Nuovo metodo di consegna plasmide DNA Urothelium della vescica del Mouse mediante elettroporazione

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire plasmidi di DNA nell'urotelio vescicale di topi vivi in vivo per la sovraespressione genica o l'editing del genoma. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del cancro della vescica, ad esempio in che modo diverse mutazioni genetiche promuovono la progressione del cancro della vescica? Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un modo rapido e conveniente per somministrare i geni nella vescica senza i problemi di sicurezza e le barriere tecniche associate ai vettori virali.

All'inizio ho avuto l'idea di questo metodo di provare a utilizzare qualsiasi virus associato ingegnerizzato per la consegna del DNA, che non funzionava bene nella vescica. L'implicazione di questa tecnica può estendersi anche alla terapia genica perché l'elettroporazione può ottenere un'efficiente consegna di plasmidi di DNA nelle cellule uroteliali. A dimostrare la procedura saranno Ofir Stefanson e Yueli Liu del mio laboratorio.

Per iniziare questa procedura, sterilizzare in autoclave tutti gli strumenti chirurgici e sterilizzare l'area di lavoro con etanolo al 70%. Spruzzare frequentemente gli strumenti chirurgici e i guanti con etanolo al 70% durante l'esecuzione delle procedure successive per mantenere le condizioni sterili. Per iniziare, anestetizzare il topo e radere l'area chirurgica.

Per esaurire l'urina, applicare lubrificante al catetere e assicurarsi che la sua superficie esterna sia completamente coperta. Successivamente, inserire il catetere nell'apertura dell'uretra del topo e spingerlo lentamente fino a raggiungere la vescica. Premere delicatamente l'addome per favorire l'esaurimento delle urine.

Successivamente, scartare l'urina con una pipetta in un becher di scarto, quindi pipettare 80 microlitri di PBS nell'estremità esterna del catetere con l'altra estremità ancora nella vescica. Quindi, collegare con cura una siringa da un millimetro al catetere. Spingere delicatamente la siringa per iniettare PBS nella vescica.

Lasciare un po' di PBS nel catetere per evitare di creare bolle d'aria nella vescica. Successivamente, rimuovere la siringa e attendere che il PBS fuoriesca dalla vescica. Premere delicatamente l'addome per evacuare il PBS, quindi gettare il PBS nel catetere con una pipetta nel becher dei rifiuti.

Ripetere il lavaggio PBS per altre due volte. Per ogni vescica da trasfettare, preparare almeno 20 microlitri di plasmide di DNA a un microgrammo per microlitro. Quindi, aggiungere un microlitro di blu di tripano ai 20 microlitri di soluzione plasmidica e una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e una pipetta per mescolare bene.

Per erogare il plasmide, applicare il 70% di etanolo sull'addome. Praticare un'incisione verticale di un centimetro per aprire la pelle addominale sopra la vescica. Quindi, taglia lo strato muscolare per esporre la vescica.

Pipettare almeno 20 microlitri di soluzione di plasmide più blu di tripano nell'estremità esterna del catetere e staccarlo dalla siringa. Quindi, iniettare la soluzione plasmidica nella vescica. Se la vescica diventa blu, l'iniezione ha successo.

Lasciare un po' di liquido nel catetere per evitare di creare bolle d'aria nella vescica. Successivamente, afferrare l'orafizio uretrale esterno e rimuovere il catetere e la siringa. Utilizzare una corda per stringere l'orifizio uretrale esterno.

Fai due anelli con lo spago, quindi lega con due nodi. Questo è un passaggio cruciale che richiede la collaborazione di due persone. Assicurati che i nodi siano stretti in modo che i plasmidi non fuoriescano.

Ora accendi il generatore di elettroporazione. Pizzicare la vescica con due elettrodi e premere il pedale per eseguire l'elettroporazione. Per mantenere la vescica appoggiata, si può pizzicare la parte posteriore dell'incisione addominale con una pinzetta.

Evitare qualsiasi contatto tra le pinzette e gli elettrodi in quanto ciò potrebbe generare una scintilla. Al termine, suturare l'apertura addominale e cutanea con sutura chirurgica sterile. Rimuovere la corda e applicare le clip.

Applicare iodio sulla ferita, quindi rimuovere l'animale dal sistema isoflurano. Somministrare l'analgesico buprenorfina per via sottocutanea per alleviare il dolore post-chirurgico. Tieni l'animale sul termoforo e rimettilo nella gabbia di casa dopo il completo recupero.

Controllare l'animale almeno una volta al giorno per verificare la normale mobilità, i comportamenti di bere e l'alimentazione e l'assenza di segni di infezione fino a quando l'incisione non è guarita. Quindi, una settimana dopo, rimuovi le clip. Somministrare successive iniezioni di analgesico buprenorfina se l'animale mostra sintomi di dolore come riduzione della toelettatura, aumento dell'aggressività e vocalizzazione.

Per dimostrare il successo della somministrazione genica nell'urotelio vescicale, 20 microlitri di plasmide pCAG-GFP e soluzione di blu di tripano sono stati iniettati attraverso l'uretra e sono stati somministrati cinque impulsi elettrici. Qui è mostrata l'elettroporazione riuscita che ha reso la vescica verde dopo 48 ore, mentre una vescica di controllo negativa che non ha subito l'elettroporazione non ha mostrato alcun segnale GFP. La colorazione immunofluorescente dei tessuti vescicali sezionati è stata eseguita con anticorpi CK5, CK18 e GFP.

È stato osservato che il segnale GFP è presente nelle cellule a ombrello, intermedie e basali, ma non a livello muscolare, indicando una buona specificità del rilascio del plasmide nell'urotelio. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 15 minuti se eseguita correttamente. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo del cancro della vescica per costruire nuovi modelli murini autoctoni per studiare i meccanismi di progressione della malattia.