Un protocollo per acquisire il Tenocyte degenerativa dagli esseri umani

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla biologia degenerativa dei tenociti umani, poiché solo pochi studi hanno descritto in dettaglio l'isolamento e la coltura degenerativa dei tenociti umani. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo ottenere tenociti degenerativi umani senza ulteriori lesioni al paziente perché il tessuto degenerativo viene acquisito durante la chirurgia standard dell'epicondilite. A dimostrare la procedura saranno il Dr.Soo-Hong Han, Minjung Baek e Hyung Kyung Kim del mio Livello Tre.

Per acquisire un campione degenerativo di tessuto tendocitario, utilizzare un bisturi chirurgico numero 15 per praticare un'incisione cutanea da tre a cinque centimetri appena anteriormente mediale all'epicondilo laterale e prossimale al livello dell'articolazione per esporre il gomito laterale e localizzare visivamente l'estensore radiale lungo nell'interfaccia dell'aponeurosi estenore. Usa il bisturi per praticare un'incisione di spaccatura profonda da due a tre millimetri tra l'estensore radiale lungo del carpo e l'aponeurosi estensoria all'interfaccia. Dopo la retrazione anteriore dell'estensore radiale lungo del carpo, individuare il tessuto degenerativo patologico in base al suo caratteristico colore grigiastro opaco e al tessuto tipicamente edematoso e friabile, e utilizzare il bisturi e le mini lame per resecare attentamente, ma bruscamente, tutto il tessuto degenerativo.

Quando tutto il tessuto è stato raccolto, chiudere la ferita con materiale di sutura non assorbibile secondo i protocolli standard e rimuovere con cura tutto il tessuto circostante da un pezzo di campione di tessuto di circa un centimetro cubo, posizionando il tessuto tendineo pulito in 10 millilitri di PBS non appena è stato tagliato. Quindi fissare circa la metà del tessuto raccolto in formalina neutra tamponata al 10% in una cappa chimica per 12 ore. Per impostare una coltura di tenociti, trasferire l'altra metà dei campioni di controllo e di tessuto degenerati raccolti in piastre di coltura tissutale individuali contenenti PBS fresco e tritare i tessuti in un metro cubo o pezzi più piccoli, digerire i frammenti di tessuto in 30 millilitri di DMEM integrati con 30 milligrammi per millilitro di collagenasi due per gruppo di tessuto a 37 gradi Celsius per un'ora.

Al termine della digestione, filtrare le soluzioni cellulari attraverso singoli filtri cellulari da 100 micron e disattivare la collagenasi con un millilitro di FBS per provetta. Raccogliere i tenociti mediante centrifugazione e risospendere i pellet a tre volte da 10 a 5 cellule per 10 millilitri di DMEM integrato con il 10% di FBS e l'1% di antibiotico, soluzione antimicotica. Quindi, seminare le cellule in un piatto di coltura da 100 centimetri per condizione e coltivare i tenociti in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per una settimana, cambiando il terreno di coltura ogni tre giorni fino a raggiungere una confluenza dell'80%.

Per l'analisi immunocitochimica, trasferire due volte 10 alla quinta cellula in 200 microlitri di terreno fresco in ciascun pozzetto di un vetrino da otto pozzetti per gruppo sperimentale e far crescere le cellule alla confluenza per 24 ore. Il giorno successivo, lavare le cellule con PBS, seguito da fissazione con 500 microlitri di formaldeide al 4% per pozzetto e permeabilizzazione con tritone X 100 allo 0,5% in PBS per 10 minuti. Per bloccare qualsiasi legame non specifico, incubare le cellule con albumina sierica bovina all'1% e Tween 20 allo 0,05% in PBS, come sperimentalmente appropriato, seguita da incubazione con gli anticorpi primari di interesse marcati con fluoro a quattro gradi Celsius durante la notte protetti dalla luce.

La mattina successiva, etichettare le cellule con gli anticorpi secondari appropriati per un'ora a temperatura ambiente al riparo dalla luce e montare i campioni con 0,5 microlitri di un terreno di montaggio a fluorescenza appropriato per camera. Quindi visualizza i campioni su un microscopio a fluorescenza con un obiettivo 400x. Per l'analisi patologica del tessuto, incorporare i campioni di tessuto tendineo di controllo formale e fisso e degenerato in quattro o cinque millilitri di paraffina e acquisire sezioni da quattro a cinque micron da ciascun blocco di paraffina.

Per l'ematossilina in eosina, o colorazione H&E, deparaffinare i campioni con tre immersioni di cinque minuti in xilene seguite da idratazione con immersioni di etanolo graduato e un lavaggio con acqua di rubinetto di due minuti. Quindi, etichettare i campioni con ematossilina per cinque minuti, seguiti da un altro lavaggio con acqua di due minuti. Immergere i campioni risciacquati in acido cloridrico all'1% ed etanolo al 70% per tre secondi, seguiti da un lavaggio con acqua di tre minuti.

Neutralizzare l'acido con un'immersione di 10 secondi in ammoniaca allo 0,5%, seguita da un altro lavaggio con acqua di tre minuti. Etichettare i campioni neutralizzati con l'eosina per cinque minuti e disidratare i campioni colorati con H&E con immersioni di etanolo graduato. Dopo tre immersioni nello xilene, montare i campioni con un mezzo di montaggio appropriato e un vetrino di copertura.

Per eseguire l'analisi immunoistochimica dei campioni di tessuto, utilizzare il kit di rilevamento raffinato con polimero legante secondo le istruzioni del produttore con le seguenti modifiche minori. Dopo la deparaffinazione con xilene come dimostrato, immergere i campioni in una soluzione di recupero dell'epitopo di legame per 30 minuti a 100 gradi Celsius per il recupero dell'antigene, seguita da un'incubazione di cinque minuti in perossido di idrogeno per estinguere l'eventuale perossidasi endogena. Successivamente, etichettare le sezioni per quindici minuti a temperatura ambiente con gli anticorpi primari di interesse.

Al termine dell'incubazione, etichettare i campioni con l'appropriato sistema coniugato di anticorpi secondari polimerici di perossidasi linker del rafano esente da biotina per 50 minuti a temperatura ambiente. Quindi montare le sezioni con un vetrino coprioggetto nel mezzo di montaggio appropriato e visualizzare i campioni su un microscopio ottico con un ingrandimento di 400 volte. Le analisi H&E rivelano che il tessuto raccolto dall'epicondilite laterale degenerata mostra fasci di collagene disorganizzati con una perdita di polarità e strutture di fibre parallele fini, diritte e fortemente impacchettate.

Infatti, i fasci di collagene sono positivi per la colorazione del Blu di Alcian nelle sezioni di tessuto degenerate, indicando un aumento della presenza di proteoglicani e glicosaminoglicani all'interno del tessuto danneggiato. L'analisi immunoistochimica dei tendini degenerati indica anche una reazione granulare citoplasmatica positiva al fattore di crescita dell'endotelio vascolare che non è osservata nei campioni di tessuto tendineo sano di controllo. Entrambi i tipi di cellule campione di tessuto in coltura possono essere confermati come tenociti mediante immunofluorachimica, con la maggior parte delle cellule in coltura che esprimono marcatori tenociti rappresentativi come le proteine Mohawk e Tenomodulina e dimostrano un aspetto allungato.

Da notare che i tenociti degenerativi dimostrano anche un tasso di proliferazione più elevato in coltura rispetto ai tenociti prelevati da controlli sani, nonché una maggiore espressione di più geni noti per essere correlati allo sviluppo di tendinopatie. In conclusione, questo protocollo convalidato che utilizza tenociti degenerativi apre la strada a future indagini sulla biologia dei tendini e alla sperimentazione di nuovi interventi.