Name: Infezione batterica orale e spargimento in Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-31T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Impara a infettare oralmente Drosophila melanogaster con batteri patogeni e misurare lo spargimento batterico. Questo metodo permette di studiare l'immunità intestinale e le interazioni ospite-patogeno in vivo.

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Questo lavoro è stato supportato da un premio strategico dal Wellcome Trust per il centro per l'immunità, infezione ed evoluzione (http://ciie.bio.ed.ac.uk; grant riferimento n ° 095831). PFV era sostenuto da una borsa di studio di Branco Weiss (https://brancoweissfellowship.org/) e Fellowship di un cancelliere (scuola di scienze biologiche, Università di Edimburgo); JASJ è stato sostenuto da un NERC E3 DTP PhD studentship.

1. mantenere le mosche
<ol><li>Mantenere le mosche in fiale di plastica 23 mL contenente 7 mL di mezzo di Lewis appena fatta (modificato dal riferimento31; Tripla 1 L acqua distillata H2O, 6,1 g di agar, 93,6 g zucchero di canna, 68 g di mais, lievito istantaneo 18,7 g, agente anti-fungine di 15 mL Tegosept) in incubatrice a 25 ± 1 ° C, in un h:12 12 h chiaro: scuro ciclo con ~ 60% di umidità. Collegare le fiale con non-assorbente di cotone idrofilo.</li>
	<li>Dopo ogni 14 giorni, trasferimento 20 – 30 adulti ad un nuovo flacone di cibo, con lievito istantaneo, asciutto, aggiunto alla superficie, per 2 – 3 giorni per consentire la deposizione delle uova per verificarsi. Dopo questo periodo di tempo, garantire che le uova sono visibili sulla superficie del cibo. Rimuovere le mosche adulte. Nota: In questo modo mosche nelle fiale come singola generazione, popolazioni di pari età.</li>
	<li>Lasciare le uova a sviluppare. Nota: A 25 ° C, mosche adulte iniziano a eclose da pupe il giorno 11 e continuano nei giorni 12 – 14.</li>
</ol>2. preparare mosche sperimentale
<ol><li>Raccogliere le uova della generazione dei genitori in una gabbia di popolazione/embrione insieme su una piastra di apple-agar 75 mL (1 L triplo distillata H2O, 30 g di agar, 33 g di saccarosio, 330 mL di succo di mela, agente anti-fungine di 7 mL Tegosept) con uno spread di pasta di lievito (lievito secco mix con acqua per ottenere una consistenza simile a burro di arachidi). Aggiungere ovatta impregnati d'acqua alla gabbia per fornire l'umidità. Nota: Per evitare di confondere gli effetti causati da differenze di densità di allevamento larvale, è importante che mosche sperimentale in diversi flaconcini sono allevati in densità simile. Il passo precedente viene eseguito per evitare di confondere gli effetti.</li>
	<li>Incubare per 24 h a 25 ° C in un h 12 h:12 ciclo di luce: buio fino alla deposizione delle uova si è verificato. Se ci sono troppo poche uova dopo 24 h, forniscono un periodo più lungo di assuefazione. Sostituire le piastre di agar a apple e consentire la deposizione delle uova per verificarsi per un ulteriore 24 h.</li>
	<li>Prendere i piatti carichi di uovo apple-agar dalla gabbia della popolazione. Rimuovere la restante pasta di lievito e qualsiasi mosche morte dalla superficie dell'agar.</li>
	<li>Immergere l'agar in 20 mL di tampone fosfato salino (PBS): 1x e staccare delicatamente le uova da apple-agar con un pennello fine. Mentre sospeso in PBS, trasferire le uova a un tubo di centrifuga da 50 mL e lasciare per 5 minuti in modo che depositano le uova sul fondo. Nota: La maggior parte delle uova si trovano sul bordo esterno dell'agar.</li>
	<li>Rimuovere tagliando il fondo 4 mm di un puntale filtrato p1000 e utilizzare la punta della pipetta per disegnare 1 mL di soluzione, prelevati dal fondo della provetta centrifugo 50ml. Questo trasferimento a un tubo per microcentrifuga da 1,5 mL e permettono di riposare. Nota: Quando si pipetta uova, snap-liberare lo stantuffo è più efficiente di una versione dolce.</li>
	<li>Rimuovere tagliando il fondo 4 mm di un puntale filtrato p20. Impostare la pipetta un volume desiderato e disegnare dalla parte inferiore del tubo del microcentrifuge. Nota: Con la pratica, un volume di 5 µ l contiene circa 100 uova.</li>
	<li>Versare le uova raccolte sul cibo e lasciare loro di sviluppare per la quantità di tempo necessaria.</li>
</ol>3. coltura
<ol><li>Per crescere culture p. entomophila e p. aeruginosa , inoculare 10 mL di brodo di Luria-Bertani (LB) con 100 µ l di azione batterica congelate a 30 ° C (p. entomophila) e 37 ° C (p. aeruginosa), rispettivamente. Agitare a 150 giri/min durante la notte. Assicurare che la coltura batterica raggiunge la fase di saturazione.</li>
	<li>Affinché i batteri usati per vaccinare le mosche sono in fase esponenziale e rapidamente la replica, inoculare la cultura durante la notte in una nuova sottocultura, di un volume desiderato, la mattina seguente. Assicurarsi che pre-l'inoculo 10% del volume totale della cultura sottocultura. Nota: Infezione orale richiede alta. Pertanto è necessario crescere un cospicuo volume di coltura batterica, in modo che sufficiente cultura di inoculazione può essere prodotto per la dose desiderata e la dimensione sperimentale. Calcolare quanta sottocultura è necessaria per produrre dosi infettive richieste utilizzando l'equazione MsVs = MioVho, dove M rappresenta una cultura di densità ottica misurata a 600 nm (OD600) valore e V rappresenta la volume. Lettere in pedice si riferiscono se la cultura è usata come una sottocultura (s) o una dose infettiva (i).</li>
	<li>Crescere questa sottocultura in una beuta da 2 L in un volume tale che la superficie di sottocultura cade (al massimo) appena sopra l'inizio della pendenza di pallone. Non riempire oltre questo come esso sarà acrobazia la crescita dei batteri.</li>
	<li>Garantire che i batteri in questa sottocultura sono in fase di crescita esponenziale misurando il OD ogni 30 min. Nota: Ciò si verifica dopo 3 – 5 h, dove la sottocultura raggiunge un OD600 tra 0,6-0,8.</li>
	<li>Versare volumi uguali di questa sottocultura attraverso 50 mL provette da centrifuga e girare la sottocultura a 2.500 x g per 15 min a 4 ° C per appallottolare i batteri. Una volta pellettati, rimuovere e poi girare il surnatante nuovamente alle condizioni di cui sopra per confermare la rimozione della maggior parte dei batteri. Nota: Un pellet di dimensione trascurabile (inferiore a 1 mm in altezza) lo conferma.</li>
	<li>Combinare i pellet batterici dei tubi separati da ri-sospendendoli in 5 mL di surnatante sottocultura e ricombinando queste soluzioni in un tubo singolo 50 mL. Girare questa cultura concentrata a 2.500 x g per 15 min a 4 ° C per appallottolare i batteri.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet finale batteri in soluzione di acqua di saccarosio di 5%. Controllare il diametro esterno e regolare per la dose infettiva desiderata (OD600 = 100 per p. entomophila8 e OD600 = 25 per p. aeruginosa16,28), ri-sospendendo il pellet in 5% soluzione acquosa di saccarosio al volume richiesto. Nota: La quantità di soluzione di acqua di saccarosio di 5% da aggiungere può essere calcolata utilizzando l'equazione nel passaggio 3.2.1 (MsVs = MioVho).</li>
</ol>4. oralmente infettare mosche
<ol><li>Per garantire l'infezione orale, morire di fame le mosche per 2 – 4 h prima dell'esposizione ai batteri trasferendo le mosche per flaconi standard agar (Tripla 1 L acqua distillata H2O, 20 g di agar, 84 g zucchero di canna, 7ml Tegosept agente anti-fungine).</li>
	<li>Preparare i flaconcini di infezione mentre mosche sono essere affamati. Trasformare il coperchio di una provetta 7 mL una fiala di infezione di Pseudomonas di pipettaggio 500 µ l di agar standard zucchero e lasciarlo asciugare. Collocare un disco di carta da filtro nel coperchio e pipettare 100 µ l di coltura batterica direttamente sul disco filtro. Per le infezioni di controllo, è necessario sostituire la coltura batterica con lo stesso volume di soluzione di acqua 5% saccarosio su carta da filtro.</li>
	<li>Aggiungere mosche singole provetta del campione e lasciare per 18 – 24 h.</li>
	<li>Per confermare l'infezione orale, prima superficie-sterilizzare le mosche immediatamente dopo l'esposizione batterica, ponendoli in 100 µ l di etanolo al 70% per 20 – 30 s. rimuovere l'etanolo e aggiungere 100 µ l di triple distillata acqua per 20 – 30 secondi prima di rimuovere l'acqua. Aggiungere 100 µ l di PBS 1X e omogeneizzare al volo.</li>
	<li>Trasferire l'omogeneizzato alla riga superiore di una piastra a 96 pozzetti e aggiungere 90 µ l di 1X PBS ogni ben di sotto.</li>
	<li>Diluire in serie questo esempio per distinguere un valori di intervallo di CFU. Prendere 10 µ l di omogenato nel pozzo superiore e aggiungere questo ben di sotto. Ripetere questo passaggio con il secondo bene, trasferire 10 µ l per il terzo e così via, per diluizioni seriali come molti come richiesto. Nota: È importante che i nuovi puntali vengono utilizzati per ogni serie di diluizioni.</li>
	<li>Piastra le diluizioni seriali su una piastra di agar nutriente LB in 5 µ l gocce, affinché che tutte le goccioline rimangono discrete.</li>
	<li>Incubare le piastre di Agar LB durante la notte a 30 ° C e 37 ° C per p. entomophila e p. aeruginosa, rispettivamente e contare CFUs visibile. Nota: Mentre microbi dell'intestino della drosofila richiedono condizioni di crescita anaerobica distinti, terreno selettivo, ad esempio Pseudomonas isolamento medio (PIM), può essere utilizzato per assicurarsi che solo Pseudomonas CFUs sono contati.</li>
	<li>Calcolare il numero di CFU per volare contando il numero di colonie presenti alla diluizione seriale dove 10 – 60 CFUs sono chiaramente visibili. Quindi moltiplicare per il fattore di diluizione presente per calcolare il numero di batteri per volare.</li>
	<li>Effettuare analisi statistiche. Ove necessario, trasformare il CFUs per volare su una distribuzione normale. Fare questo registro-trasformazione. Una volta trasformato, è possibile utilizzare modelli lineari generalizzati (GLMs)30,31,32 per verificare come i gruppi di trattamento differiscono in CFUs al volo (utilizzando pacchetti comunemente disponibili software statistici come R33). Nota: Il restante omogeneato Vola può essere utilizzato per misurare l'espressione genica attraverso l'analisi di PCR (RT-qPCR) trascrizione d'inversione quantitativa. Difficoltà l'omogeneizzato in 50 µ l di reagente di isolamento del RNA, estrarre RNA e quantificare i titoli specifici geni immuni da RT-qPCR (Vedi ad es., Gupta e Vale16 per un protocollo dettagliato). L'espressione delle trascrizioni del gene immune specifico dovrebbe essere normalizzato per i livelli di trascrizione di un gene housekeeping (cioè, rp49) ed espresso come una piega cambia rispetto al controllo mosche utilizzando il metodo 2−ΔΔCt 31, 32,33,34.</li>
</ol>5. registrazione sopravvivenza dopo l'infezione
<ol><li>Infettare mosche oralmente come descritto al punto 4.2.</li>
	<li>Trasferire gli infetti o controllo mosche da loro fiale rispettivi infezione in standard Lewis fiale e mantenere in un incubatore a 25 ° C in un h 12 h:12 chiaro-scuro del ciclo (o desiderato condizioni). Tenere mosche finché siano morti.</li>
	<li>Contare il numero di mosche vivi o morti in ogni fiala ogni giorno, o come spesso come richiesto.</li>
	<li>Trasferire le mosche a new Fiale ogni 5 giorni per evitare le mosche conficcate nel cibo.</li>
	<li>Media ± SE sopravvivenza proporzionale plottaggi o presentare questi dati come curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier (KM). Per analizzare l'effetto di diversi fattori e/o i loro rispettivi interazioni uno con l'altro utilizzare un pacchetto statistico (ad esempio, il pacchetto "sopravvivenza" in R33) per eseguire un'analisi di sopravvivenza come il rischi proporzionali di Cox modello35.</li>
</ol>6. misurazione della carica batterica
<ol><li>Al punto di tempo desiderato, è possibile trasferire una singola Mosca infettata ad un tubo del microcentrifuge sterili da 1,5 mL.</li>
	<li>Superficie sterilizzare le mosche come descritto al punto 4.4.</li>
	<li>Omogeneizzare al volo e quantificare la carica batterica utilizzando il protocollo descritto nei passaggi 4.5 – 4,10.</li>
</ol>7. misurare spargimento batterico
<ol><li>Misurare lo spargimento a fianco del carico interno.</li>
	<li>Dopo l'infezione, trasferimento singoli mosche per microcentrifuga da 1,5 mL contenente ~ 50 µ l di terreno di Lewis per 24 h.</li>
	<li>Rimuovere le mosche per la misura di carico interno (Vedi punto 6) e lavare le provette con 100 µ l di PBS 1X nel Vortex pesantemente per 3 s.</li>
	<li>Misurare il CFUs in questo lavaggio di placcatura su agar nutriente LB usando lo stesso protocollo, come descritto nei passaggi 4.6 – 4.8.</li>
	<li>Dopo l'infezione, trasferimento singoli mosche per microcentrifuga da 1,5 mL contenente ~ 50 µ l di terreno di Lewis per 24 h.</li>
	<li>Trasferire le mosche in nuove provette microcentrifuga contenente ~ 50 µ l di terreno di Lewis per un ulteriore 24 h. lavare le provette contaminate con 100 µ l di PBS 1X nel Vortex pesantemente per 3 s.</li>
	<li>Misurare il CFUs in questo lavaggio di placcatura su agar nutriente LB usando lo stesso protocollo descritto nei passaggi 4.6 – 4.8.</li>
	<li>Ripetere i punti 7.2 e 7.3 e registrare la mortalità vola ogni trasferimento.</li>
</ol>

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Vi presentiamo un protocollo per infettare in modo affidabile oralmente d. melanogaster con agenti patogeni batterici. Ci concentriamo su p. aeruginosa e p. entomophila, ma questo protocollo può essere facilmente adattato per consentire l'infezione di altre specie batteriche, per esempio, i marcescens del Serratia7. Gli aspetti chiave del presente protocollo varierà tra specie batteriche. Conseguenza, la dose infettiva più efficiente, virulenza corrispondente e suscettibilità genotipo dell'ospite dovrebbero tutti essere considerati e idealmente testati in studi pilota. Esponendo le mosche a colture batteriche di una gamma di densità ottica e misura loro dose infettiva e la sopravvivenza è un punto di partenza appropriato quando si lavora con nuove specie batteriche o fili di Mosca.
Procedura di protocollo come vola fame prima dell'alimentazione e pellet ri-sospensione batterica in soluzione di 5% di saccarosio sono comuni nell'infezione orale e aumentare l'affidabilità dell'infezione batterica durante l'esposizione7,8, 9 , 10. Tuttavia, è importante notare che durante l'esposizione, mosche vivono essenzialmente su una superficie di coltura batterica. Nel processo di camminare su questa cultura, batteri saranno diventato depositati sulla superficie della Mosca, soprattutto sulla cuticola o intorno le setole24. Questi batteri epicuticolari, non riflettono un infezione enterica successo ma sarebbe ancora rilevato dall'omogeneizzazione volare e placcatura. Per ridurre la possibilità di falsi positivi, è essenziale alla superficie sterilizzare mosche attraverso immersione in etanolo al 70% per fino a 1 min.
Quando considerando tassi di spargimento batterici, infezione orale è essenziale. Il numero di agenti patogeni che un host rilascia nell'ambiente è spesso difficile da misurare e il carico interno è preso spesso come un proxy per la severità dell'infezione e, pertanto, trasmissione26,27. Misurazione della carica batterica al fianco di spargimento batterico permette un esame del rapporto tra queste due componenti importanti della malattia gravità e diffusione38. Una limitazione del metodo presentato è che diluire la carica batterica interna di mosche richiede campionamento distruttivo. Questo rende difficile indagare la longitudinale tendenze di sviluppo del patogeno e sdoganamento all'interno dell'individuo stesso. Tuttavia, è possibile superare questa limitazione di coorti di campionamento in maniera distruttiva degli individui nelle diverse fasi dell'infezione, sotto l'ipotesi che il carico medio microbo in ogni gruppo riflette le dinamiche di agente patogeno longitudinale all'interno di qualsiasi dato individuali. Spargimento batterico non soffre le stesse limitazioni, e offriamo esempi di come lo spargimento può essere quantificato in un campione rappresentativo, o longitudinalmente per indagare come spargimento cambia all'interno di un individuo nel tempo.
Molti tratti di ospite e patogeno determinano congiuntamente la propensione di un individuo per trasmettere la malattia25,26,39. Mentre il significato di questi tratti probabili varia tra i sistemi ospite-patogeno, spargimento è probabilmente un elemento determinante della trasmissione fecale-orale. La capacità di misurare lo spargimento batterico si apre la possibilità di testare questa ipotesi. Avendo caratterizzato dinamiche di ospite-patogeno in un pannello desiderato di volare linee, sperimentatori potrebbero oralmente infettare gli individui e metterli insieme a padroni di casa non infetti, suscettibile durante i loro periodi infettivi. Queste mosche 'destinatari' potrebbero quindi essere analizzate per interno carico batterico a vari intervalli di tempo come un modo di misurare direttamente la trasmissione.

La Mosca della frutta (anche conosciuto come il fly di aceto), d. melanogaster, è stato ampiamente utilizzata come organismo modello per l'infezione e immunità contro una varietà di agenti patogeni1,2. Questo lavoro ha offerto intuizioni fondamentali le conseguenze fisiologiche di infezione e fu anche pioniere nel dipanare i meccanismi molecolari sottostanti la risposta immunitaria contro le infezioni batteriche, fungine e virali parassitoide. Questa conoscenza non è solo utile per capire la risposta immunitaria innata di insetti e altri invertebrati, ma perché molti dei meccanismi immuni sono evolutivamente conservate tra insetti e mammiferi, Drosophila ha anche stimolato la scoperta dei principali meccanismi immuni nei mammiferi, compreso gli esseri umani3.
Maggior parte del lavoro su Drosophila infezione e immunità ha incentrato sulle infezioni sistemiche, utilizzando metodi di inoculazione che consegno patogeni direttamente nel corpo dell'insetto di pizzicore o iniezione4,5,6. Il vantaggio di questi metodi nel permettere la consegna di una dose infettiva controllata è chiaro e supportato da un grande corpo di lavoro su infezioni sistemiche. Tuttavia, molti agenti patogeni batterici naturali di d. melanogaster sono stati acquisiti tramite alimentazione sulla decomposizione di materia organica dove l'immunocompetenza intestino svolge un ruolo significativo in host difesa7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. esperimenti che impiegano infezioni sistemiche ignorare queste difese e, pertanto, fornire un quadro del tutto diverso di come insetti montare le difese contro gli agenti patogeni naturali. Questo è particolarmente rilevante se lo scopo del lavoro è di testare le previsioni sull'ecologia e l'evoluzione dell'infezione, dove l'uso di agenti patogeni naturali e itinerari dell'infezione sono importante16,17. Lavoro recente ha evidenziato come il percorso intrapreso dai patogeni significativamente influenza malattia risultato18,19, suscita vie immuni distinte20,21, può determinare l'effetto protettivo di ereditato endosimbionti16e potrebbe anche giocare un ruolo importante nell'evoluzione dell'host difese17.
Un altro motivo per impiegare orale itinerari dell'infezione è che permette l'indagine della variazione nella trasmissione dell'agente patogeno misurando lo spargimento batterica durante l'escrezione fecale dopo infezione orale22,23, 24. comprendere le fonti di eterogeneità di ospite nella trasmissione della malattia è impegnativo in popolazioni naturali25,26, ma componenti di trasmissione, come agente patogeno spargimento, sotto controllati del laboratorio di misurazione condizioni offre un utile approccio alternativo27. Da nutrire mosche batteri e misura batterica spargimento sotto una varietà di contesti genetici ed ambientali in condizioni sperimentali controllate, è possibile identificare fonti di variazione della trasmissione tra padroni di casa.
Qui, descriviamo un protocollo per infettare oralmente d. melanogaster con batteri patogeni e per quantificare la crescita batterica e spargimento che segue (Figura 1). Descriviamo questo protocollo su due batteri Pseudomonas : un ceppo virulento di patogeno opportunista p. aeruginosa (PA14) e un ceppo meno virulento del naturale volare patogeno p. entomophila. Pseudomonas sono batteri gram-negativi comuni con una gamma ampia host, infettando gli insetti, nematodi, piante e vertebrati e si trovano nella maggior parte dei ambienti4,6. Infezione enterica di Drosophila da p. aeruginosa e p. entomophila risultati in patologia a epiteli intestinali12,13,14,15, 28. Mentre ci concentriamo su questi due batteri patogeni, i metodi descritti qui possono in linea di principio essere applicati a qualsiasi agente patogeno batterico di interesse con modifiche minori. A seguito di esposizione orale, misuriamo la sopravvivenza post-infettiva e misurare il carico di microbo all'interno di singoli mosche e i microbi vitali versato nell'ambiente, espressa in unità (CFUs) di formazione di colonie. Infine, perché l'immunocompetenza intestino deriva da una combinazione di barriera epiteliale e risposte umorali, misuriamo anche la sopravvivenza delle linee volare dove queste difese sono interrotti. In particolare, Drosocrystallin (Dcy) mutanti sono stati precedentemente indicati per essere più suscettibili all'infezione batterica orale a causa di una matrice peritrofica impoverito nel budello29. Misuriamo anche la sopravvivenza in un mutante di Relish (Rel), che è ostacolata dalla produzione di peptidi antimicrobici contro batteri gram-negativi tramite la IMD percorso30.

<table><tbody><tr><td>Fiale</td><td>Sarstedt Ltd.</td><td>58.490</td><td>Polistirene tubo base piatta 75 mm x 23,5 mm, 23 ml</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7002</td><td>Agar, cenere 2,0-4,5%</td></tr> <tr><td>Zucchero di canna</td><td>Bidvest</td><td>66032</td><td>Zucchero tenero di canna chiaro</td></tr><tr><td>Mais</td><td>Dove's Farm</td><td></td><td>Farina di mais biologica</td></tr><tr><td>Lievito Fermipan</td><td>Bidvest</td><td>96360</td><td>Lievito secco istantaneo</td></tr><tr><td>Metil-4-idrossibenzoato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5501</td><td>>=99,0%,</td></tr><tr><td>saccarosio</td> cristallino <td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td>Saccarosio BioUltra, per biologia molecolare, >=99,5% (HPLC)</td></tr><tr><td>Piastre di Petri</td><td>Fisher Scientific UK Ltd.</td><td>15788517</td><td>X600 Petri Dish 90 X 16.2MM Provette sterili Triple Vent</td></tr><tr><td>Falcon (50ml)</td><td>Greiner Bio-one Inc</td><td>210261</td><td>Provetta da centrifuga, 50ml, bordata, insaccata, sterile</td></tr><tr><td>Provetta Eppendorf (0.5ml)</td><td>Sarstedt Ltd.</td><td>72.699</td><td>Sarstedt Micro Tubo Base Conica Tappo a Pressione 0,5ml Standard Neutro</td></tr><tr><td>Eppendorf tubo (1,5ml)</td><td>Sarstedt Ltd.</td><td>72.690.001</td><td>Sarstedt Micro Tubo Base Conica Tappo di Pressione 1.5ml Standard</td></tr><tr><td>Etanolo Neutro</td><td>VWR International Ltd.</td><td>20821.33</td><td>ETANOLO ASSOLUTO ANALAR NP ACS/R.PE -</td></tr><tr><td>Pallone conico</td> di grado analitico da 2 L <td>VWR International Ltd.</td><td>214-0038</td><td>Pallone Erlenmeyer a collo stretto, 2 L</td></tr><tr><td>Carta da filtro sterile</td><td>Fisher Scientific UK Ltd.</td><td>1001-020</td><td>Cerchio e fogli semplici; Ritenzione di particelle: maggiore di 11um; Velocità di filtrazione: 150 herzberg; Flusso d'aria: 10,5 s/100 ml/in2; Porosità media; Superficie liscia; Grado 1; Tipo: cerchio; Diametro: contenitore</td></tr><tr><td>per campioni Bijou</td> da 20 mm <td>Fisher Scientific UK Ltd.</td><td>129A</td><td>Contenitore per campioni di polistirene da 7 ml</td></tr><tr><td>Pseudomonas agar per isolamento</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17208</td><td>Contiene agar 13,6 g/L, cloruro di magnesio 1,4 g/L, digestato peptico di tessuto animale 20 g/L, solfato di potassio 10 g/L, triclosan 0,025 g/L</td></tr><tr><td>LB brodo, Miller</td><td>Fisher Scientific UK Ltd.</td><td>BP1426</td><td>Contiene 10 g di triptone, 5 g di estratto di lievito, 10 g di cloruro di sodio per litro</td></tr><tr><td>Gabbie per la raccolta di embrioni di grandi dimensioni</td><td>Scientific Laboratory Supplies Ltd.</td><td>59-101</td><td>Flystuff - adatto per piastra di Petri da 100 mm</td></tr><tr><td>Soluzione di reagenti TRI</td><td>Life Technologies</td><td>AM9738</td><td></td></tr><tr><td>Micropiastra a 96 pozzetti</td><td>Scientific Laboratory Supplies Ltd.</td><td>353072</td><td>Falcon 96 Micropiastra per colture cellulari in polistirene trattato con TC a fondo piatto ben trasparente con coperchio Pestello sterile</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific UK Ltd</td><td>12649595</td><td>pestello, presterilizzato; Axygen; Macina tessuti; Blu; Costruzione in polipropilene inerte; Adatto a provette da centrifuga da 1,5 e 2,0 ml; Incartato singolarmente; 100/PK</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Scientific Laboratory Supplies Ltd.</td><td>CHE2068</td><td>Glicerolo A.R. 99,5% 2,5 L</td></tr><tr><td>Cotone idrofilo - non assorbente</td><td>Cowens Ltd</td><td>ABL</td><td>Non assorbente Grande quantità 20 sacchetti x 500</td></tr><tr><td>Cotone idrofilo assorbente</td><td>Cowens Ltd</td><td>ABS</td><td>BP piccola quantità 20 sacchetti x 500</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisherbrand</td><td></td><td>Whirlimixer 75W 50-6-Hz 220-240V</td></tr><tr><td>Incubatore orbitale</td><td>Gallenkamp</td><td>INR-200-010V</td><td>220 V, 50 Hz, 5 A. Temperatura nominale: 70&ordm;C. Frequenza di agitazione: 0...400 giri/min.</td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre ad assorbanza</td><td>Biotek Instruments Ltd</td><td></td><td>ELx808&trade; Lettore di micropiastre ad assorbanza</td></tr><tr><td>Gen 5 Software per lettore e imager di micropiastre</td><td>Biotek Instruments Ltd</td><td></td><td>per centrifuga per lettore di micropiastre ad assorbanza</td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>392304</td><td>Centrifuga da banco Allegra X-12R, refrigerata 50Hz 230V</td></tr><tr><td>Step One Plus Sistema qPCR in tempo reale</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>4376600</td><td>Biosistemi applicati Sistema qPCR</td></tr> <tr><td>in tempo reale Step One PlusStep One Software 2.3</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td>Per sistemi qPCR in tempo reale Stepone e SteponePlus</td></tr><tr><td>R Software statistico</td><td>https://cran.r-project.org/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>10 &micro; L puntali per pipette</td><td>Greiner Bio-one Inc</td><td>741015</td><td>Easlyload in stile Gilson. Graduato, trasparente, ricarica, 960 pz</td></tr><tr><td>200 & micro; L puntali per pipette</td><td>Greiner Bio-one Inc</td><td>741065</td><td>Easlyload in stile Gilson. Graduato, trasparente, ricarica, 960 pz</td></tr><tr><td>1000 &; L puntali per pipette</td><td>Greiner Bio-one Inc</td><td>741045</td><td>Easlyload in stile Gilson. Graduato, trasparente, ricarica, 960 pz</td></tr><tr><td>20 & micro; L puntali per pipette filtrati</td><td>Greiner Bio-one Inc</td><td>774288</td><td>Puntale filtrante in stile gilson. Trasparente, rack blu, confezione singola, senza R/Dnase, 10 rack da 96 pezzi</td></tr><tr><td>200 & micro; L puntali per pipette filtrati</td><td>Greiner Bio-one Inc</td><td>739288</td><td>Puntale filtrante in stile gilson. Trasparente, rack blu, confezione singola, senza R/Dnase, 10 rack da 96 pezzi</td></tr><tr><td>1000 & micro; Puntali per pipette filtrati L</td><td>Greiner Bio-one Inc</td><td>740288</td><td>Puntale filtrante in stile gilson. Trasparente, rack blu, confezione singola, senza R/Dnase, 10 rack da 60 pezzi</td></tr></tbody></table>

infezione batterica orale e spargimento in drosophila melanogaster

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Moscerino della frutta Drosophila melanogaster è uno dei migliori sistemi di modello sviluppato di infezione e l'immunità innata. Mentre la maggior parte del lavoro si è concentrata su infezioni sistemiche, c'è stato un recente aumento di interesse nei meccanismi di immunocompetenza intestino ai patogeni, che richiedono metodi di infettare oralmente mosche. Qui presentiamo un protocollo per esporre oralmente individuali vola verso un patogeno opportunista batterico (Pseudomonas aeruginosa) e un agente patogeno batterico naturale di d. melanogaster (Pseudomonas entomophila). L'obiettivo del presente protocollo è quello di fornire un metodo affidabile per esporre mosche maschi e femminile a tali agenti patogeni. Forniamo risultati rappresentativi mostrano fenotipi di sopravvivenza, carichi di microbo e batterico spargimento, che è rilevante per lo studio dell'eterogeneità nella trasmissione dell'agente patogeno. Infine, confermiamo che Dcy mutanti (manca la matrice peritrofica protettiva nell'epitelio dell'intestino) e assaporare mutanti (manca una via di deficit immunitario funzionale (IMD)), mostrano una predisposizione aumentata all'infezione batterica orale. Questo protocollo, quindi, descrive un metodo affidabile per infettare mosche utilizzando la via di infezione, che può essere estesa allo studio di una fonti di varietà genetica e ambientale di variazione in esiti di infezione intestinale e trasmissione batterica orale.

Qui, presentiamo illustrativi risultati dagli esperimenti dove d. melanogaster oralmente è stato infettato con p. aeruginosa o p. entomophila. Nella figura 2 viene illustrato il successo infezione orale di mosche dopo un periodo di esposizione 12h o 24h per le colture batteriche di OD600 = 25 e 100 per p. aeruginosa (Figura 2A) e p. entomophila (Figura 2B C), rispettivamente. Figura 2B illustra l'importanza dell'utilizzo di una cultura più concentrata di p. entomophila, indicato tramite l'aumento in carica batterica quando mosche sono esposti a colture batteriche di maggiore densità ottica. Maschi e femminile Oregon R (OreR) mosche eliminare p. aeruginosa infezione allo stesso tasso (Figura 3) e versato lo stesso numero di p. aeruginosa CFUs (Figura 4A). Quando infettati con p. entomophila tuttavia, mosche OreR maschili e femminili differiscono nel numero di capannone di batteri, in modo che cambia nel tempo (Figura 4B). Maschi e femmine muoiono da p. aeruginosa (Figura 5A) e p. entomophila (figura 5B) ai tassi differenti. Vediamo anche che Dcy mutanti (che mancano la matrice peritrofica protettiva nell'epitelio dell'intestino) e mutanti di Relish (che mancano un percorso immune funzionale di IMD), mostrano la sopravvivenza in diminuzione dopo p. aeruginosa p. entomophila e infezione orale (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig1.jpg"> Figura 1: Panoramica schematica dei protocolli per la misurazione di sopravvivenza, spargimento e carica batterica interna dopo l'infezione orale in Drosophila melanogaster. Un'illustrazione di 3 esperimenti potenziale dopo l'infezione orale di d. melanogaster. Misurare la 'sopravvivenza' trasferimento singoli mosche per fiale e registrando la loro durata infetto. Misurare 'spargimento' trasferendo mosche singole provette per microcentrifuga da 1,5 mL con 50 µ l di terreno di Lewis nel tappo. Dopo 24 h nel tubo, rimuovere al volo e vortice il tubo con 100 µ l di 1X PBS. Rimuovere e questa soluzione su agar nutriente LB per calcolare lo spargimento batterico della lastra. Misurare lo spargimento al volo stesso longitudinalmente, trasferendo mosche ai tubi freschi con il mezzo di Lewis nel tappo dopo 24 h e lavatrice e placcatura tubo ora contaminato. 'Carico interno' della Mosca può essere misurato prendendo un infetto fly, superficie di sterilizzazione, e d'omogeneizzazione prima infine placcatura omogenato su agar nutriente LB. Questo può essere eseguito dopo spargimento è stato misurato per calcolare come il 'carico interno' e correlare spargimento. L'illustrazione utilizzata in questa figura è stata originariamente disegnata da B. Nuhanen36. Gli autori lo hanno modificato per accompagnare la curva di Kaplan-Meier di esempio che è presa da Wikimedia Commons37. Tutte le altre illustrazioni sono originali. <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig2.jpg"> Figura 2: dose infettante dei batteri dopo l'infezione orale. (A) dose infettiva di maschio e femmina Oregon-R Vola a seguito dell'esposizione ad una cultura di p. aeruginosa (OD600 = 25) per 12 h. La media e SE sono stati calcolati da 3 maschi e 3 femmine. (B) dose infettiva di femmine di selvaggio-tipo esogamico dopo l'esposizione ad una delle quattro p. entomophila culture (OD600 = 100, 25, 50 e 75) o controllare 5% soluzione di saccarosio per 24 h. La differenza statistica di (F3,76 = 18.567, p &lt; 0,001) nella dose infettiva fra i trattamenti di esposizione è denotato da diverse lettere sopra bar. I mezzi sono stati calcolati da 5 mosche per il OD600 = 0 dose e 18-20 per tutte le altre dosi. (C) la dose infettiva di maschio e femmina Oregon-R Vola a seguito di esposizione alla cultura di p. entomophila (OD600 = 100) per 24 h. La media e SE sono stati calcolati da 20 maschi e 20 femmine. <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig3.jpg"> Figura 3: Carico interno p. aeruginosa in mosche dopo infezione orale. Il carico batterico media ± SE di sesso maschile e femminile Oregon-R vola dopo l'infezione orale con p. aeruginosa (OD600 = 25) fino a post-infezione 168 h. La media e SE di ogni punto di tempo sono calcolati da 3 individui. Carica batterica interna della Mosca cambia in modo significativo nel tempo (p &lt; 0,001). <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig4.jpg"> Figura 4: batterica spargimento dopo l'infezione orale. (A) p. aeruginosa capannone dalle mosche stessi utilizzati nella Figura 3, fino post-all'infezione 120 h. La media e SE sono stati calcolati da 3 maschi e 3 femmine. (B) p. entomophila capannone da maschio e femmina Oregon-R vola dopo l'infezione orale con p. entomophila (OD600 = 100) fino a post-infezione 120 h. La media e SE sono stati calcolati da 34 maschi e 38 femmine. Sia p. aeruginosa di p. entomophila, il numero di CFUs capannone da un Mosca cambia in modo significativo nel tempo (p &lt; 0,001). <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig5.jpg"> Figura 5: sopravvivenza di mosche dopo infezione batterica orale. Curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier (KM) di (A) Oregon-R maschio e femmina vola dopo l'infezione orale con p. aeruginosa (OD600 = 25) o controllare 5% soluzione di saccarosio. La curva di sopravvivenza di KM è stata calcolata da 4 flaconcini di 20 mosche per gruppo di trattamento. (B) OreR maschio e femmina vola dopo infezione orale con p. entomophila (OD600 = 100). La curva di sopravvivenza di KM è stata calcolata da 4 singolo controllo mosche e 34 mosche infette per sia i maschi che le femmine. (C) Immune mutanti: Dcy (mutante di matrice Drosocrystallin-peritrofica) e Rel (mutante Relish-IMD), esposti a p. entomophila (Pe), p. aeruginosa (Pa14) o una soluzione di saccarosio di 5% di controllo. Tutti i gruppi infetti muoiono significativamente più velocemente che il controllo di mosche (p &lt; 0,001). <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo protocollo descrive metodi per esporre oralmente e di infettare il moscerino della frutta Drosophila melanogaster con batteri patogeni e per misurare il numero di batteri infettivi capannone dopo l'infezione dell'intestino. Descriviamo ulteriormente l'effetto di mutanti immuni sulla sopravvivenza vola dopo l'infezione batterica orale.

Infezione batterica orale e spargimento in Drosophila melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'infezione e dell'immunità, ad esempio come rispondono gli individui alle diverse radici dell'infezione? Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'esame dell'immunocompetenza intestinale che svolge un ruolo significativo nella difesa dell'ospite contro le infezioni, che vengono acquisite principalmente attraverso l'alimentazione. Questo metodo ha il potenziale per essere utilizzato in specie diverse dalla Drosophila e può essere utilizzato anche per studiare altri agenti patogeni, come i virus.In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa del rigore sperimentale richiesto durante questi protocolli di microbiologia. Conservare le mosche in fiale di plastica da 23 millilitri contenenti sette millilitri di terreno Lewis appena fatto. Per tappare le fiale, utilizzare un batuffolo di cotone non assorbente.Conservarli a 25 gradi Celsius in un ciclo luce-buio 12-12 con un'umidità relativa di circa il 60%Ogni 14 giorni, trasferire da 20 a 30 adulti in una nuova fiala di cibo, con un pizzico di lievito secco aggiunto sulla superficie. Dopo due o tre giorni, eliminare le mosche adulte se sono state deposte uova sufficienti. Per raccogliere le uova, preparare una gabbia per la popolazione.Per prima cosa, aggiungi un batuffolo di cotone imbevuto d'acqua per fornire umidità. Quindi, per un substrato, utilizzare un piatto da 75 millilitri riempito con agar di mele e una crema spalmabile di pasta di lievito. Infine, carica gli adulti in una gabbia di popolazione.A intervalli di 24 ore, riposizionare la piastra e verificare la presenza di uova. Una volta deposte abbastanza uova, rimuovere le mosche morte dal piatto e la pasta di lievito rimanente dal piatto raccolto. Quindi immergere l'agar in 20 millilitri di PBS e rimuovere delicatamente le uova, usando un pennello fine.Trasferisci le uova nel PBS in un tubo da 50 millilitri. Quindi lasciare che le uova affondino sul fondo per circa cinque minuti. Successivamente, accorcia l'estremità di una punta p1000 di circa 4 millimetri, quindi usala per aspirare le uova in soluzione.Uno sgancio a scatto dello stantuffo è efficace per tirarli su. Quindi trasferire le uova in PBS in un tubo da 1,5 millilitri e lasciare che le uova si depositino. Ora taglia quattro millimetri da una punta p20 filtrata e poi usala per trasferire un'aliquota di uova su una fiala di cibo da sviluppare.Per coltivare colture di P.entomophila e P.aeruginosa, inoculare 10 millilitri di brodo LB con 100 microlitri di brodo congelato e incubarlo durante la notte con 150 giri/min di agitazione. Quindi, trasferisci la coltura in un pallone conico da due litri e riempilo con LB fino all'inizio della pendenza delle pareti del pallone. Quando la sottocoltura raggiunge la fase di crescita esponenziale, trasferire volumi uguali in un numero pari di provette da 50 millilitri, quindi farle girare verso il basso.Quindi raccogli i surnatanti e girali di nuovo. Ora combina i pellet batterici da tutte le provette risospendendo ogni pallet in cinque millilitri di surnatante, quindi ricombina le sospensioni in un'unica provetta da 50 millilitri. Quindi, dopo un altro giro, risospendere i batteri in una soluzione di saccarosio al 5%.Ora diluire un campione di questa sospensione 100 volte per misurare in modo affidabile il diametro esterno della sospensione e regolare la concentrazione finale della sospensione in base alla dose infettiva desiderata. Da due a quattro ore prima dell'infezione orale, trasferire i moscerini in fiale di agar standard che non contengono cibo. Nel frattempo, per ogni mosca, prepara una fiala di infezione.Per prima cosa, caricare il coperchio di una provetta da sette millilitri con 500 microlitri di zucchero agar standard e lasciarlo solidificare. Quindi, infilare un disco di carta da filtro nell'agar, quindi pipettare 100 microlitri di coltura batterica direttamente sul disco filtrante. Per i controlli, utilizzare il 5% di acqua di saccarosio.Dopo il periodo di fame, trasferire le singole mosche nelle provette preparate. Dopo aver incubato le mosche per 18-24 ore, sterilizzare le mosche in superficie. Caricare le persone in un tubo contenente 100 microlitri di etanolo al 70%.Dopo 20-30 secondi, rimuovere l'etanolo e sostituirlo con 100 microlitri di acqua tripla distillata. Dopo altri 20-30 secondi, rimuovere l'acqua. Quindi aggiungere 100 microlitri di PBS e omogeneizzare la mosca.Trasferire l'omogeneizzato nella fila superiore di una piastra a 96 pozzetti e aggiungere 90 microlitri di 1x PBS a ogni pozzetto sottostante. Quindi, utilizzando aliquote da 10 microlitri, diluire in serie questo campione per distinguere un intervallo di valori di UFC. Quindi, piastra le diluizioni seriali su una piastra di agar nutriente LB in goccioline da cinque microlitri.Posizionare le goccioline in modo che si trovino discretamente sulla piastra. Quindi incubare la piastra per una notte. Il giorno successivo, calcolare il numero di CFU dalla diluizione che produce da 10 a 60 colonie chiaramente visibili.Per misurare la carica batterica, trasferire una singola mosca infetta in una provetta sterile da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Quindi, come descritto in precedenza, sterilizzare superficialmente le mosche, quindi omogeneizzarle ed eseguire un'analisi CFU. Per misurare la diffusione batterica, trasferire le singole mosche in provette da 1,5 millilitri contenenti circa 50 microlitri di terreno di Lewis.Cambiare il tubo ogni 24 ore. Dopo che tre tubi sono stati popolati per 24 ore, smaltire le mosche. Dopo ogni trasferimento, misurare i batteri contenuti nella provetta.Miscelare il contenuto del tubo con 100 microlitri di PBS utilizzando un vortice. Quindi misurare le CFU nella miscela mediante diluizioni seriali di placcatura. Utilizzando il protocollo descritto, l'effetto dell'infezione batterica orale è stato studiato attraverso la mortalità e la diffusione batterica.Lo spargimento è stato misurato longitudinalmente negli stessi moscerini e in singoli punti temporali insieme a una carica batterica interna. D.melanogaster è stato infettato per via orale da P.aeruginosa o P.entomophila. L'infezione orale riuscita si è verificata dopo un periodo di esposizione di 12 o 24 ore a colture batteriche.E' stato necessario utilizzare una coltura più concentrata di P.entomophila. I maschi e le femmine di mosche dell'Oregon R hanno eliminato l'infezione da P.aeruginosa allo stesso ritmo e hanno perso lo stesso numero di CFU di P.aeruginosa. Quando sono stati infettati da P. entomophila, tuttavia, i maschi e le femmine di mosche dell'Oregon R differivano nel numero di batteri diffusi in modo dipendente dal tempo.Maschi e femmine sono morti a causa di P. aeruginosa e P. entomophila a tassi diversi. In confronto, i moscerini mutanti che mancano della matrice peritrofica protettiva nell'epitelio intestinale muoiono più velocemente, così come i mutanti che mancano di una via immunitaria IMD funzionale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come infettare la Drosophila per via orale con i batteri e misurare gli aspetti chiave della patologia risultante, come la durata della vita e la diffusione batterica.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita da sei a otto ore, nel corso di due giorni, se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la qRT-PCR per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio il modo in cui l'infezione modifica l'espressione genica immunitaria. Non dimenticare che lavorare con agenti patogeni batterici può essere estremamente pericoloso e che quando si eseguono queste procedure è necessario prendere sempre precauzioni come indossare i dispositivi di protezione individuale appropriati e lavorare all'interno di una cappa a flusso laminare.

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Wolbachia infezione batterica in Drosophila

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Stabilimento dell'infezione batterica nelle larve di Drosophila

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In questo video, dimostriamo una tecnica per misurare la carica batterica di E. coli dopo aver iniettato E. coli nel torace di Drosophila melanogaster.

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Sistemica infezione batterica e immunitario Difesa fenotipi in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

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Allevamento la mosca della frutta<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Sotto axeniche e Gnotobiotic Condizioni

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Estrazione di emociti da larve di Drosophila melanogaster per infezione microbica e l'analisi

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Impara a infettare oralmente Drosophila melanogaster con batteri patogeni e misurare lo spargimento batterico. Questo metodo permette di studiare l'immunità intestinale e le interazioni ospite-patogeno in vivo.

Infezione batterica orale e spargimento in Drosophila melanogaster

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