Name: Iniezioni di Lipopolysaccharide in topi per simulare lingresso di prodotti microbici derivati dopo la violazione della barriera intestinale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Impara a simulare l'ingresso di prodotti microbici dopo la violazione della barriera intestinale mediante iniezione di lipopolisaccaride in topi. Questo metodo permette di studiare le risposte immunitarie e i meccanismi dell'infiammazione nelle malattie infiammatorie intestinali.

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Topi sono stati allevati e tenuti sotto specifiche condizioni (SPF) esenti da patogeni che nella struttura animale del dipartimento di biomedicina, Università di Basilea (Basilea, Svizzera). Tutti gli esperimenti del mouse sono stati effettuati conformemente alle prescrizioni cantonali (numero di protocollo animale 2816 [Cantone di Basilea-città]) e federale svizzero.
1. preparazione della soluzione di LPS
<ol><li>Aprire lo stock di LPS purificato da Escherichia coli 0111:B4 in condizioni sterili e ricostituirlo in acqua alla concentrazione di 5 mg/mL.</li>
	<li>Diluire lo stock di LPS con la soluzione fisiologica sterile tamponata (PBS) alla concentrazione di lavoro di 0,2 µ g / µ l.</li>
</ol>2. intraperitoneale di LPS ai topi
<ol><li>Aspirare il LPS soluzione di lavoro in una siringa da 0,5 mL con ago 30 G in un flusso d'aria laminare.</li>
	<li>Pesare i topi femminili C57Bl/6 (6-10 settimane di età) e calcolare la quantità di LPS che verrà iniettato: peso corporeo di 10 µ l (2 µ g) / g. Nota: ad esempio, se un mouse pesa 20 g, quindi µ l 20g x 10 = 200 µ l LPS soluzione deve essere iniettato per di lavoro.</li>
	<li>Gestire il mouse delicatamente ma con fermezza e trattenere l'animale in una mano. Assicurarsi che l'animale è in grado di respirare normalmente, ma non per girare e girare durante il sistema di ritenuta.</li>
	<li>Inclinazione del mouse naso leggermente verso terra per esporre l'addome per iniezione. Individuare la linea mediana dell'addome e il luogo di iniezione nella parte bassa dell'addome verso sinistra o destra dalla linea mediana. Iniettare PBS i.p. anziché LPS in topi di controllo.</li>
	<li>Con la mano libera, iniettare il volume appropriato (il volume calcolato al passaggio 2.2) dei LPS soluzione di lavoro. Assicurarsi che l'ago è entrato nella cavità peritoneale come altrimenti, mis-iniezioni nello strato del muscolo addominale possono verificarsi. Ancora, non andare troppo in profondità con l'ago nella cavità peritoneale per evitare di ferire gli organi interni che trovano in quella zona.</li>
	<li>Restituire l'animale con attenzione alla gabbia con fino a 5 topi per gabbia.</li>
</ol>3. monitorare i topi
<ol><li>Monitorare gli animali al momento dell'iniezione e ogni 2 h dopo l'iniezione per 8 h per l'avvenimento e la severità di endotossiemia. Pertanto, utilizzare un foglio di Punteggio (tabella 1) che è stato adattato da un manoscritto precedentemente pubblicati 24.</li>
	<li>
Segnare i topi iniettati LPS per i seguenti parametri elencati nella tabella 1
	<ol>
<li>Controllare l'aspetto della pelliccia che è normalmente liscia. Se il pelo appare pelo arruffato, appuntito o gonfio che indica il disagio e/o dolore, Punteggio loro come 1, 2 o 3.</li>
		<li>Controllare l'attività del mouse. Nota: Topi normalmente muovono liberamente intorno alla gabbia tutta mangiare, bere, arrampicata, ma soppressa o limitata attività potrebbe essere un segno di dolore.</li>
		<li>Controllare il livello di coscienza. Nota: I topi sono molto curiosi, e normalmente si muovono intorno alla gabbia indagando la zona circostante. Mancanza o ridotto movimento suggerire dolore e disagio.</li>
		<li>Controllare gli occhi. Nota: Gli occhi completamente aperti sono attesi in topi sani, ma gli occhi parzialmente o completamente chiusi, possibilmente con secrezione, possono essere un'indicazione di dolore.</li>
		<li>Controllare il tasso di respirazione. Nota: Topi sani hanno solitamente un tasso di respirazione normale e rapido, un tasso di respirazione ridotta potrebbe essere un'indicazione di disagio).</li>
		<li>Controllare la qualità della respirazione. Nota: Respiro affannoso con o senza affaticare il è un segno di dolore.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. tessuto campionamento per acido ribonucleico (RNA) estrazione e omogeneizzazione
<ol><li>Preparare le provette di raccolta/omogeneizzazione: aggiungere 1 mL Reagente di isolamento di RNA di passo singolo per provette 2 mL preriempita con sfere in ceramica 1,4 mm.</li>
	<li>Presso i punti di tempo appropriato (prima (0h) e 2h, 4h e 8h dopo iniezione dei LPS) eutanasia il mouse con la dose eccessiva di anestetico (isoflurano) seguito da dissanguamento e procedere con la dissezione.</li>
	<li>Tagliare la pelle e lo strato di muscolo esponendo la cavità addominale con organi interni con un paio di forbici.</li>
	<li>Accuratamente sezionare la milza, fegato e colon, pulire gli organi da grasso e tenerli in PBS sul ghiaccio.</li>
	<li>Tagliare un piccolo pezzo (circa 0,5 cm di lunghezza) da ogni organo utilizzando forbici o bisturi. Nota: È importante prendere sempre il pezzo da approssimativamente la stessa parte dell'organo in ogni mouse (stesso lobo del fegato, prossimale o distale parte del colon).</li>
	<li>Poco asciugare il tessuto su un pezzo di carta velina e inserirlo nel tubo di raccolta/omogeneizzazione assicurandosi che è completamente immerso nel reattivo di isolamento del RNA.</li>
	<li>Omogeneizzare il tessuto in un omogeneizzatore benchtop ad alta velocità. Per tessuti molli come milza, fegato e colon USA 1 ciclo di omogeneizzazione a velocità 6.00 per 30 s.</li>
	<li>Incubare i campioni per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Posizionare con attenzione il tubo nell'azoto liquido per congelare a scatto il tessuto lisato. Memorizzare lo snap congelato lisato a-80 ° C fino all'isolamento di RNA.</li>
</ol>5. RNA estrazione dal tessuto
Nota: I reagenti di isolamento del RNA, cloroformio ed alcoli sono considerati come materiale pericoloso. Eseguire l'estrazione di RNA sotto una cappa chimica. Utilizzare certificati RNAsi-libera reagenti ed apparecchiature per mantenere un ambiente RNAsi-libera.
<ol><li>
Separazione di fase
	<ol>
<li>Scongelare il lisato di tessuto congelato sul ghiaccio.</li>
		<li>Centrifugare il campione su 1.000 x g per 5 min a 4 ° C per appallottolare le rimanenti particelle di tessuto che potrebbero essere lasciate.</li>
		<li>Trasferire il surnatante in una provetta di nucleasi-free 1,5 mL nuovo.</li>
		<li>Aggiungere 200 cloroformio ghiacciata µ l per isolamento di RNA da 1 mL Reagente e agitare vigorosamente per 10-15 s.</li>
		<li>Incubare per 2-3 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugare a 12, 000 x g per 15 min a 4 ° C. Nota: Il campione ora conterrà 3 fasi: abbassare la fase di rosso fenolo-cloroformio, l'interfase e la fase acquosa incolore superiore. il RNA è presente nella fase acquosa superiore.</li>
		<li>Raccogliere la fase acquosa superiore (50% del volume totale) e il trasferimento in un nuovo tubo privo di nucleasi 1,5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Precipitazione di RNA
	<ol>
<li>Aggiungere 0,5 mL isopropanolo ghiacciata per reagente di isolamento del RNA 1 mL e mescolare delicatamente capovolgendo la provetta 5 - 6 volte.</li>
		<li>Incubare per 10-15 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugare a 12.000 x g per 10 min a 4 ° C. Nota: La pallina del RNA deve essere visibile in questa fase.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lavaggio della pallina del RNA
	<ol>
<li>Rimuovere completamente il supernatante contenente l'isopropanolo senza disturbare il pellet.</li>
		<li>Lavare la pallina con 1 mL di etanolo al 75% ghiacciata per 1 mL Reagente di isolamento del RNA utilizzato per la lisi iniziale.</li>
		<li>Vortexare il campione brevemente.</li>
		<li>Centrifugare il campione a 7.500 (o 12.000) x g per 5 min a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA di dissoluzione
	<ol>
<li>Rimuovere completamente l'etanolo nel surnatante senza disturbare il pellet.</li>
		<li>Lasciare il tubo aperto sotto la cappa chimica per 3-5 min asciugare il pellet di RNA a temperatura ambiente (non asciugare troppo come in questo caso sarà difficile da sciogliere RNA).</li>
		<li>Dissolva la pallina del RNA in acqua priva di nucleasi di 20-50 µ l pipettando attentamente su e giù.</li>
		<li>Incubare il campione a 55 ° C per 10-15 min migliorare ulteriormente la soluzione del RNA. Nota: In questa fase, RNA può essere conservato a-80 ° C fino a ulteriori analisi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. la digestione del DNA rimanente
<ol><li>Misurare la concentrazione di RNA con uno spettrofotometro pipettando lo spettrofotometro un'aliquota (2 µ l) e regolare la concentrazione consigliata.</li>
	<li>Avviare la digestione di contaminazione del DNA con max. 10 µ g RNA in acqua priva di nucleasi di 50 µ l.</li>
	<li>Aggiungere volume 0.1 di 10x dnasi Buffer e 1 µ l rDNase io per esempio e mescolare dolcemente pipettando su e giù.</li>
	<li>Incubare a 37 ° C per 20-30 min.</li>
	<li>Vortice della dnasi inattivazione reagente e aggiungere volume 0.1 al campione mescolando bene con la pipetta.</li>
	<li>Incubare per 5 min a temperatura ambiente mescolando occasionalmente a mano.</li>
	<li>Centrifugare a 10.000 x g per 1,5 min.</li>
	<li>Trasferire il surnatante contenente RNA DNA-free nel nuovo tubo privo di nucleasi.</li>
	<li>Misurare la concentrazione di RNA e la qualità mediante lo spettrofotometro.</li>
</ol>7. trascrizione inversa
<ol><li>Utilizzare un kit di trascrizione inversa (RT) del cDNA acido deossiribonucleico commercialmente disponibili per trascrizione inversa. Nota: Qui, fino a 2 µ g di RNA può essere invertito trascritto.</li>
	<li>Calcolare il volume, che contiene 2 µ g di RNA. Pipettare 2 µ g di RNA in una nuova provetta PCR.</li>
	<li>Aggiungere acqua priva di nucleasi al campione nella provetta PCR al volume finale di 10 µ l.</li>
	<li>Preparare 2 x Master Mix mescolando i seguenti componenti elencati nella tabella 2
</li>
	<li>Aggiungere 10 µ l 2 x Master Mix a 10 µ l RNA ottenere 1 x Master Mix nel volume totale di 20 µ l.</li>
	<li>Chiudere il tubo di reazione a catena (PCR) polimerasi e centrifugare il campione brevemente.</li>
	<li>Posizionare i campioni in un termociclatore PCR e impostare le impostazioni elencate nella tabella 3.</li>
	<li>Memorizzare il cDNA generato a-20 ° C per ulteriori analisi.</li>
</ol>8. quantitative PCR (qPCR)
<ol><li>Eseguire la reazione di qPCR con un kit disponibile in commercio.</li>
	<li>Self-progettare e testare gli iniettori introne-spanning, prima dell'uso, con differenti concentrazioni di cDNA di modello. Analizzare l'efficacia del primer creando una curva standard e utilizzare il primer con elevata efficacia e la corrette fusione curve. Nota: Le sequenze dei primer utilizzati in questo esperimento sono elencate nella tabella 2.</li>
	<li>Preparare la reazione (qPCR) reazione a catena della polimerasi quantitativa nella piastra 384 pozzetti con l'installazione di reazione designata nella tabella 4.</li>
	<li>Tenere tutte le soluzioni e la piastra sul ghiaccio con foglio di alluminio per evitare che la piastra di bagnarsi quando la miscela di reazione è preparata.</li>
	<li>Eseguire tutte le reazioni in triplici copie.</li>
	<li>Eseguire la reazione di PCR su un termociclatore usando l'impostazione riportata nella tabella 5.</li>
	<li>Calcolare il valore medio di Ct per tutte le reazioni dalle triplici copie. Normalizzare tutti i geni bersaglio per il livello di espressione di glycerinealdehyde-3-fosfato-deidrogenasi (Gapdh) gene housekeeping calcolando 2^(-ΔCt). Nota: Tutti i geni bersaglio con il Ct medio > 35 sono stati considerati sotto il limite di rilevazione.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo imita i processi immunologici che si verificano dopo l'invasione di prodotti microbici derivati. Fasi critiche all'interno del protocollo sono la selezione della riga del mouse, lo stato di igiene dei topi, la dose di LPS, il monitoraggio degli animali per l'avvenimento di endotossiemia e il punto di tempo dell'esperimento terminazione. La cosa più importante, il background genetico del ceppo del mouse deve essere considerato. Del mouse differenti ceppi hanno diversa suscettibilità ai LPS. Ad esempio, i...

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One of the authors&#39; names was corrected from:
Katarina Raduolovic
to:
Katarina Radulovic

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Erratum: Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach

L'intestino umano è colonizzato con un grande consorzio di microrganismi che forma il microbiota, che ha sviluppato un rapporto di reciproco beneficio con l'host durante l'evoluzione. In questo rapporto, l'host fornisce una nicchia sicura per il microbiota, considerando che il microbiota fornisce vitamine, digestione dei nutrienti e protezione dagli agenti patogeni per l'host, dove il microbiota si trova1. Quando questo rapporto vantaggioso tra l'host e il microbiota è disturbato, possono sviluppare malattie, come la malattia infiammatoria intestinale (IBD). IBD è una malattia infiammatoria cronica multifattoriale dell'intestino causata da fattori genetici e ambientali che si presentano in due forme principali, (CD) la malattia di Crohn e colite ulcerosa (UC). Nonostante le similitudini tra le due forme IBD, sono caratterizzati da alcune differenze nella posizione e nella natura delle modificazioni infiammatorie. CD è un disordine infiammatorio di ricaduta transmurale che potenzialmente possa estendere a qualsiasi parte del tratto gastrointestinale, mentre UC è non transmurale ed è limitato ai due punti. Inoltre, mutazioni in proteine Nucleotide-binding dominio contenenti oligomerizzazione 2 (NOD2), un recettore di riconoscimento di pattern (PRR) che riconosce muramil dipeptide (MDP), un componente della parete cellulare dei batteri Gram-positivi più e - negativi, è associata al CD2. Inoltre, Escherichia coli (Escherichia coli), Listeria e streptococchi e i loro prodotti sono stati tutti trovati all'interno dei macrofagi nei pazienti del CD che sono entrati nell'host dopo una barriera violazione3. Quando i batteri o loro prodotti immettono l'host durante lo sviluppo del CD, il sistema immunitario sviluppa una risposta che porta alla produzione di anticorpi anti-batterica4di circolazione. Forse, la prova più convincente per il ruolo del microbiota nella patogenesi delle IBD deriva da modelli murini. Quando gli animali sono trattati con antibiotici, o topi siano tenuti in germe-free (GF), la gravità della malattia è ridotta nella maggior parte dei modelli di colite, come in IL-10-/-topi che non sviluppano colite in GF strutture5,6. Inoltre, colite disturba anche la composizione del microbiota, che è caratterizzata da una composizione squilibrata e ridotto ricchezza chiamato disbiosi7. La conseguenza di IBD può essere un aumento della permeabilità intestinale che può portare all'ingresso di microbi e di prodotti derivati dal microbica nell'ospite.
Negli animali, l'applicazione di Destrano solfato di sodio (DSS) induce una violazione epiteliale intestinale che conduce a un aumento della permeabilità della barriera epiteliale8. Portale LPS le concentrazioni sono elevate in animali con DSS colite9. Interessante, gli animali carenti C tipo lectina recettore adesione intracellulare specifica molecola-3 afferrando nonintegrin 1 omologo-correlate (segno-R1) sono protetti da colite DSS e LPS indotta endotossiemia10. Per diffondere ulteriormente nell'ospite, batteri o batteri derivati prodotti devono superare la barriera vascolare11, cavità peritoneale, in cui si trova il piccolo e grande intestino, linfonodi mesenterici e/o il fegato12. Per ridurre la complessità di questo sistema, è stato usato un composto derivato batterico definito. LPS, che provoca endotossiemia dopo intraperitoneale (i.p.) o endovenosa (i.v.) iniezione13 è stato iniettato in topi, per studiare l'espressione delle interleuchine Il6 e Ilb e la citochina Tnfa in risposta ai LPS.
LPS è un pattern molecolare associati (PAMP) espresso come un componente della parete cellulare dei batteri gram-negativi, che consiste del lipide A (i PAMP principale nella struttura di LPS), un oligosaccaride di core e un O lato catena14. Recettore Toll-like 4 (TLR4) espresse da cellule dendritiche, macrofagi e cellule epiteliali riconosce LPS15, che richiede Co-recettori per associazione appropriata. La fase acuta LPS-proteina (LBP) si lega LPS per formare un complesso che trasferisce LPS al cluster di differenziazione 14 (CD14), una proteina di membrana ancorate glicosilfosfatidilinositolo. CD14 ulteriormente navette LPS per l'antigene del linfocita 96 o anche conosciuto come MD-2, che è associato con il dominio extracellulare di TLR4. L'associazione del LPS a MD-2 facilita la dimerizzazione di TLR4/MD-2 per indurre cambiamenti conformazionali di reclutare molecole intracellulari adattatore per attivare l'a valle segnalazione sentiero14, che comprende il primario di differenziazione mieloide gene di risposta 88 (MyD88) - via del dipendente e il TIR dominio contenenti adattatore-induzione dell'interferone-β (TRIF) - via dipendente16. Il riconoscimento dei LPS di TLR4 quindi attiva il pathway di NF-κB e induce l'espressione di citochine proinfiammatorie, come TNFα, IL-6 e IL-1 β17.
In particolare, quando LPS è iniettato in animali, la concentrazione di LPS dato agli animali, il background genetico dell'animale e la dieta deve essere considerato. Alte concentrazioni di LPS conduce ad uno shock settico, caratterizzato da ipotensione e guasti multipli dell'organo e infine a morte18. I topi sono meno sensibili ai LPS rispetto agli esseri umani, dove le concentrazioni di LPS tra 2-4 ng/kg di peso corporeo (BW) sono in grado di indurre una tempesta di citochina19. Per topi, la dose letale (LD50), che induce la morte in metà dei campi di topi da 10-25 mg/kg BW20 a seconda del ceppo del mouse utilizzato. Per i ceppi comunemente usati del mouse, C57Bl/6 e BALB/c, la dose letale 50% (LD50) è di 10 mg/kg di peso corporeo. Al contrario, i ceppi C3H/HeJ e C57BL/10ScCr sono protetti da LPS indotto endotossiemia, che è dovuta a mutazioni di Tlr421. Di conseguenza, topi carenti di Tlr4 sono iporeattivo per iniezioni con LPS22. Altre linee di topi geneticamente modificati per, ad esempio topi PARP1-/-23 sono resistenti a scossa tossica indotta da LPS.
Il modello del mouse descritto qui utilizza una dose subletale di LPS somministrato per via sistemica per simulare le conseguenze della diffusione di LPS dopo la violazione della barriera delle superfici del corpo. La concentrazione di LPS selezionata (2 mg/kg BW) non ha indotto mortalità in topi C56Bl/6, ma il rilascio indotto delle citochine pro-infiammatorie.

<table><tbody><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2x)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>Kit di trascrizione inversa del cDNA ad alta capacità,</td> <td>Applied Biosystems, Foster City, CA, USA</td><td>4368813</td><td></td></tr><tr><td>Set di DNasi senza RNasi,</td> <td>Qiagen, Hilden, Germania</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>LPS Escherichia coli O111:B4</td><td>Invivogen, San Diego, CA, USA.</td><td>tlrl-eblps</td><td></td></tr><tr><td>Omnican 50 Siringa da insulina monouso</td><td>B. Braun Melsungen, Melsungen, Germania</td><td>9151125</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent Technologie, Santa Clara, USA</td><td>non applicabile</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5430</td><td>Eppendorf, Amburgo, Germania</td><td>non applicabile</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Mikro 220R</td><td>Hettich, Kirchlengern, Germania</td><td>non applicabile</td><td></td></tr><tr><td>Strumenti di dissezione</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Germania</td><td>non applicabile</td><td></td></tr><tr><td>Fast-Prep-24 5G Sample Preparation System</td><td>M.P. Biomedicals, Santa Ana, CA, USA</td><td>non applicabile</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000</td><td>NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA</td><td>non applicabile</td><td></td></tr><tr><td>TRI Reagent</td><td>Zymo Research, Irvine, CA, USA</td><td>R2050-1</td><td></td></tr></tbody></table>

iniezioni di lipopolysaccharide in topi per simulare l'ingresso di prodotti microbici derivati dopo la violazione della barriera intestinale

Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach

La barriera epiteliale intestinale separa l'host dal microbiota che è normalmente tollerato o ignorato. La violazione di questo ostacolo provoca l'ingresso di batteri o di prodotti derivati da batteri nell'ospite, l'accesso alla circolazione di host e gli organi interni che conducono all'infiammazione incontrollata come osservato nei pazienti con malattia infiammatoria intestinale (IBD), che sono caratterizzati da una maggiore permeabilità epiteliale intestinale.
Per simulare l'ingresso di composti derivati batterici nell'ospite, un modello di endotoxemia è stato adottato in quali lipopolisaccaride (LPS), un componente della parete cellulare esterna dei batteri gram-negativi, sono state iniettate in topi. In questo studio, una dose subletale di LPS è stata iniettata intraperitonealmente ed i topi sono stati successivamente controllati per 8 h, utilizzando un punteggio di malattia. Inoltre, l'espressione i livelli delle citochine infiammatorie Il6, Il1b e Tnfa sono stati analizzati nella milza, fegato e colon di qPCR in diversi momenti dopo l'iniezione di LPS. Questo modello potrebbe essere utile per gli studi che coinvolgono la ricerca della risposta immunitaria dopo l'invasione di microrganismi o di prodotti derivati dal batterico causati da una violazione di barriera delle superfici del corpo.

Per simulare le conseguenze per l'host dopo l'ingresso di batteri o di prodotti derivati batterici che si verifica dopo la violazione della barriera intestinale, LPS è stato iniettato in topi C57Bl/6 in una dose subletale (2 µ g/g del peso corporeo). Ogni singolo mouse è stato monitorato e segnato con l'avvenimento di endotossiemia con parametri elencati nella scheda dei punteggi che include, l'aspetto dei topi, l'attività degli animali, la condizione degli occhi e il tasso di respirazion...

Qui è presentato un protocollo per simulare l'ingresso di composti derivati batterici dopo la violazione della barriera intestinale. Una bassa dose subletale di lipopolisaccaride è stata iniettata sistemica in topi, che sono stati monitorati per 24 h post-iniezione. L'espressione delle citochine pro-infiammatorie è stata determinata a parecchi punti di tempo nella milza, nel fegato e del colon.

Iniezioni di Lipopolysaccharide in topi per simulare l'ingresso di prodotti microbici derivati dopo la violazione della barriera intestinale

The intestinal epithelial barrier separates the host from the microbiota that is normally tolerated or ignored. The breach of this barrier results in the ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di presentare un modello che imiti l'ingresso di prodotti di derivazione microbica dopo una violazione della barriera intestinale. Questo modello può essere utilizzato per studiare le risposte immunitarie dopo l'invasione di microrganismi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle malattie infiammatorie intestinali, come l'infiammazione incontrollata, che è caratterizzata da un aumento della permeabilità epiteliale intestinale.Il vantaggio principale di questa tecnica è che non solo utilizza una pompa definita, ma è anche un approccio semplice che non richiede un intervento chirurgico e può essere utilizzato in ogni ambiente di laboratorio. A dimostrare la procedura saremo io, Rachel Mak'Anyengo, una postdoc, e Berna Kaya, una dottoranda. Maneggia il topo delicatamente ma con fermezza e trattieni l'animale con una mano.Assicurarsi che il mouse sia tenuto saldamente e possa respirare normalmente. Inclinare leggermente il naso del topo verso il pavimento per esporre l'addome per l'iniezione. Localizzare la linea mediana dell'addome e iniettare il volume di LPS richiesto nella parte inferiore sinistra o

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Qui descritto è una tecnica in cui viene iniettato lipopolisaccaride nella ghiandola mammaria topo lattazione tramite il beccuccio per simulare mastite, una condizione comunemente causata da infezione batterica. Risultati lipopolisaccaride iniezione in una maggiore fattore nucleare kappa B (NF-kB) di segnalazione, visualizzato attraverso l'imaging bioluminescente di NF-kB topo reporter della luciferasi.

Iniezione intraduttale di LPS come un modello murino di mastite: Segnalazione Visualizzato tramite un NF-kB Reporter transgenico

Fonte: Radulovic, K., et al. Iniezioni di lipopolisaccaridi nei topi per imitare l'ingresso di prodotti derivati da microbi dopo la rottura della barriera intestinale. J. Vis. Esp. (2018)Questo video mostra una procedura passo dopo passo per iniettare lipopolisaccaridi (LPS) nei topi intraperitonealmente per indurre infiammazione sistemica.

Iniezione intraperitoneale di lipopolisaccaride batterico nei topi per studiare le risposte immunitarie sistemiche

Questo video descrive la procedura per generare una sacca d'aria nel tessuto sottocutaneo dei topi e raccogliere essudati infiammatori in risposta alla somministrazione di lipopolisaccaridi in vivo. Questo video copre anche l'analisi dell'infiltrazione di neutrofili nella sacca d'aria.

Un modello murino Air Pouch per la raccolta dell'essudato infiammatorio indotto da lipopolisaccaridi

Il video dimostra l'induzione dell'encefalomielite autoimmune sperimentale in un modello murino iniettando una combinazione di glicoproteine oligodendrocitarie mieliniche e Mycobacterium tuberculosis inattivato. Il modello consente ai ricercatori di studiare i meccanismi della malattia e testare gli interventi terapeutici.

Induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale in un modello murino

Questo video dimostra il processo di induzione dell'interruzione della barriera emato-encefalica (BBB) e delle microemorragie cerebrali in un modello di ratto utilizzando lipopolisaccaride (LPS). Evidenzia la sequenza delle risposte immunitarie che portano ad un aumento della permeabilità della BBB e al conseguente danno al tessuto cerebrale.

Induzione di microemorragie cerebrali in un modello di ratto utilizzando lipopolisaccaride

In questo video, un modello murino di sclerosi multipla viene stabilito utilizzando l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE). Al topo viene iniettata un'emulsione contenente un peptide neuronale e un adiuvante, innescando una risposta immunitaria che attiva le cellule T autoreattive. Questo è seguito da un'iniezione di tossina della pertosse (PTX) per aumentare la permeabilità della barriera emato-encefalica, consentendo alle cellule T autoreattive di infiltrarsi nel cervello. Questa...

Fonte: Liou, C. et al. Somministrazione intracerebroventricolare di metaboliti microbici di origine intestinale in topi che si muovono liberamente. J. Vis. Exp. (2022).Questo video mostra l'iniezione intracranica di acidi grassi a catena corta (SCFA) in un topo che si muove liberamente per studiarne gli effetti sul comportamento mediato dal cervello. Una cannula iniettiva viene inserita in una cannula guida impiantata nel cervello del topo. Dopo il recupero, il topo si acclimata in una nuova...

Iniezione intracranica di metaboliti microbici derivati dall'intestino in un modello murino

Presentato qui è una procedura passo-passo per indurre lesioni polmonari acute nei topi mediante instillazione lipopolysaccharide intracheale diretta ed eseguire l'analisi FACS di campioni di sangue, liquido di lavaggio bronchoalveolar e tessuto polmonare. La minima invasività, la manipolazione semplice, la buona riproducibilità e la titolazione della gravità della malattia sono vantaggi di questo approccio.

Indurre lesioni polmonari acute nei topi mediante instillazione diretta del lipopolioaccaride intracheale

Qui, proponiamo un protocollo per la somministrazione di lipopolisaccaridi intratracheali (LPS) tramite intubazione endotracheale orofaringea non invasiva. Questo metodo riduce al minimo il trauma della procedura chirurgica per l'animale e fornisce accuratamente LPS alla trachea e quindi ai polmoni.

Instillazione di lipopolisaccaridi intratracheali non invasivi nei topi

Qui descriviamo la costruzione di un sistema modello di linea cellulare intestinale tridimensionale (3D) di base e un protocollo di inclusione della paraffina per la valutazione microscopica ottica di equivalenti intestinali fissi. La colorazione di proteine selezionate consente l'analisi di più parametri visivi da un singolo esperimento per un potenziale utilizzo in studi preclinici di screening farmacologico.

Sistema modello intestinale tridimensionale (3D) di base con una componente immunitaria

In questo studio, una tecnica di instillazione endotracheale non invasiva è dimostrata per sviluppare l'ALI nei ratti utilizzando un laringoscopio di base per garantire una precisa somministrazione di LPS ai polmoni. La LPS viene immessa tramite un tubo endotracheale tramite un laringoscopio. L'entità della lesione polmonare viene valutata in più momenti temporali.

Somministrazione endotracheale non invasiva di lipopolisaccaridi per indurre lesioni polmonari acute nei roditori

Impara a simulare l'ingresso di prodotti microbici dopo la violazione della barriera intestinale mediante iniezione di lipopolisaccaride in topi. Questo metodo permette di studiare le risposte immunitarie e i meccanismi dell'infiammazione nelle malattie infiammatorie intestinali.

Iniezioni di Lipopolysaccharide in topi per simulare lingresso di prodotti microbici derivati dopo la violazione della barriera intestinale (Video) | JoVE Journal

Iniezioni di Lipopolysaccharide in topi per simulare l'ingresso di prodotti microbici derivati dopo la violazione della barriera intestinale

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