Isolamento del contenuto serbatoio Mandibular della ghiandola da Bornean ' esplodere le formiche (Formicidae) per l'analisi di Volatilome di GC-MS e MetaboliteDetector

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella metabolomica degli insetti. L'approccio del profilo dei metaboliti può essere utilizzato per studiare l'ecologia chimica delle formiche chiarendo il ruolo dei volatili nell'interazione con altri organismi. Il vantaggio principale del flusso di lavoro presentato è: che consiste di due parti distinte che possono essere applicate sostanzialmente in modo indipendente.

In primo luogo, l'isolamento fisico del serbatoio della ghiandola mandibolare e del suo contenuto e, in secondo luogo, la profilazione non mirata e l'identificazione della costituzione organica volatile nel campione biologico di interesse. A dimostrare la procedura sarà Michaela Hoenigsberger, una talentuosa dottoranda del mio laboratorio. Prima di sezionare le formiche, in una cappa aspirante, pulire una capsula di Petri di vetro e gli strumenti di dissezione utilizzando fazzoletti di carta e una miscela uno più uno in volume di metanolo e acqua.

Conservare il piatto a meno 20 gradi Celsius. Quindi, prendi la massa di fiale da 1,5 millilitri con filettatura corta, compresi i loro tappi a vite che contengono setti in silicone PTFE. Conservare le fiale con ghiaccio.

Quindi, metti un impacco freddo malleabile congelato in una scatola di polistirene espanso. Quindi caricare la capsula di Petri sopra l'impacco freddo e mettere una formica congelata nella capsula. Ora, esamina la formica con uno stereomicroscopio.

Verificare l'integrità dei suoi compartimenti gastrali. La formica deve avere una regione gastrica intatta. Non utilizzare formiche con gaster piatti o tracce di contenuto indurito del serbatoio della ghiandola mandibolare sulla superficie del corpo.

Ora, isola il contenuto del serbatoio della ghiandola mandibolare dalla formica. Usa una pinza per afferrare il propodio e il picciolo, quindi separa delicatamente questi segmenti del corpo. Quindi, afferra il gaster al tergite quattro usando una pinza fine.

Con un altro paio di pinze, afferra il tergite uno e rimuovi delicatamente il tergite staccandolo. Ripeti questo processo per strappare i tergiti due e tre, in modo che la porzione gastrolica dei serbatoi della ghiandola mandibolare sia per lo più visibile. I serbatoi della ghiandola mandibolare sono di colore giallo nelle formiche operaie C.Explodens, ma il colore può variare dal bianco al giallo, al rosso in altre specie.

Successivamente, utilizzando un ago da dissezione, rimuovere delicatamente il contenuto simile alla cera dei serbatoi della ghiandola mandibolare accoppiati grattandoli fuori dal compartimento gastrale. Rimuovere solo quelle parti del serbatoio della ghiandola mandibolare che possono essere isolate senza applicare pressione sulle altre ghiandole e strutture corporee presenti nel gaster delle formiche. Non è necessario raccogliere tutto il contenuto del serbatoio della ghiandola mandibolare.

Ora, raccogli il contenuto del serbatoio della ghiandola mandibolare toccandolo delicatamente con la punta dell'ago di dissezione finché non si attacca ad esso. Quindi trasferire il contenuto della ghiandola in una fiala fredda da 1,5 millilitri a filo corto. Potrebbe essere necessario spostare la punta dell'ago lungo la parete del flaconcino e spalmare il contenuto della ghiandola sulla parete del flaconcino.

Tenere la collezione coperta e sul ghiaccio fino a quando non può essere analizzata. Tra una dissezione e l'altra, pulire nuovamente gli strumenti e la piastra con la miscela di metanolo e acqua. Per creare un campione analitico, combinare il contenuto del serbatoio della ghiandola di più formiche.

In questo caso, il contenuto della ghiandola di cinque formiche operaie di C.explodens viene raggruppato. Per un controllo, raccogliere campioni composti dalla ghiandola di Dufour che è adiacente ai serbatoi della ghiandola mandibolare. Prima di estrarre il contenuto ghiandolare, determinare le masse dei campioni analitici.

Quindi, aggiungere 14 parti di acetato di etile ad alta purezza ghiacciato in volume, in una parte di tessuto in massa. Agitare la preparazione per cinque minuti in condizioni di raffreddamento. Quindi, centrifugare i campioni per 10 minuti e raccogliere i surnatanti.

Ci si aspetta da 55 a 75 microlitri di surnatante da un campione di cinque formiche. Trasferire ciascun surnatante in una fiala pre-raffreddata da 1,5 millilitri con un microinserto da 0,1 millilitri e sigillare ermeticamente le fiale utilizzando tappi a vite contenenti fori e setti in gomma PTFE rossa. Per una sequenza di misurazione GCMS completa, preparare una fiala a filo corto da 1,5 millilitri con una miscela calibrata dell'indice di ritenzione, ottenuta diluendo le soluzioni standard di alcani disponibili in commercio in esano, a otto milligrammi per millilitro per composto.

Quindi, preparare un'altra fiala di acetato di etile puro da utilizzare come bianco del solvente. Sul vassoio dell'autocampionatore raffreddato del gascromatografo, caricare prima il bianco del solvente, in secondo luogo la miscela calibrante dell'indice di ritenzione, in terzo luogo l'estratto del contenuto del serbatoio della ghiandola mandibolare e in quarto luogo l'estratto del contenuto della ghiandola di Dufour. Mettere i campioni con il vassoio sul ghiaccio per il trasporto al gascromatografo.

Inserire il vassoio nell'autocampionatore raffreddato. Per ogni campione, iniettare un microlitro di aliquat nello spettrometro di massa GC per la separazione cromatografica su una colonna adatta ai composti target. Come una colonna dell'interfaccia utente HP-5MS.

Quindi, impostare i parametri GC appropriati. Ad esempio, utilizzare l'elio sul gas di trasporto con un flusso costante della colonna di un millilitro al minuto. Utilizzare una rampa di temperatura del forno a partire da 40 gradi Celsius per due minuti, seguita da una rampa di 10 gradi Celsius al minuto fino a 330 gradi Celsius.

Seguito da una sospensione di sette minuti. Con questi parametri, impostare la temperatura di ingresso a 270 gradi Celsius. Ora, se necessario, regolate i rapporti di divisione per la specifica di massa GC.

iniezione in modo da fornire forme e intensità di picco adeguate per i composti di interesse. Impostare la temperatura ausiliaria a 350 gradi Celsius. Per la spettrometria di massa.

Utilizzare i seguenti parametri. Una temperatura della sorgente MS di 230 gradi Celsius, una temperatura quadrupla MS di 150 gradi Celsius, un intervallo di scansione da una massa bassa 30 a una massa alta 500, per ottenere una velocità di scansione di circa tre scansioni al secondo. E un ritardo del solvente di 4,1 minuti per il bianco del solvente e i campioni sperimentali, o un ritardo del solvente di 6,1 minuti per la miscela calibrante dell'indice di ritenzione.

Al termine delle misurazioni, aprire il software di analisi dei dati GCMS ed esportare i dati come file di progetto AIA, su un dispositivo di archiviazione portatile per facilitare il trasferimento dei dati a un computer con sistema operativo basato su Linux a 64 bit. Per analizzare i dati, seguire la descrizione del testo del protocollo dell'uso del software del rivelatore di metaboliti. Sul campo, le formiche sono state raccolte e congelate a meno 20 gradi Celsius per due giorni, e poi conservate a meno 80 gradi Celsius fino a quando non sono state analizzate.

contenuto del serbatoio della ghiandola mandibolare di cinque formiche operaie C.explodens è stato raccolto e misurato da GCMS. L'analisi dei dati ha rivelato dozzine di composti putativi del contenuto delle ghiandole. I due metaboliti dominanti nell'estratto del serbatoio della ghiandola mandibolare hanno causato il sovraccarico della colonna.

Questo è il motivo per cui lo stesso campione è stato analizzato di nuovo con un rapporto di divisione più elevato di 50 a uno. La contaminazione crociata del contenuto del serbatoio della ghiandola mandibolare da parte della costituenza della ghiandola di Dufour è stata studiata facendo esaminare campioni di ghiandole di Dufour. Tali contaminanti hanno mostrato tempi di ritenzione tardivi, a partire da circa 29 minuti.

I metaboliti del contenuto del serbatoio della ghiandola mandibolare putativa rilevati sono stati identificati sulla base di una combinazione di spettro e somiglianza dell'indice di ritenzione con una libreria interna. In questo modo è stato possibile confermare l'identità di circa il 10% dei metaboliti rilevati, alcuni dei quali sono elencati come composti da uno a cinque. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare, estrarre e determinare, uno alla volta, i metaboliti scegliendo la misurazione della SM.

Una volta padroneggiato, l'isolamento, l'estrazione con solvente e l'acquisizione dei dati dello stesso campione possono essere eseguiti in circa due ore se eseguiti correttamente. A seconda della complessità del profilo dei composti organici volatili, il tempo necessario per la valutazione dei dati varierà. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordarsi di mantenere il campione costantemente raffreddato, dalla raccolta fino all'analisi.

Inoltre, prima della sezione, deve essere verificato che il gaster della formica sia fisicamente intatto. Questa procedura può anche essere combinata con la quantificazione comparativa o assoluta dei metaboliti, al fine di rispondere a domande aggiuntive, come la composizione metabolica e le diverse condizioni ambientali, o le quantità assolute di costituenti in scatola. Convenientemente, le fasi di estrazione, misurazione e valutazione dei dati di questo protocollo possono essere applicate anche a più sistemi biologici, come altri insetti, microrganismi o piante.