Name: Nuovo metodo di consegna plasmide DNA Urothelium della vescica del Mouse mediante elettroporazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Scopri un metodo di elettroporazione per la consegna di plasmidi DNA nell'urotelio vescicale del topo in vivo. Questa tecnica rapida e sicura consente di generare modelli autoctoni per studiare la progressione del cancro vescicale.

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Ringraziamo il Professor Bin Chen, Dr. Yue Zhang e Kendy Hoang per aiuto con configurazione del sistema di elettroporazione. Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni dal gruppo beneficio del cancro di Santa Cruz e NIH di Z.A.W.

Tutte le procedure qui descritte sono state eseguite in conformità con le linee guida e regolamenti istituzionali Animal Care e uso Committee (IACUC) della University of California Santa Cruz.
1. plasmide e preparazione di strumenti
<ol><li>Per ogni vescica a transfect, preparare almeno 20 µ l di plasmide del DNA (1 µ g / µ l).</li>
	<li>Aggiungere 1 µ l di Trypan Blue il 20 µ l di soluzione di plasmide in una microcentrifuga da 1,5 mL. Pipetta per mescolare bene.</li>
	<li>Autoclave tutti chirurgico strumenti e sterilizzare l'area di lavoro con etanolo al 70%. Spruzzare frequentemente gli strumenti chirurgici e guanti con etanolo al 70% o utilizzare uno sterilizzatore del branello di vetro quando si eseguono le seguenti operazioni per mantenere condizioni di sterilità.</li>
</ol>2. anestetizzante animale
<ol><li>Utilizzare un sistema di anestesia top tavolo per anestetizzare l'animale con isoflurano. Girare sul serbatoio O2 e regolare il flussometro ossigeno a 1 L/min.</li>
	<li>Posto un topo C57BL/6J femmina adulto nella camera di induzione. Accendere e regolare il vaporizzatore di isoflurane al 3% per induzione. Il mouse dovrebbe essere in anestesia entro 2 min amministra buprenorfina analgesico (0,1 mg/kg) per via sottocutanea dopo la rimozione del mouse dalla camera di induzione per preemptive analgesia. Nota: Nel presente protocollo, i topi femminili sono usati, come sono più facili da lavorare con durante la cateterizzazione di uretra. Il protocollo funziona anche per topi maschi, ma prestare particolare attenzione è necessaria quando si esegue il passaggio 3.</li>
	<li>Applicare unguento oftalmico agli occhi dell'animale per prevenire la secchezza. Posizionare il mouse anestetizzato rivolto verso l'alto su un rilievo di riscaldamento con il suo naso nel cono di naso. Girare l'interruttore del circuito di aria per lasciare isoflurano andare attraverso il cono di naso.</li>
	<li>Trattenere la testa e il naso a cono con nastro adesivo. Regolare il vaporizzatore di isoflurane al 2% per la manutenzione.</li>
	<li>Trattenere le membra con nastro adesivo. Eseguire test toe-pizzico per assicurarsi che l'animale è in anestesia profonda e quindi radere la zona addominale.</li>
</ol>3. urina svuotamento e lavaggio della vescica
<ol><li>Applicare il lubrificante al catetere (24G, 2,11 cm di lunghezza, diametro esterno di 0,045 cm) e garantire che la sua superficie esterna è completamente coperto.</li>
	<li>Inserire il catetere nell'uretra apertura e spingere lentamente fino a raggiungere la vescica, momento in cui l'urina dovrebbe defluire attraverso il catetere. Premere delicatamente l'addome per aiutare lo svuotamento dell'urina.<ol>
<li>Verifica se il catetere è inserito correttamente nella vescica osservando automatico urina fuori-flusso. Evitare piercing la parete della vescica e uretra e applicare il lubrificante più volte se necessario.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Scartare l'urina con una pipetta in un becher da rifiuti.</li>
	<li>Pipettare 80 µ l di tampone fosfato salino (PBS) nell'estremità esterna del catetere, con l'altra estremità ancora nella vescica. Con attenzione è possibile collegare una siringa da 1 mL al catetere. Spingere delicatamente la siringa per iniettare il PBS nella vescica. Lasciare alcuni PBS del catetere per evitare di creare bolle d'aria nella vescica.</li>
	<li>Rimuovere la siringa. Aspettare per la PBS drenare dalla vescica. Premere delicatamente l'addome per evacuare PBS.</li>
	<li>Scartare il PBS del catetere con una pipetta nel contenitore dei rifiuti.</li>
	<li>Ripetere PBS lavaggio (passaggi 3.4-3.6) per altre due volte. Nota: È fondamentale lavorare delicatamente durante queste fasi di lavaggio. Sangue nel catetere o il fallimento di automatico fuori-fluire del liquido indica in genere l'uretra è trafitto. È anche importante evitare di introdurre bolle d'aria, come essi potranno diminuire l'efficienza di elettroporazione.</li>
</ol>4. plasmide consegna
<ol><li>Applicare etanolo al 70% all'addome del mouse e utilizzare un bisturi per praticare un'incisione verticale di 1 cm per aprire la pelle dell'addome sopra la vescica.</li>
	<li>Pipettare almeno 20 µ l di plasmide plus soluzione tripan blu in estremità esterna del catetere e collegare la siringa.</li>
	<li>Iniettare la soluzione di plasmide nella vescica. Se la vescica diventa blu, l'iniezione è successo. Lasciare un po' di liquido del catetere per evitare di creare bolle d'aria nella vescica.</li>
	<li>Afferrare l'orifizio uretrale esterno con pinzette e quindi rimuovere il catetere e la siringa. Utilizzare una stringa per stringere l'orifizio uretra esterno. Fare due anelli con la stringa e poi legare con due nodi. Nota: Serraggio dell'uretrale è importante per impedire il riflusso del liquido del plasmide.</li>
	<li>Accendere il generatore di elettroporazione con i seguenti parametri: 33V, 50 ms tempo di lavoro e 950 ms tempo di intervallo.</li>
	<li>Tenere la vescica con una pinzetta e pizzicare la vescica con due elettrodi. Spingere il pedale per eseguire l'elettroporazione. Nota: Gli impulsi elettrici sono impostati a verificarsi 5 volte con brevi intervalli di tempo dopo ogni pressione del pedale. Il mouse può contrarsi in questo processo. Spingendo il pedale più di una volta può aumentare l'efficienza di consegna, ma anche molti impulsi elettrici possono danneggiare l'integrità del tessuto dell'urotelio.<ol>
<li>Evitare il contatto tra le pinzette e gli elettrodi, come questo genererà una scintilla.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. il recupero
<ol><li>Suturare l'apertura addominale e pelle con sutura chirurgica sterile e clip. Applicare iodio sulla ferita.</li>
	<li>Rimuovere l'animale dal sistema isoflurano. Amministrare la buprenorfina analgesico (0,1 mg/kg) per via sottocutanea per alleviare il dolore post-operatorio.</li>
	<li>Tenere l'animale il termoforo e tornare alla gabbia a casa dopo il recupero completo. Controllare l'animale almeno una volta al giorno per la normale mobilità, abbeveraggio e alimentazione comportamenti e senza segni di infezione, fino a quando l'incisione è guarito e quindi rimuovere le clip. Se l'animale Visualizza il sintomo di dolore come ridotto toelettatura, aumentata aggressività e vocalizzazione, somministrare iniezioni successive di buprenorfina analgesico.</li>
</ol>

<ol><li>Sharpless, N. E., Depinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mighty+mouse%3A+genetically+engineered+mouse+models+in+cancer+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development.</a> Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).</li>
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<li>Follenzi, A., Santambrogio, L., Annoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Immune responses to lentiviral vectors.</a> Curr Gene Ther. 7 (5), 306-315 (2007).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Elettroporazione migliora la permeabilità della membrana cellulare ed è una potente tecnologia per gene electrotransfer16. Consegna del gene in roditori vivente mediante elettroporazione è stato frequentemente utilizzato in neurobiologia campi17,18,19,20,21. Le sue potenziali applicazioni in molti altri organi non sono stati esplorati e...

Modelli murini geneticamente (GEMM) hanno giocato un ruolo essenziale ad ampliare la nostra conoscenza circa lo sviluppo animale, gene funzioni in vivoe meccanismi di malattia progressione1,2. Germline GEMM sono tradizionalmente sviluppato in due modi. Il primo è la creazione di topi transgenici di pronuclei iniezione del plasmide DNA seguito da trapianto di zigoti in femmine pseudopregnant. L'altra è la generazione di topi knock-out/knock-in di ricombinazione omologa in cellule staminali embrionali e lo sviluppo delle chimere. Knockout condizionale di geni nel tipo specifico dei tessuti o cellule di interesse comporta l'allevamento degli alleli geneticamente ingegnerizzati con siti Cre e flox per più generazioni. L'intero processo può essere costoso e richiede tempo, soprattutto se l'obiettivo è di indirizzare i geni multipli del tessuto-specifico. Recentemente, la modifica del gene tecnologie quali cluster regolarmente intercapedine ripetizioni brevi palindromi (CRISPR) sono state applicate a parecchi organi dei topi per indurre le alterazioni genetiche tessuto-specifico per il cancro autoctono modellazione3, 4,5,6,7 o mutazioni della malattia corretta in situ8,9. In questi studi, la consegna dei vettori gRNA solitamente è stata realizzata attraverso l'infezione adenoviral o lentivirale dell'organo o idrodinamico vena caudale iniezione. La relativa facilità di consegna dei componenti CRISPR il polmone ed il fegato ha notevolmente migliorato la comodità e l'efficienza di cancro in questi organi rispetto ai tradizionali modelli del mouse Cre-Lox basata di modellazione.
Il urothelium della vescica è dove la maggior parte dei tumori della vescica hanno origine. La consegna dei vettori di DNA per il urothelium della vescica per la terapia del gene o modellazione è ostacolata da uno strato di glicosaminoglicani sulla superficie apicale urothelial, che agisce come una barriera per l'aderenza di virus infettivi10,11. Diversi agenti di pretrattamento come Syn3 e dodecil-β-d-maltoside sono stati utilizzati per interrompere questa barriera e usufruire dell'adenovirus infezione efficienza12,13,14. Se il virus adeno-associato (AAVs) efficacemente può infettare la vescica non è stata segnalata. Nel complesso, un metodo di consegna di base non-virale sarebbe auspicabile. Qui, descriviamo un nuovo metodo sviluppato in laboratorio per consegna efficiente DNA del plasmide dell'urotelio del mouse tramite cateterizzazione dell'uretra e l'elettroporazione. Perché il nostro approccio non comporta pretrattamento chimico di strato di glicosaminoglicani o produzione di virus, significativamente semplifica la consegna dei plasmidi di DNA nell'urotelio vescica del mouse e dovrebbe facilitare vari studi in vivo di malattie di vescica.

<table><tbody><tr><td>Siringa BD 1mL TB</td><td>Fisher</td><td>148232E</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Sigma</td><td>B9275-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette Dumont</td><td>Roboz Surgical Instr</td><td>RS-5005</td><td>Trattare con etanolo al 70% prima dell'uso chirurgico</td></tr><tr><td>ECM830 SQ Wave Electroporator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450052</td><td></td></tr><tr><td>Exel International Safelet monouso Cateteri per flebo</td><td>Fisher Scientifico</td><td>14-841-21</td><td>24G, lunghezza 2,11 cm, diametro esterno 0,045 cm</td></tr><tr><td>Forbici per microdissezione extra fini</td><td>Roboz Surgical Instr</td><td>RS-5135</td><td>Trattare con etanolo al 70% prima dell'uso chirurgico</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Vet one</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>K& H Tappetino riscaldato per piccoli animali, 9 per 12 pollici Amazon</td><td></td><td>n/a</td><td>Coprire il tappetino termico con tovaglioli di carta</td></tr><tr><td>Unguento oftalmico</td><td>Fisher</td><td>NC0849514</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Punte di pipetta 200 e micro; L</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0206</td><td></td></tr><tr><td>Punte per pipette, universali; da 0,1 a 10 &; L</td><td>Fisher</td><td>02707438(CS)</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN NEO P2</td><td>Gilson</td><td>F144561</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN NEO P200N</td><td>Gilson</td><td>F144565</td><td></td></tr><tr><td>plasmide CAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>16664</td><td></td></tr><tr><td>Platino pinzetta 5 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450489</td><td>5 mm</td></tr><tr><td>di diametro Forbici</td><td>Roboz Surgical Instr</td><td>RS-5880</td><td>Trattare con 70% di etanolo prima dell'uso chirurgico</td></tr><tr><td>Cordone per corde</td><td>Amazon</td><td>n/a</td><td>Mandala Crafts 150D 210D 0,8 mm 1 mm in pelle per cucire cuciture filo cerato piatto corda Corda</td></tr><tr><td>per corde Nastro, Scotch</td><td>Fisher</td><td>19047257</td><td></td></tr><tr><td>Therio-gel Lubrificante veterinario</td><td>PBS salute degli animali</td><td>353-736</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>V-1 Piano del tavolo sistema di anestesia</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl sutura viola 18" FS-2 taglio 5-0</td><td>Fisher</td><td>NC0578475</td><td></td></tr><tr><td>Walgreens Povidone Iodio 10%</td><td>Walgreens</td><td>953982</td><td></td></tr><tr><td>Clip per ferite</td><td>Fisher</td><td>018045</td><td></td></tr><tr><td>Applicatore di clip</td><td>per ferite Fisher</td><td>01804</td><td></td></tr></tbody></table>

nuovo metodo di consegna plasmide dna urothelium della vescica del mouse mediante elettroporazione

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Modelli murini geneticamente (GEMM) sono estremamente utili nel rivelare nuove conoscenze biologiche sui meccanismi di iniziazione e progressione delle malattie umane come il cancro. Topi knock-out condizionale e transgenici sono stati usati frequentemente per la sovraespressione genica o tipi di ablazione in specifici tessuti o cellule in vivo. Tuttavia, la generazione di modelli murini di germline possono essere lunghe e costose. Gli avanzamenti recenti nel gene editing tecnologie e la fattibilità di erogare plasmidi di DNA tramite l'infezione virale hanno permesso la rapida generazione di modelli di germline non autoctono del topo del cancro per parecchi organi. La vescica è un organo che è stato difficile per vettori virali accedere, a causa della presenza di uno strato di glicosaminoglicani che copre l'urotelio. Qui, descriviamo un nuovo metodo sviluppato nel laboratorio per la distribuzione efficiente dei plasmidi di DNA nel mouse vescica urotelio in vivo. Tramite instillazione intravescicale di plasmide del DNA pCAG-GFP ed elettroporazione della vescica esposta chirurgicamente, indichiamo che il plasmide del DNA possa essere consegnato in particolare le cellule uroteliali della vescica per espressione transitoria. Il nostro metodo fornisce un modo veloce e conveniente per la sovraespressione e atterramento di geni nella vescica del mouse e può essere applicato alla costruzione di GEMM di cancro alla vescica e altre malattie urologiche.

Per dimostrare il successo di consegna del gene in urothelium della vescica, abbiamo usato il plasmide di15 pCAG-GFP per elettroporazione. 20 µ l di soluzione Trypan Blue e plasmide è stato iniettato attraverso l'uretra e 5 impulsi elettrici sono stati amministrati. Dopo 48 h, abbiamo dissecato la vescica del mouse e osservato le patch di fluorescenza di GFP sotto un microscopio di fluorescenza di dissezione, mentre un negativo di controllo della vescica che non su...

Descriviamo un metodo novello per la consegna del plasmide del DNA nelle cellule uroteliali del mouse della vescica in vivo tramite cateterizzazione dell'uretra e l'elettroporazione. Offre un modo veloce e conveniente per la generazione di modelli murini autoctoni di malattie di vescica.

Nuovo metodo di consegna plasmide DNA Urothelium della vescica del Mouse mediante elettroporazione

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire plasmidi di DNA nell'urotelio vescicale di topi vivi in vivo per la sovraespressione genica o l'editing del genoma. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del cancro della vescica, ad esempio in che modo diverse mutazioni genetiche promuovono la progressione del cancro della vescica? Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un modo rapido e conveniente per somministrare i geni nella vescica senza i problemi di sicurezza e le barriere tecniche associate ai vettori virali.All'inizio ho avuto l'idea di questo metodo di provare a utilizzare qualsiasi virus associato ingegnerizzato per la consegna del DNA, che non funzionava bene nella vescica. L'implicazione di questa tecnica può estendersi anche alla terapia genica perché l'elettroporazione può ottenere un'efficiente consegna di plasmidi di DNA nelle cellule uroteliali. A dimostrare la procedura saranno Ofir Stefanson e Yueli Liu del mio laboratorio.Per iniziare questa procedura, sterilizzare in autoclave tutti gli strumenti chirurgici e sterilizzare l'area di lavoro con etanolo al 70%. Spruzzare frequentemente gli strumenti chirurgici e i guanti con etanolo al 70% durante l'esecuzione delle procedure successive per mantenere le condizioni sterili. Per iniziare, anestetizzare il topo e radere l'area chirurgica.Per esaurire l'urina, applicare lubrificante al catetere e assicurarsi che la sua superficie esterna sia completamente coperta. Successivamente, inserire il catetere nell'apertura dell'uretra del topo e spingerlo lentamente fino a raggiungere la vescica. Premere delicatamente l'addome per favorire l'esaurimento delle urine.Successivamente, scartare l'urina con una pipetta in un becher di scarto, quindi pipettare 80 microlitri di PBS nell'estremità esterna del catetere con l'altra estremità ancora nella vescica. Quindi, collegare con cura una siringa da un millimetro al catetere. Spingere delicatamente la siringa per iniettare PBS nella vescica.Lasciare un po' di PBS nel catetere per evitare di creare bolle d'aria nella vescica. Successivamente, rimuovere la siringa e attendere che il PBS fuoriesca dalla vescica. Premere delicatamente l'addome per evacuare il PBS, quindi gettare il PBS nel catetere con una pipetta nel becher dei rifiuti.Ripetere il lavaggio PBS per altre due volte. Per ogni vescica da trasfettare, preparare almeno 20 microlitri di plasmide di DNA a un microgrammo per microlitro. Quindi, aggiungere un microlitro di blu di tripano ai 20 microlitri di soluzione plasmidica e una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e una pipetta per mescolare bene.Per erogare il plasmide, applicare il 70% di etanolo sull'addome. Praticare un'incisione verticale di un centimetro per aprire la pelle addominale sopra la vescica. Quindi, taglia lo strato muscolare per esporre la vescica.Pipettare almeno 20 microlitri di soluzione di plasmide più blu di tripano nell'estremità esterna del catetere e staccarlo dalla siringa. Quindi, iniettare la soluzione plasmidica nella vescica. Se la vescica diventa blu, l'iniezione ha successo.Lasciare un po' di liquido nel catetere per evitare di creare bolle d'aria nella vescica. Successivamente, afferrare l'orafizio uretrale esterno e rimuovere il catetere e la siringa. Utilizzare una corda per stringere l'orifizio uretrale esterno.Fai due anelli con lo spago, quindi lega con due nodi. Questo è un passaggio cruciale che richiede la collaborazione di due persone. Assicurati che i nodi siano stretti in modo che i plasmidi non fuoriescano.Ora accendi il generatore di elettroporazione. Pizzicare la vescica con due elettrodi e premere il pedale per eseguire l'elettroporazione. Per mantenere la vescica appoggiata, si può pizzicare la parte posteriore dell'incisione addominale con una pinzetta.Evitare qualsiasi contatto tra le pinzette e gli elettrodi in quanto ciò potrebbe generare una scintilla. Al termine, suturare l'apertura addominale e cutanea con sutura chirurgica sterile. Rimuovere la corda e applicare le clip.Applicare iodio sulla ferita, quindi rimuovere l'animale dal sistema isoflurano. Somministrare l'analgesico buprenorfina per via sottocutanea per alleviare il dolore post-chirurgico. Tieni l'animale sul termoforo e rimettilo nella gabbia di casa dopo il completo recupero.Controllare l'animale almeno una volta al giorno per verificare la normale mobilità, i comportamenti di bere e l'alimentazione e l'assenza di segni di infezione fino a quando l'incisione non è guarita. Quindi, una settimana dopo, rimuovi le clip. Somministrare successive iniezioni di analgesico buprenorfina se l'animale mostra sintomi di dolore come riduzione della toelettatura, aumento dell'aggressività e vocalizzazione.Per dimostrare il successo della somministrazione genica nell'urotelio vescicale, 20 microlitri di plasmide pCAG-GFP e soluzione di blu di tripano sono stati iniettati attraverso l'uretra e sono stati somministrati cinque impulsi elettrici. Qui è mostrata l'elettroporazione riuscita che ha reso la vescica verde dopo 48 ore, mentre una vescica di controllo negativa che non ha subito l'elettroporazione non ha mostrato alcun segnale GFP. La colorazione immunofluorescente dei tessuti vescicali sezionati è stata eseguita con anticorpi CK5, CK18 e GFP.È stato osservato che il segnale GFP è presente nelle cellule a ombrello, intermedie e basali, ma non a livello muscolare, indicando una buona specificità del rilascio del plasmide nell'urotelio. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 15 minuti se eseguita correttamente. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo del cancro della vescica per costruire nuovi modelli murini autoctoni per studiare i meccanismi di progressione della malattia.

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