Una piattaforma di Microfluidic ad altissima velocità di trasmissione per il sequenziamento del genoma di cella singola

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di generare dati di sequenziamento genomico con codice a barre da decine di migliaia di singole cellule utilizzando una serie di dispositivi microfluidici. Questo metodo consente di ottenere una produttività senza precedenti nel sequenziamento di singole cellule. Utilizziamo la microfluidica per incapsulare, lisare e codificare le cellule singolarmente, preservando l'eterogeneità genomica sottostante, che viene persa negli shock convenzionali negli studi di sequenziamento.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che è ad alta produttività e in grado di produrre dati a singola cella da decine di migliaia di cellule. Sebbene in questa dimostrazione si lavori con i microbi, il flusso di lavoro può essere adattato per l'uso con diversi tipi di cellule attraverso piccole modifiche alle dimensioni del dispositivo microfluidico. Per iniziare il protocollo, preparare un millilitro di agarosio a bassa temperatura di fusione al 3% in peso per volume in un tampone 1X Tris-EDTA, o TE.

Mantenere la soluzione di agarosio su un blocco termico a 90 gradi Celsius fino al caricamento della siringa. Risospendere le cellule in un millilitro di soluzione salina tamponata con fosfato, o PBS, e far girare le cellule. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in un millilitro di 17% di volume in volume di gradiente di densità in PBS e mantenere le cellule sul ghiaccio fino al caricamento della siringa.

Quindi, caricare una siringa da tre millilitri con olio fluorurato, o HFE, contenente un tensioattivo PFPE-PEG al 2% in peso per peso. Inseriscilo con un ago calibro 27 e inseriscilo in una pompa a siringa. Caricare la sospensione cellulare e l'agarosio fuso in siringhe da un millilitro, entrambe dotate di aghi calibro 27, e inserirle nelle pompe a siringa.

Quindi, impostare una stufa su un valore alto e posizionare la superficie riscaldante a 10 centimetri di distanza dalla siringa. Assicurarsi che la temperatura misurata alla siringa sia di circa 80 gradi Celsius. Prima di inserire i tubi nel dispositivo, adescare le pompe per rimuovere l'aria dalla linea.

Collegare gli aghi della siringa agli ingressi del dispositivo microfluidico utilizzando pezzi di tubo in polietilene o PE. Collegare un pezzo di tubo alla presa e posizionare l'estremità libera in una provetta di raccolta da 15 millilitri. Dopo la produzione a goccia, posizionare la provetta di raccolta a quattro gradi Celsius per 30 minuti per garantire la completa gelificazione dell'agarosio.

Rimuovere lo strato inferiore di olio dalla provetta di raccolta utilizzando una siringa da tre millilitri dotata di ago calibro 20, facendo attenzione a non disturbare lo strato superiore delle goccioline di agarosio. Aggiungere un millilitro di 10% di volume di PFO in HFE per rompere le gocce di agarosio dal loro strato di tensioattivo. Pipettare la soluzione su e giù per un minuto per rivestire accuratamente le emulsioni, che devono essere omogenee e prive di grumi.

Centrifugare il tubo conico a 2.000 volte g per un minuto per raccogliere i microgel di agarosio. Aspirare il surnatante PFO/HFE e assicurarsi che i microgel siano ora privi del loro strato di tensioattivo e siano limpidi. Dopo aver lavato i microgel, verificare l'incapsulamento cellulare nei microgel al microscopio con un ingrandimento di 400X colorando un'aliquota di gel da 10 microlitri con una colorazione di acido nucleico 1X.

Collegare l'ingresso delle celle di un dispositivo dropmaker co-flow con un piccolo pezzo di saldatura al piombo. Prima di inserire i tubi nel dispositivo, adescare le pompe per rimuovere l'aria dalla linea. Collegare un pezzo di tubo all'uscita e posizionare l'estremità libera in una provetta PCR da 0,2 millilitri.

Usa le portate sullo schermo per il dropmaking. Raccogliere le gocce nelle provette PCR con circa 50 microlitri di gocce in ciascuna provetta. Dopo la produzione di gocce, rimuovere con cura lo strato inferiore di olio HFE dalle emulsioni utilizzando puntali per pipette caricanti gel e sostituirlo con olio fluorurato FC-40 contenente un tensioattivo PFPE-PEG al 5% in peso per peso.

Quindi, programmare il ciclo termico. Prima di inserire i tubi nel dispositivo, adescare le pompe per rimuovere l'aria dalla linea. Collegare le siringhe contenenti HFE, miscela di tagmentazione e microgel agli ingressi del dispositivo microfluidico utilizzando pezzi di tubo in PE.

Collegare un pezzo di tubo all'uscita e posizionare l'estremità libera in una siringa vuota da un millilitro con lo stantuffo tirato verso la linea da un millilitro. Successivamente, verificare la velocità di incapsulamento del microgel al microscopio ottico con un ingrandimento di 400X. Inserire la siringa contenente le emulsioni di tagmentazione con un ago e incubarla in posizione verticale in un blocco termico o in un forno per un'ora a 55 gradi Celsius per frammentare il DNA genomico.

Preparare le goccioline del codice a barre per la fusione sostituendo la frazione di olio FC-40 con HFE 2% in peso per peso PFPE-PEG. Trasferire con cura le gocce in una siringa da un millilitro, inserirla con un ago e inserirla in una pompa a siringa. Caricare la siringa di gocce di microgel incubata e tagmentata in una pompa a siringa.

Quindi, collegare le tre siringhe di cloruro di sodio ai due ingressi degli elettrodi e all'ingresso del fossato singolo utilizzando pezzi di tubo in PE. Prima di inserire i tubi nel dispositivo, adescare le pompe per rimuovere l'aria dalla linea. Collegare le tre siringhe HFE montate sulle pompe ai due ingressi dell'olio distanziatore e all'ingresso dell'olio per la produzione di gocce utilizzando pezzi di tubo in PE.

Quindi, sparare a tutti i tubi di reiniezione delle goccioline con una pistola antistatica prima di collegare il tubo agli aghi della siringa. Collegare la siringa di miscelazione PCR, la siringa a goccia di microgel e la siringa a goccia con codice a barre ai rispettivi ingressi con tubo in PE. Collegare l'ago della siringa dell'elettrodo a un inverter fluorescente a catodo freddo utilizzando una clip a coccodrillo.

Impostare l'alimentazione CC dell'inverter su due volt. Far funzionare il dispositivo a doppia fusione con le portate consigliate. Raccogliere le gocce in provette per PCR con circa 50 microlitri di emulsione in ciascuna provetta.

Prima del ciclo termico, rimuovere con cautela lo strato inferiore di olio HFE dalle emulsioni utilizzando puntali per pipette caricanti in gel e sostituirli con olio fluorurato FC-40 contenente un tensioattivo PFPE-PEG del 5% in peso per peso. Quindi, programmare il ciclo. Per recuperare il DNA dalle goccioline del ciclo termico, riunire le goccioline in una provetta da microcentrifuga e rompere le emulsioni utilizzando 20 microlitri di PFO.

Agitateli per 10 secondi per amalgamarli. Gira il tubo. Rimuovere con cautela lo strato acquoso superiore dalla provetta utilizzando una pipetta e trasferirlo in una nuova provetta per microcentrifuga.

Scartare la fase oleosa. Quindi, infine, procedi con le fasi di preparazione, sequenziamento e analisi della libreria. Un istogramma dei conteggi dei codici a barre rispetto alla dimensione del gruppo mostra che una parte significativa dei gruppi di codici a barre validi è appena al di sopra delle 7,5 coppie di kilobasi per dimensione della soglia del gruppo, il che esclude gli orfani mutati dalla PCR.

L'abbondanza relativa dei tipi di cellule da una comunità sintetica di 10 cellule di tre batteri gram-negativi, cinque batteri gram-positivi e due lieviti è stata calcolata contando le letture grezze e i gruppi di codici a barre. Una mappa circolare di copertura delle letture di B.subtilis da tutti i gruppi di codici a barre illustra l'uniformità delle letture SiC-seq, senza regioni di abbandono osservabili, dove la copertura media era di 5,55X. L'uniformità della copertura è stata verificata con una distribuzione di frequenza dei valori di copertura normalizzati.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere una velocità di incapsulamento di circa un codice a barre o una cella ogni 10 goccioline. Ciò limita la probabilità di un evento di doppio incapsulamento, che può contorcere i dati della singola cella. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come configurare e utilizzare i dispositivi microfluidici utilizzati per generare dati di sequenziamento di singole cellule.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in otto ore o due giorni di quattro ore.