Name: Impatto dei neuroni intracardiaci elettrofisiologia cardiaca e aritmogenesi in un sistema di Langendorff Ex Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Scopri come analizzare il sistema nervoso autonomo intracardiaco e la sua influenza sull'elettrofisiologia, l'aritmogenesi e le dinamiche del cAMP in cuori decentralizzati utilizzando un setup Langendorff ex vivo.

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Gli autori vorrei ringraziare Hartwig Wieboldt per la sua ottima assistenza tecnica e l'UKE microscopia Imaging Facility (Umif) della University Medical Center Hamburg-Eppendorf per fornire supporto e microscopi. Questa ricerca è stata finanziata bythe Förderverein des Universitären Herzzentrums Hamburg e.V. e di DZHK (centro tedesco per la ricerca cardiovascolare) [FKZ 81Z4710141].

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dalle autorità locali, di stato di Amburgo, la cura degli animali Università di Amburgo e comitati di uso.
1. preparazione dell'apparato di Langendorff
Nota: Viene utilizzato un sistema di perfusione di Langendorff commercialmente disponibile.
<ol><li>Preparare una soluzione modificata di Krebs-Henseleit (119 mM di cloruro di sodio, 25mm di bicarbonato di sodio, 4,6 mM di cloruro di potassio, 1,2 millimetri di fosfato di potassio monobasico, 1,1 mM di solfato di magnesio, 2,5 mM di cloruro di calcio, 8,3 di glucosio e 2 mM di sodio piruvato). Aggiungere una miscela di anidride carbonica oxygen/5% 95% per la soluzione di perfusione per impedire la precipitazione del calcio. Filtrare il buffer con una dimensione dei pori di 0,22 µm.</li>
	<li>Aggiungere un agente farmacologico il buffer per studiare il suo effetto sulla elettrofisiologia cardiaca e aritmogenesi come necessario.</li>
	<li>Avviare la vasca di acqua e mettere la soluzione di perfusione tra cui una miscela di anidride carbonica 95% oxygen/5% in esso. Regolare la temperatura del bagno d'acqua, in modo che la temperatura della soluzione di perfusione direttamente prima la cannula è ~ 37 ˚ c.</li>
	<li>Avviare la pompa roller e riempire l'apparecchio con la soluzione di perfusione, non appena viene raggiunta la temperatura corretta.</li>
	<li>Regolare la portata pompa prima di fissare il cuore, in modo che bolle d'aria non vengono lasciati nella cannula montando all'apparato.</li>
</ol>2. hard - e Software di preparazione
<ol><li>Collegare un sistema di acquisizione dati digitali e il relativo software corrispondente all'apparato di Langendorff per una registrazione continua di aspersione pressione, portata e frequenza cardiaca.<ol>
<li>Impostare la pressione di perfusione mirati nelle impostazioni generali a 80 mmHg.</li>
		<li>Avviare la registrazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzare un catetere di elettrofisiologia (Tabella materiali) con elettrodi di platino, una superficie dell'elettrodo di 0.5 x 0.5 mm e una spaziatura di elettrodo di 0,5 mm per la registrazione dei dati e la stimolazione con un generatore di stimolo digitale designato.<ol>
<li>Posizionare il catetere vicino alla zona dove il cuore verrà posizionato dopo l'allegato all'apparecchio.</li>
		<li>Preparare la stimolazione selezionando 2 elettrodi dal catetere e utilizzare una lunghezza di ciclo di 100 ms.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparazione del cuore
<ol><li>Aggiungere il freddo (~ 2-4 ˚ c) buffer di aspersione (10-20 mL e 40-50 mL, affinché l'intera pietanza è coperto) per i 2 piatti Petri (diametro di 6 cm e 10 cm) e il piatto con la cannula e posto loro il ghiaccio direttamente successiva e sotto il microscopio. Preparare un doppio nodo intorno la cannula.</li>
	<li>Accise rapidamente il cuore dopo dislocazione cervicale con l'apertura del torace utilizzando Mayo forbici e pinze modello stretto. Poi afferrare l'aorta e la vena cava sopra il diaframma usando il forcipe di Londra e asportare il blocco cuore-polmoni tagliando tutti i vasi sanguigni e del tessuto connettivo vicino alla colonna vertebrale con le forbici di strabismo.</li>
	<li>Trasferire il blocco cuore-polmoni nel primo piatto (6 cm di diametro) riempito con il buffer ghiacciato e con attenzione rimuovere i polmoni senza danneggiare il cuore utilizzando strabismo forbici e pinze di Londra. Poi mettete il cuore sotto il microscopio e rimuovere con cautela il timo, l'esofago e trachea utilizzando forbici di primavera e forcipe Dumont SS.</li>
	<li>Utilizzare le forbici di primavera per praticare un foro di 1,5-2 mm nella parte superiore dell'atrio destro per l'inserimento del catetere. Praticare un foro nell'arteria polmonare. Quindi tagliare l'aorta direttamente sotto i rami di supraaortic e rimuovere il tessuto dall'aorta, in modo che il nodo può essere collegato facilmente.</li>
	<li>Tenere i cuscinetti adiposi atriali, comprese le principali atrially trova ganglionated plexi, intorno all'atrio sinistro intatto o rimuoverli completamente da dissezione accurata.</li>
	<li>Trasferire il cuore al piatto con la cannula e posizionarlo sotto il microscopio. Accostare l'aorta la cannula con il forcipe Dumont SS e legare il nodo preparato strettamente intorno all'aorta. Assicurarsi che la cannula non è collocata troppo in profondità nell'aorta, in modo che la valvola aortica e le arterie coronariche sono lasciate liberi.</li>
	<li>Collegare la cannula rapidamente all'apparato di Langendorff. Assicurarsi che non vi siano nessun bolle lasciato nella cannula.</li>
	<li>Passare la pressione di perfusione a 80 mmHg, permettendo un'aspersione di pressione costante.</li>
	<li>Inserire con cautela il catetere in atrio destro e ventricolo destro senza toccare o danneggiare il cuore e fissare il catetere alla cannula con nastro adesivo.</li>
	<li>Iniziare la stimolazione con la lunghezza di ciclo di preparati di 100 ms per un periodo di equilibrazione iniziale 20 min.</li>
	<li>Chiudere la camera per consentire una temperatura stabile.</li>
</ol>4. aritmogenesi e parametri elettrofisiologici
<ol><li>Applicare una stimolazione programmate tramite gli elettrodi distale o prossimale del catetere a due volte l'atriale o ventricolare Soglia pacing per valutare i parametri elettrofisiologici come descritto nei passaggi seguenti.<ol>
<li>Determinare il tempo di recupero del nodo del seno come la lunghezza del ciclo di ritorno massimo dopo 10 s di ritmo a una lunghezza di ciclo S1S1 di 120 ms, 100 ms e 80 ms a tasso fisso.</li>
		<li>Determinare il punto del Wenckebach come la più lunga durata del ciclo S1S1 (8 stimoli; S1S1: 100 ms; riduzione graduale di 2 ms) con una perdita di conduzione nodale AV 11. Determinare i periodi refrattari nodali atrioventricolari come la più lunga S1S2 (12 stimoli; S1S1: 120 ms, 110 ms e 100ms; una corta accoppiato extrastimulus con una riduzione di S1S2 graduale di 2 ms) con una perdita di conduzione nodale di avoirdupois.</li>
		<li>Determinare i periodi refrattari atriali e ventricolari come la più lunga S1S2 (12 stimoli; S1S1: 120 ms, 110 ms e 100ms; una corta accoppiato extrastimulus con una riduzione di S1S2 graduale di 2 ms) con una risposta ventricolare o atriale assente10,11.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire un extrastimulation programmata (S1S1: 120 ms, 100 ms e ms 80, seguita da fino a 3 battiti extra; 60-20 ms con una riduzione graduale di 2 ms) o scoppio protocolli di stimolazione (5 s a S1S1: 50-10 ms con una riduzione graduale di 10 ms) in linea con le convenzioni di Lambeth da eva preso le ventricolare aritmogenesi10,11,12.</li>
</ol>5. dell'epicardio conduzione misure
Nota: Registrare unipolare dell'epicardio elettrogrammi utilizzando un sistema di registrazione 128 canali, computer-assistita con una frequenza di campionamento di 25 kHz per la mappatura ad alta risoluzione. Utilizzare una matrice multi-elettrodo 32 (MEA; Inter-elettrodo distanza: 300 µm; 1.8 x 1.8 mm). Nota che i dati sono stati filtrati passa banda (50 Hz) e digitalizzati con 12 bit e una gamma di segnale di 20 mV.
<ol><li>Inserire il MEA nell'area designata del cuore e aggiungere la messa a terra per un'altra parte del cuore13,14,15.</li>
	<li>Posizionare un catetere di stimolazione dell'epicardio vicino la MEA e iniziare una stimolazione costante.</li>
	<li>Avviare la registrazione dopo la conferma del buon contatto degli elettrodi controllando la qualità del segnale e l'ampiezza.</li>
	<li>Utilizzare un'analisi non in linea per la determinazione della velocità di propagazione dell'onda e dispersione in direzione di conduzione.</li>
</ol>6. Förster Resonance Energy Transfer FRET-base ciclica monofosfato di adenosina (accampamento) Imaging
Nota: Per le misure basate su FRET, raccogliere cuori dal CAG-Epac1-accampamenti topi transgenici16.
<ol><li>Utilizzare un sistema di imaging auto-costruito intorno un stereomicroscopio15,17.</li>
	<li>Posizionare lo stereomicroscopio davanti al cuore e regolarlo per acutezza.</li>
	<li>Eccitare il sensore per l'AMPc con una fonte di luce [ad esempio, utilizzare una singola lunghezza d'onda diodo luminescente (440 nm)]. Dividere l'emissione di luce nel donatore e accettore canali utilizzando un divisore di fascio (per una coppia di proteina fluorescente ciano/giallo fluorescente proteine, uso un 565dcxr specchio dicroico e filtri di emissione D480/30 e D535/40).</li>
	<li>Garantire una temperatura stabile mettendo un involucro di plastica intorno alla camera.</li>
	<li>Prendere immagini utilizzando una fotocamera di complementary metal-oxide-semiconductor scientifica (sCMOS). Coordinare la sorgente luminosa e la telecamera cattura di immagine con un open source software come Micro-Manager di imaging.</li>
	<li>Per avviare l'acquisizione dell'immagine, spingere la Multi-D Acq. pulsante e impostare un time-lapse, che acquisisce un'immagine ogni 10 s, con il tempo di esposizione appropriato, che dipende dalla forza del segnale fluorescente (circa 100 ms).</li>
	<li>Uso il precedentemente descritto e disponibile FRET online e FRET online 2 plugin17 per dividere l'immagine in due canali, selezionare le regioni di interesse e monitorare l'analisi del rapporto.</li>
	<li>Durante l'acquisizione, irrorare il cuore con la soluzione modificata di Krebs-Henseleit che contiene diverse sostanze, a seconda della natura dell'esperimento.</li>
	<li>Alla fine dell'esperimento, spegnete l'acquisizione premendo il tasto Stop e salvare nello stack di immagini.</li>
	<li>Analizzare i dati FRET offline utilizzando un software di analisi dedicato che può dividere le immagini in due sezioni identiche per i canali di donatore e accettore ed esegue analisi FRET in più regioni di interesse. Nota: Una dedicata plug-in (FRET non in linea) è necessaria, che viene fornito in Sprenger et al. 17.<ol>
<li>Avviare il software. Apri l'analisi accedendo al menu plugin , quindi fare clic su MicroManagere poi su Apri File di Micro-Manager.</li>
		<li>Eseguire il plugin FRET non in linea al fine di dividere il time-lapse in due immagini identiche per i canali di PCP e YFP.</li>
		<li>Utilizzare lo strumento di Selezione a mano libera per contrassegnare la regione di interesse nell'immagine YFP. Premere il pulsante Aggiungi per aggiungere la selezione alla finestra Multi misura .</li>
		<li>Scegliete la regione di interesse nella finestra Multi misura e premere Multi per ottenere una tabella con i valori medi di grigio per ogni fotogramma e la regione. Copiare e incollare tutti i dati in un foglio di Excel.</li>
		<li>Fare clic sulla serie di immagini di PCP. Eseguire le stesse azioni come nel passaggio 6.10.4 per lo stack di PCP e incollare i valori medi di grigio lo stesso foglio di Excel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Correggere i dati non elaborati non in linea per il fattore di trapasso del donatore nell'accettore canale17.<ol>
<li>Utilizzare la seguente formula, dove B è il fattore di trapasso: Rapporto = (YFP - B x CFP) / PCP</li>
		<li>Determinare il fattore di trapasso B da imaging un cuore solo esprimendo la PCP e misurare la percentuale di fluorescenza donatore nel canale YFP (B = YFP / CFP).</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Neuromorphology
Nota: Analizzare il sistema nervoso autonomo intracardiaco utilizzando intero-monta immunostainings del cuore murino intatto. Si noti che la maggior parte dei gangli intracardiaci è localizzata nel tessuto adiposo epicardico vicino alle vene polmonari.
<ol><li>Utilizzare diverse colorazioni per la raffigurazione di neurofilament (generale strutture neuronali; pollo anti-NF-H, 1:3, 000), tirosina idrossilasi (TH, strutture di un neurone simpatici; coniglio α TH, 1:1, 000) e la colina acetiltransferasi (ChAT, parasimpatico strutture di un neurone; capra α ChAT, 01:50).</li>
	<li>Dopo l'aspersione nell'apparato di Langendorff, difficoltà i cuori di topo in 10 mL di formalina per 24 h e memorizzarli in tampone fosfato salino (PBS) a 4 ˚ c.</li>
	<li>Candeggina i cuori in candeggina di Dent (4:1:1 metanolo: soluzione di perossido di idrogeno 30% (w/w) in H2o: il solfossido dimetilico (DMSO)) per 1 settimana a 4 ˚ c e reidratare successivamente a PBS in una serie di discendenti di metanolo in PBS (100%, 75%, 50%, 25%; 1h ciascuna) 18.</li>
	<li>Eseguire le seguenti incubazioni in un formato di piastra a 24 pozzetti con una movimentazione delicata a 4 ˚ c:<ol>
<li>Permeabilize i cuori nel 1% Triton X-100/PBS (PBS-T) per 3 x 1 h a temperatura ambiente prima di bloccare loro durante la notte in un tampone bloccante [5% albumina di siero bovino (BSA) / PBS-T + 0,2% sodio azide].</li>
		<li>Diluire gli anticorpi come segue: capra α ChAT (01:50), coniglio α TH (1:1, 000), neurofilament di pollo α (1:3, 000); anticorpi secondari per la etichettatura fluorescente (1: 500; o secondo le istruzioni del produttore); gli anticorpi secondari biotinilati per etichettatura cromogenico (1: 200; o secondo le istruzioni del produttore).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubare i campioni in anticorpi primari diluiti in un tampone bloccante per 1 settimana a 4 ˚ c.</li>
	<li>Lavare i cuori per 3 x 15 min in PBS-T prima l'incubazione anticorpo secondario in un tampone bloccante per 4 giorni.</li>
	<li>Lavare i cuori per 3 x 15 min in PBS-T e memorizzarli in un mezzo di montaggio per la colorazione fluorescente per 3 h a temperatura ambiente o utilizzare un kit di rilevazione complesso avidina-biotina secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Pre-Incubare i cuori per 1h in un buffer commerciale per 3, 3'-diaminobenzidina (DAB), prima di sviluppare loro sotto un controllo visivo in un buffer contenente DAB secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Conservare i campioni in doppio acqua distillata.</li>
	<li>Per sezioni di paraffina, disidratare e incorporare i cuori in paraffina.<ol>
<li>Tagliare sezioni spesse 4-µm e deparaffinizzare li secondo le procedure di routine del laboratorio. Se e come ricupero dell'antigene deve essere eseguita deve essere stabilito per ogni singolo programma di installazione, poiché esso dipende dalla combinazione dell'anticorpo.</li>
		<li>Permeabilize le sezioni per 10 min a 0,2% Triton X-100/Tris-buffered saline (TBS), seguita da 3 x 5 min lavaggi in TBS.</li>
		<li>Bloccarli con 3% BSA/TBS per 1 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubare per una notte a 4 ˚ c [anticorpi primari: capra α ChAT (01:50), coniglio α TH (1: 500), pollo neurofilamento α (1:1, 000)] o a 2 h a temperatura ambiente (fluorescenza-etichettato anticorpi secondari, 1: 500) in 1% BSA/TBS con 3 x 5 min lava TBS in mezzo.</li>
		<li>Aggiungere 1 µ g/mL di bisbenzimide H33342 triidrocloruro per la soluzione di anticorpo secondario o utilizzare un diverso metodo di macchiatura nucleare.</li>
		<li>Montare i vetrini in un mezzo di montaggio per la colorazione fluorescente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Ajijola, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmentation+of+cardiac+sympathetic+tone+by+percutaneous+low-level+stellate+ganglion+stimulation+in+humans%3A+a+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Augmentation of cardiac sympathetic tone by percutaneous low-level stellate ganglion stimulation in humans: a feasibility study.</a> Physiological Reports. 3 (3), e12328(2015).</li>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In questo manoscritto, sistema di perfusione la Langendorff ben noto ex vivo cuore è presentato come uno strumento per studiare l'impatto dei neuroni intracardiaci elettrofisiologia cardiaca e aritmogenesi utilizzando mapping diverso e tecniche di stimolazione inclusi gli approcci endocardial e dell'epicardio.
Parecchie parti del protocollo sono cruciali per l'installazione. In primo luogo, è importante utilizzare una tecnica di preparazione in cui i cuscinetti adiposi atriali rimango...

Il sistema di perfusione Langendorff ex vivo cuore continua ad essere uno strumento rilevante per l'esecuzione di un ampio spettro di fisiologici, biochimici, morfologici e studi farmacologici in centrale denervato cuori1,2 ,3,4,5 sin dalla sua invenzione nel tardo 19th secolo6. Ad oggi, questo sistema è ancora ampiamente usato per vari argomenti (ad es., ischemia riperfusione) o per lo studio cardiaco farmacologico effetti7,8ed è uno strumento fondamentale nella ricerca cardiovascolare. La longevità di questo metodo risultati da diversi vantaggi (ad es., le misure sono eseguite senza l'influenza del sistema nervoso centrale o altri organi, la circolazione sistemica o ormoni circolanti). Se necessario, prodotti farmaceutici possono essere aggiunto in modo controllato il buffer di aspersione o applicati direttamente alle strutture specifiche. Gli esperimenti sono riproducibili, e un numero relativamente elevato di esperimenti può essere eseguito in un breve periodo di tempo. La natura aperta (in parte) dell'installazione può rendere difficile la regolazione della temperatura e deve essere presa in considerazione. Anche se il sistema di Langendorff è utilizzato anche in più grandi specie9, animali più piccoli vengono utilizzati principalmente come la messa a punto sperimentale è meno complesso e una maggiore variabilità biologica (ad es., transgenici modelli murini) può essere utilizzato.
Nel setup sperimentale del presente protocollo, è l'influenza del sistema nervoso autonomo intracardiaco su parametri elettrofisiologici di base, aritmogenesi ventricolare, conduzione dell'epicardio e dinamiche dell'adenosina monofosfato ciclico (cAMP) valutati. Un gran numero di gangli intracardiaci, che sono situate principalmente nei cuscinetti adiposi atriali e si sono affermati per il controllo indipendente dal controllo neurale centrale di elettrofisiologia cardiaca, è che sia lasciato intatto o manualmente rimosso con attenzione meccanica dissezione. Una modulazione farmacologica del sistema nervoso autonomo viene eseguito a livello globale con l'aggiunta di prodotti farmaceutici nel buffer di aspersione o localmente da modulazione mirata dei gangli atriali. Dopo gli esperimenti, i cuori sono adatti per una valutazione immunohistological come tutte le cellule del sangue sono stati rimossi a causa di aspersione di continuo, che può aumentare la qualità della colorazione.
L'obiettivo generale delle tecniche descritte è di offrire nuove prospettive per gli studi dettagliati per quanto riguarda l'impatto del sistema nervoso autonomo sulla elettrofisiologia cardiaca e aritmogenesi nel cuore del mouse. Un motivo per utilizzare questa tecnica è che è possibile studiare e alterare il sistema nervoso autonomo senza l'impatto del sistema nervoso centrale. Uno dei principali vantaggi è l'occupazione facile degli esperimenti farmacologici, in quali potenziali proprietà pro - o antiaritmico di vecchi e nuovi agenti possono essere testati. Inoltre, modelli murini transgenici e knockout di varie malattie cardiache sono disponibili per studiare i meccanismi alla base di aritmie, infarto o malattie metaboliche. Questo approccio ha migliorato la nostra comprensione di come il sistema nervoso autonomo a livello atriale possono avere un impatto elettrofisiologia cardiaca ventricolare e l'induzione di aritmie.

<table><tbody><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>Soluzione di Krebs-Henleit modificata</td></tr><tr><td>Idrogenocarbonato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>401676</td><td>Soluzione di Krebs-Henleit modificata</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>Soluzione di Krebs-Henleit modificata</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>Krebs-Henleit modificato soluzione</td></tr><tr><td>Solfato di magnesio eptaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td>Soluzione di Krebs-Henleit modificata</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td>Soluzione di Krebs-Henleit modificata</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>Soluzione di Krebs-Henleit modificata</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio bioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8574</td><td>Krebs-Henleit modificato soluzione</td></tr><tr><td>Carbogen (95% O2 / 5% CO2)</td><td>SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germania</td><td>Soluzione Krebs-Henleit</td><td></td>modificata</tr><tr><td>Filtro sterile steritop-GP 0,22</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td>Soluzione di Krebs-Henleit modificata</td></tr><tr><td>Atropina solfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0257</td><td>Neuromodulazione</td></tr><tr><td>Cloruro di esametonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2138</td><td>Neuromodulazione</td></tr><tr><td>Base senza nicotina 98-100%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3876</td><td>Neuromodulazione</td></tr><tr><td>Soluzione di formalina tamponata neutra 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>Colorazione a montaggio intero</td></tr><tr><td>Tris(idrossimetil)amminometano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859</td><td>Colorazione a montaggio intero</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>Colorazione a montatura intera</td></tr><tr><td>Soluzione di perossido di idrogeno al 30% (p/p) in H2O</td><td>Merck, KGA, Darmstadt, Germania</td><td>H1009</td><td>Colorazione a montatura intera</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Merck, KGA, Darmstadt, Germania</td><td>D8418</td><td>Colorazione a montatura intera</td></tr><tr><td>Compresse saline tamponate con fosfato</td><td>Gibco / Invitrogen</td><td>18912-014</td><td>Colorazione a montatura intera</td></tr><tr><td>Triton-x-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Colorazione a montatura intera</td></tr><tr><td>Albumina frazione bovina V</td><td>Biomol, Amburgo, Germania</td><td>11924.03</td><td>Colorazione a montatura intera</td></tr><tr><td>Pollo anti neurofilamento</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5539</td><td>Colorazione a montatura intera</td></tr><tr><td>Coniglio anti tirosina idrossilasi</td><td>EMD Millipore</td><td>AB152</td><td>Colorazione a montatura intera</td></tr><tr><td>Capra anti colina acetiltransferasi</td><td>EMD Millipore</td><td>AP144P</td><td>Colorazione a montatura intera</td></tr><tr><td>Asino e alfa coniglio IgG Alexa 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td>Colorazione a montatura intera</td></tr><tr><td>Asino e alfa; capra IgG Alexa 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11057</td><td>Colorazione a montatura intera</td></tr><tr><td>Asino e pollo IgY Alexa 647</td><td>Merck, KGA, Darmstadt, Germania</td><td>AP194SA6</td><td>intera colorazione per montatura</td></tr><tr><td>Asino e alfa coniugati con biotina igG</td><td>R& D Systems</td><td>AP182B</td><td>Colorazione a montatura intera</td></tr><tr><td>IgG d'asino e capra coniugati con biotina</td><td> D Systems</td><td>AP192P</td><td>Colorazione a montaggio intero Biotina</td></tr><tr><td>coniugata capra e pollo igY</td><td>R& D Systems</td><td>BAD010</td><td>Colorazione a montaggio intero</td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio Vectashield</td><td>Laboratori vettoriali, Burlingame, CA, USA</td><td>H-1000</td><td>Immunoistochimica</td></tr><tr><td>Kit Vectastain ABC</td><td>Laboratori vettoriali, Burlingame, CA, USA</td><td>PK-4000</td><td>Immunoistochimica</td></tr><tr><td>Steady DAB/Plus</td><td>Abcam plc, Cambridge, Regno Unito</td><td>ab103723</td><td>Colorazione a montaggio intero</td></tr><tr><td>HistoClear</td><td>DiaTec, Bamberg, Germania</td><td>HS2002</td><td>Immunoistochimica</td></tr><tr><td>BisBenzimide H33342 tricloridrato (Hoechst)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>B2261</td><td>Immunoistochimica</td></tr><tr><td>Vectashield HardSet terreno di montaggio</td><td>Laboratori vettoriali, Burlingame, CA, USA</td><td>VEC-H-1400</td><td>Immunoistochimica</td></tr><tr><td>Sistema di perfusione</td><td>HUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germania</td><td>&nbsp; 73-4343</td><td>Apparecchio Langendorff</td></tr><tr><td>Sistema di acquisizione dati e software corrispondente per catetere e parametri fisiologici</td><td>Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, Nuova Zelanda</td><td>PL3508 PowerLab 8/35</td><td>Langendorff</td></tr><tr><td>setup Catetere ottagopolare</td><td>CIB' ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA</td> configurazione <td>personalizzata</td><td>Langendorff</td></tr><tr><td>generatore di stimolo</td><td>STG4002, sistemi multicanale, Reutlingen, Germania</td><td>STG4002-160&micro; A</td><td>Configurazione della stimolazione</td></tr><tr><td>Software di stimolazione</td><td>Sistemi multicanale, Reutlingen, Germania</td><td>MC_Stimulus II</td><td>Configurazione della stimolazione</td></tr><tr><td>Sistema di acquisizione dati e software corrispondente per elettrogrammi epicardici</td><td>ME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germania</td><td>USB-ME128-System</td><td>MEA setup</td></tr><tr><td>Multi-Electrode</td><td>Array MEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germania</td><td>EcoFlexMEA36</td><td>Configurazione MEA</td></tr><tr><td>Software di registrazione di array multi-elettrodo</td><td>Sistemi multicanale, Reutlingen, Germania</td><td>MC_Rack</td><td>Configurazione MEA</td></tr><tr><td>Forbici a molla</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germania</td><td>15003-08</td> Forbici per strabismo <td>per la preparazione del cuore</td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germania</td><td>14575-09</td> Mayo per <td>la preparazione del cuore</td></tr><tr><td> Forbici</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germania</td><td>14110-15</td><td>Preparazione del cuore</td></tr><tr><td>Dumont SS Forceps</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germania</td><td>11203-25</td><td>Preparazione del cuore</td></tr><tr><td>London Forceps Fine</td><td>Science Tools GmbH, Heidelberg, Germania</td><td>11080-02</td><td>Preparazione del cuore</td></tr><tr><td>Narrow Pattern Forceps</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germania</td><td>11003-13</td><td>Preparazione del cuore</td></tr><tr><td>Involucro di plastica</td><td>Parafilm M, Bemis NA, con sede a Neenah, WI, Stati</td><td></td> Uniti <td>Materiali di consumo</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germania</td><td></td><td>FRET</td></tr><tr><td>LED</td><td>CoolLED, Andover, Regno Unito<</td><td>em>pE-100</td><td>FRET</td></tr><tr><td></td><td>DualView Photometrics, Tucson, AZ, USA</td><td>DV2-SYS</td><td>FRET</td></tr><tr><td>Set di filtri DualView</td><td>Photometrics, Tucson, AZ, USA</td><td>05-EM</td><td>FRET</td></tr><tr><td>optiMOS fotocamera CMOS scientifica</td><td>Qimaging, Surrey, BC, Canada</td><td>01-OPTIMOS-R-M-16-C</td><td>Software di imaging FRET</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Micro-Manager; Vale Lab, Università della California San Francisco, CA, USA</td><td></td> Software di analisi <td>FRET</td></tr><tr><td></td><td>Software Image J; Pubblico dominio, NIH, USA</td><td></td><td>FRET</td></tr></tbody></table>

impatto dei neuroni intracardiaci elettrofisiologia cardiaca e aritmogenesi in un sistema di langendorff ex vivo

Impact of Intracardiac Neurons on Cardiac Electrophysiology and Arrhythmogenesis in an Ex Vivo Langendorff System

Sin dalla sua invenzione nel tardo 19° secolo, il sistema di perfusione Langendorff ex vivo cuore continua ad essere uno strumento rilevante per lo studio di un ampio spettro di parametri fisiologici, biochimici, morfologici e farmacologici in cuore centrale denervato. Qui, descriviamo una configurazione per la modulazione del sistema nervoso autonomo intracardiaco e la valutazione della sua influenza su base elettrofisiologia, aritmogenesi e le dinamiche dell'adenosina monofosfato ciclico (cAMP). Il sistema nervoso autonomo intracardiaco è modulato da dissezione meccanica di grasso atriale pastiglie-in cui gangli murini si trovano principalmente — o dall'utilizzo degli interventi farmacologici globali, nonché mirati. Un catetere elettrofisiologici di octapolar è stato introdotto in atrio destro e ventricolo destro, e dell'epicardio-disposto multi-elettrodo matrici (MEA) per la mappatura ad alta risoluzione vengono utilizzate per determinare aritmogenesi ed elettrofisiologia cardiaca. Trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) imaging viene eseguito per il monitoraggio in tempo reale dei livelli di cAMP in diverse regioni cardiache. Neuromorphology è studiato per mezzo di anticorpo-basato colorazione dei cuori interi usando marcatori neuronali per guidare l'identificazione e la modulazione degli obiettivi specifici del sistema nervoso autonomo intracardiaco negli studi eseguiti. L'impostazione di Langendorff ex vivo permette per un elevato numero di esperimenti riproducibili in breve tempo. Tuttavia, la natura in parte aperta del setup (ad es., durante le misurazioni MEA) rende difficile il controllo costante della temperatura e deve essere mantenuto al minimo. Questo metodo descritto rende possibile analizzare e modulano il sistema nervoso autonomo intracardiaco nei cuori decentralizzati.

La figura 1 Mostra un'immagine dell'installazione Langendorff comprese 2 matrici multi-elettrodo (MEA). Prima dell'esperimento, il catetere intracardiaco è posizionato vicino la cannula per facilitare una rapida e facile inserimento nel ventricolo di destra atrio/destra e garantire un breve periodo di tempo fino a quando l'equilibrazione può iniziare. La parte inferiore della camera può essere intensificata (vedere le frecce nella Figura ...

Qui, presentiamo un protocollo per la modulazione del sistema nervoso autonomo intracardiaco e la valutazione della sua influenza su base elettrofisiologia, aritmogenesi e accampamento dinamica utilizzando un'installazione di Langendorff ex vivo .

Impatto dei neuroni intracardiaci elettrofisiologia cardiaca e aritmogenesi in un sistema di Langendorff Ex Vivo

Since its invention in the late 19th century, the Langendorff ex vivo heart perfusion system continues to be a relevant tool for studying a broad spectrum ...

L'obiettivo generale di questa configurazione di Langendorff ex vivo è quello di analizzare e modulare il sistema nervoso autonomo intracardiaco e valutare la sua influenza sull'elettrofisiologia di base, l'aritmogenesi e la dinamica del cAMP nei cuori decentralizzati. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente ai ricercatori di analizzare e modulare il sistema nervoso intracardiaco nei cuori decentralizzati. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui cuori sani, abbiamo ottenuto la prova iniziale che questo approccio può essere utilizzato anche per studiare varie forme di cardiopatia strutturale.Inizia avviando il bagno d'acqua e inserendo la soluzione di perfusione che include una miscela di ossigeno al 95% e anidride carbonica al 5%. Quindi, regolare la velocità della pompa prima di collegare il cuore, in modo che non rimangano bolle d'aria nella cannula durante il montaggio sull'apparecchio. Impostare la pressione di perfusione target su 80 millimetri di mercurio nelle impostazioni generali e avviare la registrazione.Utilizzare un catetere elettrofisiologico con elettrodi di platino, una superficie dell'elettrodo di 0,5 per 0,5 millimetri, con una distan

impact-intracardiac-neurons-on-cardiac-electrophysiology

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Fonte: Jungen, C., et al. Impatto dei neuroni intracardiaci sull'elettrofisiologia cardiaca e sull'aritmogenesi in un sistema di Langendorff  ex vivo. J. Vis. Exp. (2018). Il video mostra una tecnica ex vivo per stimolare il sistema nervoso intracardiaco a valutare la suscettibilità del cuore all'aritmia. Utilizzando un apparato di perfusione, un cuore di topo isolato viene perfuso con un tampone ossigenato. Il sistema nervoso intracardiaco viene quindi stimolato ad alta frequenza per indurre...

Stimolazione del sistema nervoso intracardiaco per valutare la suscettibilità all'aritmia

Qui descriviamo la preparazione di fette ventricolari vitali da topi adulti e il loro utilizzo per registrazioni potenziali di azione elettrodo. Queste preparazioni multicellulari forniscono una struttura tissutale conservata in vivo , che li rende un prezioso modello per studi elettrofisiologici e farmacologici in vitro .

Fette di cuore ventricolare dell&#39;asse corto dell&#39;urina per gli studi elettrofisiologici

L'obiettivo di questo studio era quello di stabilire un metodo per studiare le dinamiche cardiache utilizzando un modello animale traslazionale. L'approccio sperimentale descritto incorpora l'optocardiografia a doppia emissione in combinazione con uno studio elettrofisiologico per valutare l'attività elettrica in un modello cardiaco porcina isolato e intatto.

Optocardiografia ed elettrofisiologia Studi di Ex Vivo Langendorff-perfusi

Questo protocollo descrive la procedura per sezionare e coltivare fette cardiache umane per test preclinici sui farmaci e descrive in dettaglio l'uso della mappatura ottica per la registrazione simultanea della tensione transmembrana e dei segnali di calcio intracellulare da queste fette.

Valutazione elettrofisiologia cardiaca preclinica mediante mappatura ottica a doppia tensione e calcio delle fette cardiache di organitypica umana

Questo protocollo mira a descrivere una nuova metodologia per misurare la velocità di sparo cardiaca intrinseca utilizzando la registrazione di array di microelettrodi dell'intero tessuto del nodo senoatriale per identificare i difetti di pacemaking nei topi. Gli agenti farmacologici possono anche essere introdotti in questo metodo per studiare i loro effetti sul pacemaking intrinseco.

Registrazione di microelettrodi della velocità di attivazione dei nodi senoatriali per identificare i difetti intrinseci del pacemaking cardiaco nei topi

Il presente protocollo descrive i metodi per l'espressione transgenica nei cuori di ratto e topo mediante iniezione intramiocardica diretta del virus sotto guida ecocardiografica. Qui vengono spiegati anche i metodi per la valutazione della suscettibilità dei cuori alle aritmie ventricolari mediante la stimolazione elettrica programmata di cuori isolati perfusi da Langendorff.

Espressione del transgene virale nei cuori dei roditori e valutazione del rischio di aritmia cardiaca

La combinazione di porzioni laser e array di microelettrodi (MEA) consente registrazioni simili a potenziali d'azione di cardiomiociti primari e derivati da cellule staminali coltivati. La forma d'onda fornisce una visione superiore della modalità d'azione dei composti di prova rispetto alle registrazioni standard. Collega patch-clamp e lettura MEA per ottimizzare ulteriormente la ricerca sulla sicurezza cardio in futuro.

Misurazioni simili al potenziale d'azione indotte dal laser di cardiomiociti su array di microelettrodi per una maggiore predittività della farmacologia di sicurezza

Questo protocollo illustra un metodo per la stimolazione optogenetica dei neuroni cardiaci intrinseci nei cuori di topo transgenici. L'approccio descritto è utilizzato per studiare la cinetica dell'attivazione improvvisa dei neuroni cardiaci in cuori perfusi ex vivo e le interazioni tra attività colinergica e catecolaminergica.

Attivazione optogenetica dei neuroni autonomici cardiaci intrinseci nei cuori di topo perfusi asportati

Descriviamo un protocollo per la registrazione extracellulare multicanale spinale insieme alla registrazione della funzione cardiaca e all'analisi dei neuroni del corno dorsale spinale bloccati nel cuore. Questo metodo offre un quadro temporalmente sincronizzato per lo studio dei meccanismi spinali alla base dei cambiamenti funzionali viscerali toracici indotti dall'agopuntura.

Studio dei profili codificanti della stimolazione somatica sulle risposte neuronali bloccate cardiache nel corno dorsale spinale del ratto

Questo protocollo delinea la fabbricazione avanzata di materiali e metodi di cuore di ratto ex vivo per la biointerfaccia bidirezionale ottica ed elettrica, consentendo una stimolazione cardiaca precisa, la registrazione e la modellazione dell'infarto per la ricerca bioelettronica.

Interfacce elettriche e optoelettroniche bidirezionali in cuori di ratto sani e ischemici ex vivo

Scopri come analizzare il sistema nervoso autonomo intracardiaco e la sua influenza sull'elettrofisiologia, l'aritmogenesi e le dinamiche del cAMP in cuori decentralizzati utilizzando un setup Langendorff ex vivo.

Impatto dei neuroni intracardiaci elettrofisiologia cardiaca e aritmogenesi in un sistema di Langendorff Ex Vivo

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