare con throughput sostanzialmente più elevato consentirebbe più profonda e più completa analisi di popolazioni di cellule, quindi chiarire il ruolo della diversità genotipica all'interno di queste comunità.
Gocciolina microfluidica consente la manipolazione di alto-rendimento delle cellule e reagenti biologici all'interno milioni di reattori picolitri-scala. Ad oggi, microdroplet tecnologie sono state utilizzate per studiare i modelli di espressione differenziale tra cellule da tessuti eterogenei10,11,12, profondamente sequenza lunghe molecole13,14 ,15e condotta analisi di sequenziamento (ChiP-seq) immunoprecipitazione della cromatina su singole cellule16. Microgocce sono infatti in grado di operazioni ad alta velocità, suddiviso in compartimenti, che li rende suscettibili di applicazioni in cella singola genomica. Lo sviluppo di questa tecnologia presenta le proprie sfide tecnologiche specifiche, tuttavia. Cellule devono essere lisate, purificate e amplificate con polarizzazione minima, di popolazioni di cellule campione uniformemente. Inoltre, a differenza di poliadenilazione trascritti di mRNA in cellule di mammifero, non c'è nessun motivo molecolare comparabile nel genoma per facilitare la cattura dell'acido nucleico bersaglio. Per questi motivi, il sequenziamento del genoma cella singola è stato difficile da attuare nelle piattaforme di microdroplet.
In questo lavoro, forniamo un protocollo dettagliato del nostro approccio precedentemente segnalati unicellulare microfluidici capace di sequenziamento dei genomi di decine di migliaia di cellule in un singolo esperimento17. Con questa tecnologia, denominata SiC-seq, cellule batteriche sono incapsulate in idrogel micron-scala e lisate individualmente, tagmented e si fuse con un microdroplet contenente un codice a barre univoco del oligonucleotide, che è calettati su DNA genomico delle cellule tramite un sovrapposizione singola estensione reazione a catena della polimerasi (PCR). Nel caso degli idrogeli funge da contenitori isolati in cui il DNA genomico ad alto peso molecolare è stericamente racchiusi, permettendo che le molecole più piccole come i detersivi e gli enzimi litici per accedere e purificare il DNA prima del barcoding18. Questo protocollo elabora > 50.000 unicellulari in poche ore, risultante in una libreria di codice a barre pronta per il sequenziamento. Dopo il sequenziamento, le letture sono demoltiplicate secondo la loro sequenza unicellulare barcode, risultante in un set di dati composto da milioni di letture, ciascuno con un indice di cellulare.

<table><tbody><tr><td>Wafer di silicone da 3", tipo P, wafer universitari vergini per test</td><td></td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3025 fotoresist</td><td>Microchem</td><td>17030192</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Sistemi di rivestimento speciali</td><td>G3P-8</td><td></td></tr><tr><td>Photomasks</td><td>CadArt Servcies</td> <td>(personalizzato)</td><td>Vedi i file supplementari per i disegni di maschere</td></tr><tr><td>Sviluppatore PGMEA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>484431</tr><tr><td>Kit di elastomeri siliconici</td><td></td> Sigma-Aldrich 109827 <td></td> Sylgard 184 Isopropanolo Camera di degasaggio 4019862 <td></td>Krayden</tr><tr><td></td><td>Bel-Art</td><td>42025</td><td></td></tr><tr><td>Punzone per biopsia da 0,75 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio (75 mm x 50 mm)</td><td>Corning</td><td>294775X50</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aquapel (trattamento idrofobico del vetro)</td><td>Pittsburgh Glass Works</td><td>47100</td><td></td></tr><tr><td>PE-2 tubo in polietilene</td><td>Scientific Commodities</td><td>B31695-PE/2</td><td></td></tr><tr><td>siringhe da 1 mL BD</td><td></td><td>309628</td> aghi calibro 27 BD 305109 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa a siringa</td> New <td>Era Pump Systems</td><td>NE-501</td><td></td></tr><tr><td>Novec HFE-7500 olio fluorurato ( HFE)</td><td>3M</td><td>98-0212-2928-5</td><td></td></tr><tr><td>FC-40 olio fluorurato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9755</td><td></td></tr><tr><td>PEG-PFPE tensioattivo</td><td>Ran Biotechnologies</td><td>008-FluoroSurfactant</td><td></td></tr><tr><td>Riscaldatore d'ambiente</td><td>Lasko&nbsp;</td><td>CD09250&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio, bassa temperatura di gelificazione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>a9414</td><td></td></tr><tr><td>TE (10X)</td><td>Rockland</td><td>mb-007</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X, pH 7.4</td><td>E& K Scientific Products</td><td>EK-65083</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep (gradiente di densità medio)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>d1556</td><td></td></tr><tr><td>1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>370533</td><td></td></tr><tr><td>Span 80 (monooleato di sorbitano)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s6760</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>139386</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 (polisorbato 20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p2287</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima di tipo IV</td><td>MP Biomedicals</td><td>195303</td><td></td></tr><tr><td>Mutanolisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9901</td><td></td></tr><tr><td>Zimoliasi (enzima litico del lievito)</td><td>Zymo Research</td><td>e1004</td><td></td></tr><tr><td>Lisostafina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7386</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH 7,5, 1M</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Teknova</td><td>d9750</td><td></td></tr><tr><td>Litio dodecil solfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9781</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>New England Biosciences</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo, 200 Proof (100%)</td><td>Koptec</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I (colorazione dell'acido nucleico)</td><td>Invitrogen</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>PEG 6k</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81260</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 (ottilfenolo etossilato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>t8787</td><td></td></tr><tr><td>Nextera DNA Library Prep Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1030</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start Flex Master Mix (High Fidelity Hot Start Master Mix)</td><td>New England Biosciences</td><td>m05365</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4464263</td><td></td></tr><tr><td>Warmstart 2.0 Bst Polymerase (polimerasi isotermica)</td><td>New England Biosciences</td><td>m0538m</td><td></td></tr><tr><td>NT buffer dal kit Nextera XT (tampone di neutralizzazione)</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td></td></tr><tr><td>Inverter fluorescente a catodo freddo</td> <td>(personalizzato)</td><td>(personalizzato)</td><td></td></tr><tr><td>Alimentatore CC</td> Pistola antistatica <td>Mastech</td><td>HY1503D</td><td></td></tr><tr><td>Zerostat 3</td><td>Milty</td><td>5036694022153</td><td></td></tr><tr><td>supporto per siringa da centrifuga stampato in 3D</td> <td>(personalizzato)</td> <td>(personalizzato)</td> <td>Vedere i file supplementari per il file di stampa 3D</td></tr><tr><td>Zymo DNA Clean & Concentratore-5</td><td>Zymo Research</td><td>D4003</td><td></td></tr></tbody></table>

una piattaforma di microfluidic ad altissima velocità di trasmissione per il sequenziamento del genoma di cella singola

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Tecnologie di sequenziamento hanno subito un cambiamento di paradigma da massa a cella singola risoluzione in risposta a un'evoluzione della comprensione del ruolo della eterogeneità cellulare nei sistemi biologici. Tuttavia, cella singola sequenza di grandi popolazioni è stata ostacolata dalle limitazioni in genomi per la sequenza di elaborazione. In questo articolo, descriviamo un metodo per il sequenziamento del genoma di singola cellula (SiC-seq) che utilizza la gocciolina microfluidica per isolare, amplificare e codici a barre i genomi delle singole cellule. Incapsulamento delle cellule in microgels permette la purificazione compartimenti e tagmentation del DNA, una fusione di microfluidica coppie efficientemente ogni genoma con un codice a barre univoco del oligonucleotide di singola cellula, permettendo > 50.000 celluli da sequenziare per corsa. I dati di sequenziamento sono demultiplexing di codici a barre, generando gruppi di letture che proviene dalle cellule singole. Come un metodo ad alta produttività e basso-polarizzazione di cella singola sequenza, SiC-seq consentirà una più ampia gamma di studi genomici mirati alle popolazioni cellulari diversi.

Il flusso di lavoro sperimentale di SiC-seq contiene 3 dispositivi microfluidici PDMS fabbricati utilizzando una procedura di litografia soft (Figura 1). Un co-flusso dropmaker (Figura 3A) genera 25 µm di goccioline digitale codice a barre per l'etichettatura di DNA genomico con un identificatore univoco di cella singola. I oligonucleotides di codici a barre consistono di una sequenza di degenerato bp 15 affiancato da maniglie PCR per l'amplificazione (tabella 2, BAR primer). I codici a barre sono diluiti ad una concentrazione di femtomolar per raggiungere l'incapsulamento di singola molecola, e ricevano tutte le goccioline frammenti di codice a barre sia 0 o 1. Le goccioline contenenti un codice a barre sono amplificate, producendo molte copie degli ampliconi di double-stranded del codice a barre. Una macchia di acido nucleico viene utilizzata per verificare l'amplificazione di successo e quantificare la velocità di incapsulamento dei frammenti di codice a barre (Figura 4B). I microgels vengono generati dal co-che scorre una sospensione di cellule batteriche e un gel di agarosio fuso alle portate uguali (Figura 2A). L'agarosio è preparato a due volte la concentrazione finale desiderata, come il processo di dropmaking di co-flusso diluisce in modo efficace le soluzioni acquose di un fattore 2. Come l'agarosio si raffredda, si solidifica in un 25 µm diametro microgel occupando il volume sferico della goccia.
Una serie di passaggi di lavaggio e Lisi purifica il DNA genomic di alto peso molecolare in microgels (Figura 2B). Dopo la rottura delle emulsioni, lavaggi acquosi sono effettuati in grandi volumi per diluire fuori traccia solventi organici che possono inibire i trattamenti enzimatici a valle. Il microgels lavato sono osservati al microscopio per verificare il tasso di incapsulamento delle cellule (Figura 4A). Un cocktail di enzimi con vasta attività litica è aggiunto alla sospensione microgel per digerire le pareti cellulari dei batteri e microbi eucarioti19. Un secondo trattamento con proteinasi K e detergente degrada le proteine e solubilizza i detriti cellulari.
Tagmentation del DNA purificato viene effettuata nelle goccioline per evitare potenziali contaminazioni derivanti dalla diffusione di frammenti di DNA di piccolo tagmented tra i microgels18. Un dispositivo di incapsulamento di goccia (Figura 3B) compartmentalizes ogni microgel con un enzima buffer e tagmentation, che contemporaneamente frammenti di DNA double-stranded mentre anche "tagging" con un oligonucleotide precaricato20. I microgels vengono caricati nelle gocce di come Chiudi-pranzo particelle, realizzando i tassi di incapsulamento si avvicina 1 microgel per ogni goccia con alcuni doppietti21 (Figura 4).
Nel passaggio finale del flusso di lavoro microfluidica (Figura 2), un dispositivo esegue un'operazione di fusione doppia combinazione 1 goccia di codici a barre, 1 goccia di microgel-contenente e il mix di amplificazione in un processo controllato in due fasi. In primo luogo, una gocciolina contenente reagenti PCR accoppiata e fuse con una goccia di codice a barre nella regione evidenziata in giallo (Figura 5). Acqua salati elettrodi nel canale microfluidico producono un gradiente elevato campo elettrico che innesca la fusione della gocciolina. In modo simile, la prima goccia unita è accoppiata con una gocciolina di microgel e incorporata una seconda volta nella regione indicata in rosso. Le goccioline vengono raccolti e termica pedalato off-chip in un'estensione di singolo-sovrapposizione (SOE) PCR. Le estremità sovrapposte complementari del codice a barre e il DNA di genomic tagmented consentono fusion e amplificazione esponenziale di costrutti di codice a barre solo correttamente.
I dati di sequenziamento sono filtrati prima di una qualità di lettura e quindi analizzati raggruppando le letture secondo la loro sequenza di codici a barre cella singola 15-bp. Per un gruppo di codice a barre può essere considerata valida, deve contenere un numero minimo di letture; Questa soglia limita l'analisi alle cellule con una quantità utile di dati di sequenziamento e rimuove il codice a barre "orfani" PCR-mutato dal dataset. In questo esempio eseguito, il minimo è impostato su 7,5 kbps per ogni gruppo (50 letture di 150 bp ogni). Un istogramma dei conteggi barcode contro la dimensione del gruppo dimostra che una porzione significativa dei gruppi validi codici a barre è appena sopra la dimensione della soglia (Figura 6A).
In un esperimento di controllo cui è nota la composizione della comunità microbica, la purezza e la relativa abbondanza metriche vengono utilizzati per valutare la qualità di un SiC-seq eseguire. Qui, una comunità di 10 celle sintetica composto da 3 batteri gram-negativi, batteri Gram-positivi 5 e 2 lieviti è analizzata. La purezza di un gruppo determinato codice a barre è definita come il numero di letture mapping al genoma più comune nel gruppo diviso per il numero totale di letture nel gruppo. La stragrande maggioranza dei gruppi di codice a barre hanno gradi di purezza superiore a 0,95 (Figura 6B). Relativa abbondanza dei tipi cellulari viene calcolato contando le letture crude e contando i gruppi di codice a barre, dove i gruppi vengono assegnati un tipo di cella corrispondente al consenso delle sue letture di membri (Figura 6). L'abbondanza di letture e di gruppi di codice a barre traccia in proporzioni più o meno uguali, che indica che le popolazioni delle cellule sono campionate tale che alcune specie non sono contenuti nel codice a barre sproporzionatamente piccole o grandi gruppi. Stampa la copertura aggregata di tutti i gruppi di codice a barre da una singola specie indica una copertura elevata attraverso l'intero genoma, con pochi o nessun regioni dropout (Figura 7). L'uniformità di copertura può essere verificato con una distribuzione di frequenza dei valori di copertura normalizzato, con maggior parte dei valori centrata intorno alla media (Figura 7, inserto).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig1.jpg"> Figura 1 : Fabbricazione di dispositivi microfluidici di fotolitografia. (A) Master stampi con un'altezza di singola caratteristica sono fabbricati da spin coating di uno strato di photoresist SU-8 su un wafer di silicio. Il photoresist è poi modellato con una maschera fotolitografica e ai raggi UV, reticolazione esposta SU-8. Infine, reticolato SU-8 è dissolto in un bagno di sviluppatore. La muffa risultante viene utilizzata per PDMS che è legato a una lastra di vetro per produrre il dispositivo microfluidico completa il cast. (B) per un dispositivo a doppio strato, la fabbricazione inizia allo stesso modo con passaggi di rivestimento e l'esposizione di spin. Questi passaggi vengono ripetuti poi per creare un dispositivo di due-strato. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig2.jpg"> Figura 2: Panoramica del flusso di lavoro SiC-seq. (A), A sospensione microbica è co-propagata con agarosio fuso in un dispositivo di dropmaker per incapsulare singole cellule in microgels. (B) i microgels sono sottoposti a una serie di lavaggi per purificare il DNA genomico batterico. Enzimi litici digeriscono le pareti cellulari dei lieviti e batteri Gram-positivi, e detergente solubilizza i detriti cellulari. I microgels sono ri-incapsulato in goccioline per la tagmentation per ridurre la contaminazione incrociata. (C), la fusione di microfluidica combina un codice a barre digitale di PCR, un genoma di microgel tagmented e un mix di amplificazione ad un tasso &gt; 1 kHz. Off-chip SOE-PCR giunzioni un codice a barre univoco di cella singola sul genoma tagmented e selettivamente amplifica completamente costrutti di codice a barre. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig3.jpg"> Figura 3: Dispositivi microfluidici per ri-l'incapsulamento di dropmaking e microgel. (A), questo pannello mostra un co-flusso dropmaker (25 µm di altezza caratteristica). Cellule e agarosio fuso vengono introdotti nel dispositivo a velocità di flusso pari a produrre 25 µm goccioline in un incrocio di µm 25 µm x 25. Per la dropmaking digitale codice a barre, è collegato all'ingresso della cella, e un mix PCR è stato introdotto nell'ingresso dell'agarosi. (B), questo pannello mostra un dispositivo di ri-incapsulamento microgel (25 µm di altezza caratteristica). Il microgels di flusso in un'insenatura a forma di imbuto per mantenere il loro pranzo di chiusura dell'ordine e ricevere un volume di mix tagmentation prima il Re-incapsulamento in un incrocio di µm 25 µm x 30. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig4.jpg"> Figura 4 : Micrografie di goccioline e microgels. (A), questo pannello spettacoli lavati 25 µm microgels prima della lisi enzimatica. I batteri sono macchiati fluorescente per la quantificazione del tasso di incapsulamento. Statistiche di caricamento di Poisson dettano che le cellule dovrebbero essere incapsulato ad un tasso di 1 a 10 gocce o meno per ridurre al minimo la frequenza di eventi multipli-incapsulamento. (B) questo pannello mostra un'immagine di microscopia di fluorescenza di 25 µm digitale barcode goccioline trattato con una macchia di acido nucleico. Le goccioline contenenti frammenti di codice a barre amplificato producono un segnale di fluorescenza forte. (C) questo pannello mostra microgels ri-incapsulati in 50 µm gocce. L'impacchettamento del microgels consente velocità di incapsulamento si avvicina 1 gel a goccia con pochi doppietti. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig5.jpg"> Figura 5 : Dispositivo di doppia fusione microfluidici per cella singola genoma barcoding. Un'operazione di fusione di due fasi coppie barcode goccioline con genomi di tagmented in un high-throughput. Una gocciolina di miscela PCR prima viene generata e si fuse con una gocciolina di codice a barre nella regione evidenziata in giallo usando elettrodi di acqua salati. Successivamente, una gocciolina contenente un microgel è introdotto e incorporata una seconda volta nella regione indicata in rosso. Introduttori d'olio consentono un controllo preciso della spaziatura tra le goccioline reiniettate. Camera di reiniezione di codici a barre e il suo petrolio distanziatore sono collocati sul livello 25 µm più breve, ombreggiato in blu. Tutte le altre caratteristiche del dispositivo appartengono allo strato più spesso con 45 µm di altezza totale. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig6.jpg"> Figura 6 : Metrica del gruppo di codice a barre per una comunità microbica sintetica 10 celle. (A), questo pannello mostra la distribuzione di codice a barre dimensioni del gruppo. Il numero di gruppi di una determinata dimensione diminuisce in modo esponenziale con l'aumentare della dimensione di gruppo. Una soglia minima di 7,5 kbps per ogni gruppo limita l'analisi ai gruppi con una quantità sufficiente di informazioni e rimuove la sequenza di PCR-mutato "orfani". (B), questo pannello mostra la distribuzione dei codici a barre purezze di gruppo. La maggior parte (&gt; 90%) dei gruppi sono di elevata purezza (&gt; 95%). (C) questo pannello mostra l'abbondanza relativa di 10 specie calcolato a livello di gruppo di leggi e codici a barre. 2 metodi di conteggio producono risultati simili, che indica che le dimensioni del gruppo di codice a barre siano coerenti tra le specie. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig7.jpg"> Figura 7 : Aggregare genomico copertura di Bacillus subtilis gruppi di codice a barre. Le letture di tutti i gruppi di codice a barre mappatura al batterio Bacillus subtilis (N = 9.398) sono riuniti e analizzati in forma aggregata. Una mappa di copertura circolare illustra l'uniformità di copertura della legge SiC-seq, con nessuna regione osservabile dropout. Una linea tratteggiata attorno alla circonferenza indica la copertura media (5,55 x). L'istogramma di inserzione delle frequenze relativa copertura mostra che una massa delle basi sono coperti di profondità vicino alla media del genoma, rappresentato dalla linea tratteggiata. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Dispositivo</td>
			<td>1 ° strato di altezza (µm)</td>
			<td>1 ° strato Spin velocità (rpm)</td>
			<td>2 ° strato di altezza (µm)</td>
			<td>2 ° strato Spin velocità (rpm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dropmaker co-flusso</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ri-incapsulatore gel</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Doppia fusione</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>20</td>
			<td>5000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: parametri di fabbricazione del dispositivo microfluidico. Questa tabella mostra una lista dei dispositivi microfluidici il SiC-seq di flusso di lavoro con la loro velocità necessaria per photoresist spin coating (basato sulle specifiche del produttore per SU-8 3025).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Etichetta</td>
			<td colspan="5">Sequenza (5' &gt; 3')</td>
		</tr>
<tr>
<td>BAR</td>
			<td colspan="5">GCAGCTGGCGTAATAGCGAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGNNNNNNNNNNNNNNNTAAGCCAGCCCCGACACT</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA_BAR</td>
			<td colspan="5">CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>P7_BAR</td>
			<td colspan="5">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCTGGCGTAATAGCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>P5_DNA</td>
			<td colspan="5">AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC</td>
		</tr>
<tr>
<td>I7_READ</td>
			<td colspan="5">GCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Sequenze Primer.
File supplementare 1: <a href="/files/ftp_upload/57598/Suppl_File_1-SiC-seq_device_masks.dwg" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 2: <a href="/files/ftp_upload/57598/Suppl_File_2-centrifuge_syringe_holder_1mL.dwg" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

Cella singola sequenza rivela eterogeneità genotipica nei sistemi biologici, ma le attuali tecnologie mancano la velocità effettiva necessaria per la profonda analisi della funzione e della composizione della Comunità. Qui, descriviamo un workflow di microfluidica per sequenziamento > 50.000 unicellulare genomi da diverse popolazioni cellulari.

Una piattaforma di Microfluidic ad altissima velocità di trasmissione per il sequenziamento del genoma di cella singola

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di generare dati di sequenziamento genomico con codice a barre da decine di migliaia di singole cellule utilizzando una serie di dispositivi microfluidici. Questo metodo consente di ottenere una produttività senza precedenti nel sequenziamento di singole cellule. Utilizziamo la microfluidica per incapsulare, lisare e codificare le cellule singolarmente, preservando l'eterogeneità genomica sottostante, che viene persa negli shock convenzionali negli studi di sequenziamento.Il vantaggio principale di questa tecnica è che è ad alta produttività e in grado di produrre dati a singola cella da decine di migliaia di cellule. Sebbene in questa dimostrazione si lavori con i microbi, il flusso di lavoro può essere adattato per l'uso con diversi tipi di cellule attraverso piccole modifiche alle dimensioni del dispositivo microfluidico. Per iniziare il protocollo, preparare un millilitro di agarosio a bassa temperatura di fusione al 3% in peso per volume in un tampone 1X Tris-EDTA, o TE.Mantenere la soluzione di agarosio su un blocco termico a 90 gradi Celsius fino al caricamento della siringa. Risospendere le cellule in un millilitro di soluzione salina tamponata con fosfato, o PBS, e far girare le cellule. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in un millilitro di 17% di volume in volume di gradiente di densità in PBS e mantenere le cellule sul ghiaccio fino al caricamento della siringa.Quindi, caricare una siringa da tre millilitri con olio fluorurato, o HFE, contenente un tensioattivo PFPE-PEG al 2% in peso per peso. Inseriscilo con un ago calibro 27 e inseriscilo in una pompa a siringa. Caricare la sospensione cellulare e l'agarosio fuso in siringhe da un millilitro, entrambe dotate di aghi calibro 27, e inserirle nelle pompe a siringa.Quindi, impostare una stufa su un valore alto e posizionare la superficie riscaldante a 10 centimetri di distanza dalla siringa. Assicurarsi che la temperatura misurata alla siringa sia di circa 80 gradi Celsius. Prima di inserire i tubi nel dispositivo, adescare le pompe per rimuovere l'aria dalla linea.Collegare gli aghi della siringa agli ingressi del dispositivo microfluidico utilizzando pezzi di tubo in polietilene o PE. Collegare un pezzo di tubo alla presa e posizionare l'estremità libera in una provetta di raccolta da 15 millilitri. Dopo la produzione a goccia, posizionare la provetta di raccolta a quattro gradi Celsius per 30 minuti per garantire la completa gelificazione dell'agarosio.Rimuovere lo strato inferiore di olio dalla provetta di raccolta utilizzando una siringa da tre millilitri dotata di ago calibro 20, facendo attenzione a non disturbare lo strato superiore delle goccioline di agarosio. Aggiungere un millilitro di 10% di volume di PFO in HFE per rompere le gocce di agarosio dal loro strato di tensioattivo. Pipettare la soluzione su e giù per un minuto per rivestire accuratamente le emulsioni, che devono essere omogenee e prive di grumi.Centrifugare il tubo conico a 2.000 volte g per un minuto per raccogliere i microgel di agarosio. Aspirare il surnatante PFO/HFE e assicurarsi che i microgel siano ora privi del loro strato di tensioattivo e siano limpidi. Dopo aver lavato i microgel, verificare l'incapsulamento cellulare nei microgel al microscopio con un ingrandimento di 400X colorando un'aliquota di gel da 10 microlitri con una colorazione di acido nucleico 1X.Collegare l'ingresso delle celle di un dispositivo dropmaker co-flow con un piccolo pezzo di saldatura al piombo. Prima di inserire i tubi nel dispositivo, adescare le pompe per rimuovere l'aria dalla linea. Collegare un pezzo di tubo all'uscita e posizionare l'estremità libera in una provetta PCR da 0,2 millilitri.Usa le portate sullo schermo per il dropmaking. Raccogliere le gocce nelle provette PCR con circa 50 microlitri di gocce in ciascuna provetta. Dopo la produzione di gocce, rimuovere con cura lo strato inferiore di olio HFE dalle emulsioni utilizzando puntali per pipette caricanti gel e sostituirlo con olio fluorurato FC-40 contenente un tensioattivo PFPE-PEG al 5% in peso per peso.Quindi, programmare il ciclo termico. Prima di inserire i tubi nel dispositivo, adescare le pompe per rimuovere l'aria dalla linea. Collegare le siringhe contenenti HFE, miscela di tagmentazione e microgel agli ingressi del dispositivo microfluidico utilizzando pezzi di tubo in PE.Collegare un pezzo di tubo all'uscita e posizionare l'estremità libera in una siringa vuota da un millilitro con lo stantuffo tirato verso la linea da un millilitro. Successivamente, verificare la velocità di incapsulamento del microgel al microscopio ottico con un ingrandimento di 400X. Inserire la siringa contenente le emulsioni di tagmentazione con un ago e incubarla in posizione verticale in un blocco termico o in un forno per un'ora a 55 gradi Celsius per frammentare il DNA genomico.Preparare le goccioline del codice a barre per la fusione sostituendo la frazione di olio FC-40 con HFE 2% in peso per peso PFPE-PEG. Trasferire con cura le gocce in una siringa da un millilitro, inserirla con un ago e inserirla in una pompa a siringa. Caricare la siringa di gocce di microgel incubata e tagmentata in una pompa a siringa.Quindi, collegare le tre siringhe di cloruro di sodio ai due ingressi degli elettrodi e all'ingresso del fossato singolo utilizzando pezzi di tubo in PE. Prima di inserire i tubi nel dispositivo, adescare le pompe per rimuovere l'aria dalla linea. Collegare le tre siringhe HFE montate sulle pompe ai due ingressi dell'olio distanziatore e all'ingresso dell'olio per la produzione di gocce utilizzando pezzi di tubo in PE.Quindi, sparare a tutti i tubi di reiniezione delle goccioline con una pistola antistatica prima di collegare il tubo agli aghi della siringa. Collegare la siringa di miscelazione PCR, la siringa a goccia di microgel e la siringa a goccia con codice a barre ai rispettivi ingressi con tubo in PE. Collegare l'ago della siringa dell'elettrodo a un inverter fluorescente a catodo freddo utilizzando una clip a coccodrillo.Impostare l'alimentazione CC dell'inverter su due volt. Far funzionare il dispositivo a doppia fusione con le portate consigliate. Raccogliere le gocce in provette per PCR con circa 50 microlitri di emulsione in ciascuna provetta.Prima del ciclo termico, rimuovere con cautela lo strato inferiore di olio HFE dalle emulsioni utilizzando puntali per pipette caricanti in gel e sostituirli con olio fluorurato FC-40 contenente un tensioattivo PFPE-PEG del 5% in peso per peso. Quindi, programmare il ciclo. Per recuperare il DNA dalle goccioline del ciclo termico, riunire le goccioline in una provetta da microcentrifuga e rompere le emulsioni utilizzando 20 microlitri di PFO.Agitateli per 10 secondi per amalgamarli. Gira il tubo. Rimuovere con cautela lo strato acquoso superiore dalla provetta utilizzando una pipetta e trasferirlo in una nuova provetta per microcentrifuga.Scartare la fase oleosa. Quindi, infine, procedi con le fasi di preparazione, sequenziamento e analisi della libreria. Un istogramma dei conteggi dei codici a barre rispetto alla dimensione del gruppo mostra che una parte significativa dei gruppi di codici a barre validi è appena al di sopra delle 7,5 coppie di kilobasi per dimensione della soglia del gruppo, il che esclude gli orfani mutati dalla PCR.L'abbondanza relativa dei tipi di cellule da una comunità sintetica di 10 cellule di tre batteri gram-negativi, cinque batteri gram-positivi e due lieviti è stata calcolata contando le letture grezze e i gruppi di codici a barre. Una mappa circolare di copertura delle letture di B.subtilis da tutti i gruppi di codici a barre illustra l'uniformità delle letture SiC-seq, senza regioni di abbandono osservabili, dove la copertura media era di 5,55X. L'uniformità della copertura è stata verificata con una distribuzione di frequenza dei valori di copertura normalizzati.Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere una velocità di incapsulamento di circa un codice a barre o una cella ogni 10 goccioline. Ciò limita la probabilità di un evento di doppio incapsulamento, che può contorcere i dati della singola cella. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come configurare e utilizzare i dispositivi microfluidici utilizzati per generare dati di sequenziamento di singole cellule.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in otto ore o due giorni di quattro ore.

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