Name: Caratterizzazione delle glicoproteine con la piega di immunoglobulina mediante cristallografia a raggi x e tecniche biofisiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Scopri la caratterizzazione strutturale e biofisica delle glicoproteine con piega di immunoglobulina mediante cristallografia a raggi X, interferometria a strato biologico e calorimetria a titolazione isoterma.

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Esperimenti di diffrazione di raggi x descritti in questa carta sono stati eseguiti utilizzando beamlines 08-ID e 08-BM alla fonte di luce canadese, che è sostenuto dalla Fondazione Canada per innovazione, scienze naturali e ingegneria Research Council of Canada, il Università di Saskatchewan, il governo di Saskatchewan, Canada di diversificazione economica occidentale, il Canada del Consiglio nazionale delle ricerche e istituti canadesi di ricerca sanitaria. Vorremmo riconoscere la strutturale & biofisica Core Facility, The Hospital for Sick Children, per l'accesso agli strumenti telematici e BLI. J.E.O. è stato sostenuto da Banting Postdoctoral Fellowship BPF-144483 dall'istituti canadesi di ricerca sanitaria. T.S. è un destinatario di un Canada Graduate Scholarship Master Award e un Vanier Canada Graduate Scholarship dall'istituti canadesi di ricerca sanitaria. Questo lavoro è stato supportato da sovvenzione PJT-148811 (J.-P.J.) dall'istituti canadesi di ricerca sanitaria di funzionamento. Questa ricerca è stata intrapresa, in parte, grazie ai finanziamenti del programma Canada ricerca sedie (J.-P.J.).

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Ancorata alla membrana glicoproteine sono critici per la funzione cellulare e attraente bersagli terapeutici. Qui, presentiamo un protocollo per la caratterizzazione strutturale e biofisica di ECD di glicoproteine di membrana, sia da solo che in complesso con ligandi di piccole molecole e frammenti favolosi. Abbiamo utilizzato con successo questo protocollo per determinare la struttura di cristallo dei tre domini Ig N-terminale-la maggior parte della porzione extracellulare dell'umano CD2228, un critico co-recettore sulle cellule B coinvolti nel mantenere l'immunità umorale nel controllo79. Abbiamo anche caratterizzato il sito di legame del CD22 con suo ligando naturale α2-6 sialyllactose e definito le modalità di riconoscimento di un anticorpo terapeutico verso umano CD22. Questi risultati forniscono le comprensioni il rapporto struttura-funzione di membro chiave della famiglia Siglecs che ha limitato l'espressione sulle cellule B e una tabella di marcia molecolare verso lo sviluppo di nuovo CD22 mirati piccola molecola e base di anticorpi terapeutica. Mentre questo protocollo è stato usato con successo per un recettore delle cellule B Ig-contenente, proponiamo che il nostro approccio può essere applicato per la caratterizzazione strutturale e biofisica di qualsiasi glicoproteina di membrana con un'organizzazione di dominio distinti. In tali casi, costruire design e combinatoria glycan N-collegati mutazioni (sia a Gln o Ala) possono essere valutate per trovare un costrutto adatto per la crescita del cristallo e diffrazione ad alta risoluzione.
Ottenere un campione omogeneo e puro della glicoproteina è di importanza critica per la crescita dei cristalli e diffrazione di raggi x, così come per la caratterizzazione biofisica a valle. Glycans N-collegati presenti sulle glicoproteine sono intrinsecamente eterogenee e possono causare eterogeneità conformazionale e chimici all'interno la glicoproteina che può scoraggiare la formazione di cristalli. Per ridurre questa micro-eterogeneità, strategie che introducono mutazioni puntiformi per rimuovere residui di Asn prevedute per harbor glycans N-collegati, o utilizzando linee cellulari mutanti (ad esempio HEK293S) seguita da trattamento con punti (ad esempio EndoH) possono notevolmente migliorare la cristallizzazione successo15,21,22. In questo protocollo, discutiamo la purificazione delle glicoproteine solubili e Fabs che sono secreti nella cella surnatante. Secrezione di glicoproteina fornisce un percorso relativamente semplice verso la purezza, senza la necessità di lisi delle cellule o l'aggiunta di prodotti chimici o detergenti. La cella surnatante, ottenuta seguente cella raccolta è quindi eseguire direttamente sopra una colonna che ha affinità per la proteina di interesse (ad es., Ni-NTA per glicoproteine His-tag, o affinità di LC per frammenti Fab). Tuttavia, in base alla colonna di utilizzo e le condizioni della cella surnatante (ad es., pH), la capacità di legame della proteina di interesse per la colonna può essere influenzata. Se questo è il caso, può essere necessario concentrare e cambio la cella surnatante per migliorare l'associazione alla colonna del buffer. Inoltre, si raccomanda vivamente che passi di controllo di qualità durante la purificazione impiegata per aiutare a valutare la purezza della proteina. In esecuzione di un gel di SDS-PAGE o Western blot di tutti i campioni (prima, durante e dopo le fasi di purificazione) può produrre intuizioni che lo schema proposto purificazione sia adatto alla proteina di interesse. Se bande di contaminanti sono visibili su SDS-PAGE, o se alcune specie sono ottenuti durante la purificazione (per esempio, parecchi picchi sull'esclusione di dimensione), fasi di purificazione supplementare dovrebbe essere considerato, per esempio, cromatografia a scambio ionico, per ottenere in purezza e aumentare le probabilità di cristallizzazione a valle80.
Per cristallizzazione macromolecolare, è spesso critico per ottenere rendimenti elevati della proteina di interesse per consentire la proiezione di un gran numero di potenziali condizioni di cristallizzazione a concentrazioni ad alta percentuale proteica per trovare adatto cristallo hits. Generalmente, le linee di cellule HEK293 discusse qui (HEK293F e HEK293S) sono sistemi di espressione robusta e possono essere facilmente scalate per produrre altro campione come necessario. Tuttavia, è possibile che la proteina di interesse non può esprimere sufficientemente all'interno di queste linee cellulari. In questi casi, altre linee cellulari, quali Expi293 cellule81,82, sono stati trovati per mostrare i livelli superiori di espressione della proteina e dovrebbero essere considerati come un'alternativa.
Se ben ordinati, generano cristalli non si ottengono seguendo la sperimentazione di diversi costrutti della proteina di interesse nonostante l'elevata purezza, può essere necessario ampliare le tecniche di cristallizzazione per promuovere la formazione di cristalli. Esso ha dimostrato che frammenti Fab di anticorpi e nanobodies possono essere esaltatori di cristallizzazione eccellente e promuovere ben ordinato cristallo imballaggio83,84,85. Questi frammenti possono essere espresse e purificati ad omogeneità e utilizzati in un complesso con la proteina di interesse per favoriscono la cristallizzazione. D'importanza, frammenti Fab prodotti come descritto nella sezione 10 possono avere una tendenza a formare non funzionali LC dimeri86. Questi dimeri sono contaminanti e dovrebbero essere rimosso durante la purificazione. Nella nostra esperienza, spesso LC dimeri hanno un volume di conservazione diversi sull'esclusione di dimensione, o eluire come un picco distinto su cromatografia a scambio ionico e quindi possono essere rimosso dalla purificazione Fab - tuttavia questo non è sempre il caso. Se queste tecniche non sono sufficienti per rimuovere dimeri di LC da purificazione Fab, metodi di purificazione supplementare, come la purificazione di affinità della proteina G, possono essere impiegati per migliorare la purezza.
In alternativa alla co-complessazione con frammenti Fab, tecniche ben documentate come matrici random microseeding possono migliorare le probabilità di ottenere cristalli ben ordinati63,70. Questo metodo prevede l'aggiunta di piccole quantità di cristalli schiacciati, non ottimali nella condizione di cristallizzazione, fornendo un cristallo mononucleato per promuovere la crescita dei cristalli. Questa operazione può essere eseguita utilizzando cristalli della proteina di interesse, o quelli con struttura simile di architettura e terziario del dominio. Inoltre, matrici random microseeding può essere eseguita nei tentativi di cristallizzare la proteina da solo, o in complesso con un frammento Fab o piccola molecola di interesse. Gli avanzamenti recenti nella crio-microscopia elettronica anche fare questa tecnica alternativa alla cristallografia a raggi x per ottenere informazioni strutturali ad alta risoluzione per molecole con caratteristiche appropriate87,88, 89,90,91.
Quando graduale dei set di dati di diffrazione di raggi x non riesce dal sig, HA ammollo è necessario per risolvere il problema di fase di dispersione anomala o sostituzione isomorfa. Ispezione della sequenza dell'amminoacido della proteina può fornire indizi circa la strategia per derivatizzazione ettari, tra cui pH ottimale per l'associazione. In particolare, spaiati cisteine all'interno della proteina possono legano specificamente HA composti che contengono mercurio. Ammollo cristalli nativi con composti HA è un processo iterativo per determinare l'identità del ottimale HA composto, la sua concentrazione e il tempo di incubazione richiesto. Se tentativi iniziali di immersione totale non danno ben generano cristalli contenente un HA adatto per l'eliminazione, può essere necessario introdurre sostituzioni dell'amminoacido per migliorare la probabilità di associazione HA e migliorare segnale anomalo. Gli esempi includono mutazioni per includere un residuo di cisteina libera per associare in modo efficiente Hg, Au, Pt o Pb. espressione di proteine per graduale anomali in un media di seleno-metionina completato in e. coli è ampiamente usato per fasatura anomala, tuttavia un sistema equivalente che incorpora in modo affidabile seleno-metionina non è prontamente disponibile per cellule di mammifero in sospensione92,93ed è un'area di sviluppo futuro.
Una volta ottenuta la struttura di legame della glicoproteina di interesse, ammollo cristalli con ligandi di piccola molecola può essere eseguita per ottenere una struttura del complesso recettore-ligando immuni. Questi dati forniscono un modello per la progettazione razionale di ligandi ad alta affinità e più specifici che può essere utilizzato come piccolo-molecola terapeutica, nonché fornisce approfondimenti ad alta risoluzione la funzione biologica della glicoproteina. Quando si tenta di ammollo cristalli glicoproteina con ligandi di piccola molecola di interesse, ispezione della struttura cristallina unliganded possibile indicare se ammollo dovrebbe essere possibile. Se nelle vicinanze cristallo-imballaggio contatti si trovano in tutto il sito di ligand-legantesi o nei dintorni di regioni prevede a subire cambiamenti conformazionali su ligando vincolanti, ammollo sarà probabilmente essere problematico. In questo caso, devono essere eseguite altri metodi quali co-cristallizzazione del complesso proteina-ligando.

Proteine di superficie svolgono un ruolo critico nella funzione cellulare. Queste proteine di membrana, attraverso i loro domini extracellulari, è in grado di modulare interazioni cellula-cellula, adesione, i trasporti e segnalazione1,2. La localizzazione extracellulare di queste proteine che li rende attraenti bersagli per lo sviluppo di terapie per il trattamento di una vasta gamma di malattie, compreso cancro e malattie autoimmuni3,4,5 , 6 , 7. uno dei più comuni pieghe della membrana umana proteine extracellulari è la piega di immunoglobulina-come (Ig), che è formata da sette o più β-fili disposti in due β-fogli8,9. In genere, Ig-contenenti glicoproteine sono strutture multidominio con domini Ig disposti in sequenza sulla porzione extracellulare della proteina della membrana10. Modificazioni post-traduzionali di queste proteine di superficie delle cellule, in particolare N - e O-collegata della glicosilazione, hanno dimostrate di svolgono un ruolo essenziale nella loro regolazione, pieghevole, secrezione e funzione11. Per migliorare la nostra comprensione della loro funzione e per meglio terapeutica di progettazione che possa usarli come destinazione, sono necessarie tecniche che consentono per la loro caratterizzazione molecolare dettagliata. Qui, presentiamo una combinazione di tecniche che consentano la biofisica (interferometria biolayer (BLI) e calorimetria isotermica di titolazione (ITC)) e caratterizzazione strutturale (cristallografia a raggi x) del dominio extracellulare di Ig-contenenti glicoproteine di membrana, da solo e in complesso con i loro ligandi biologicamente rilevanti e molecole terapeutiche (Figura 1).
N-collegata della glicosilazione è uno della più comuni modificazioni post-traduzionali delle proteine di mammifero e si verifica durante la maturazione della proteina all'interno del reticolo endoplasmatico e Golgi12,13. Linee cellulari, quali 293 cellule embrionali umane del rene (HEK), sono stati sviluppati per l'espressione ricombinante di grandi quantità di proteine di mammiferi glicosilata14,15. Questa linea cellulare è stata sviluppata in un formato di sospensione, che permette per la facilità di produzione di proteine in quantità maggiori rispetto alle linee cellulari aderenti la scalabilità. Qui, utilizziamo due linee di cellule HEK293: HEK293F e Gnt HEK293 io- / - (HEK293S), che si differenziano per l'assenza di N-acetilglucosaminil transferasi I (Gnt io) in quest'ultimo. A sua volta, produzione di glicani complessi (come visto in HEK293F) non è possibile e invece alta mannosio-tipo glicani (principalmente Man5GlcNAc2) risiedono a N-collegati glycan siti18,19,20 . Utilizzo di queste linee due cellulari in parallelo permette di studiare l'effetto di glycan dimensione e complessità sulla funzione biologica e targeting terapeutico. Infatti, glicoproteine prodotte nelle cellule HEK293F avrà glicani più grandi, più complesse rispetto alla stessa glicoproteina prodotta in cellule di HEK293S. Glicoproteine prodotte nelle cellule HEK293S sono più suscettibili di cristallizzazione, a causa della ridotta eterogeneità chimica e conformazionale di loro glycans N-collegati. Per migliorare ulteriormente crystallizability, glicoproteine prodotte nelle cellule HEK293S (ma non HEK293F) possono essere trattate con l'enzima endoglycosidase H (Endo H), che provoca la scissione dei glicani alta mannosio tale che solo un singolo N-acetilglucosamina (GlcNAc) frazione rimane a ogni N-collegata della glicosilazione sito21,22. Altri metodi è utilizzabile anche per limitare l'elaborazione di N-glycan all'interno delle cellule, come l'aggiunta di inibitori di glycosyltransferase durante l'espressione della glicoproteina, tra cui kifunensine23. Approcci alternativi implicano l'espressione delle glicoproteine nativi (nelle cellule HEK293F) seguita da deglycosylation enzimatica utilizzando il peptide N-glycosidase F (PNGaseF). Tuttavia, deglycosylation con PNGaseF ha dimostrato di essere meno efficace nelle circostanze natali e aumenta l'aggregazione in alcune proteine; nei casi quando la proteina rimane solubile dopo il trattamento, esso acquisisce cariche negative sulla sua superficie a causa la deamidazione del residuo dell'asparagina in acido aspartico24, che potrebbe essere dannosa per la sua cristallizzazione. Predetto N-glicosilazione siti possono anche essere mutati, più spesso ai residui di alanina o glutamina, per impedire la glicosilazione N-collegati a questi siti e per generare i campioni della glicoproteina di alta omogeneità. In alternativa, glicoproteine possono essere prodotti in altre culture di cellula eucariotica, inclusi lievito, insetto e sistemi di impianto o altre linee di cellule di mammifero come criceto cinese ovarico (CHO) cellule16,17.
Molti vettori di espressione dei mammiferi, tra cui pHLsec, consentono per la secrezione della glicoproteina ricombinante extracellulari in cella media25. Secrezione di glicoproteine da cellule HEK293 consente di rapida e facile purificazione senza la necessità di lisi delle cellule. Aggiunta di tag di purificazione (ad es., His-tag, Strep-tag, bandiera-tag, Myc-il tag, HA-tag) fino al capolinea N o C della destinazione della glicoproteina permette la purificazione di una cromatografia di affinità passo singolo. Successivamente, la cromatografia di esclusione di formato può essere utilizzata per produrre un campione monodisperso per la caratterizzazione biofisica e strutturali.
Un campione di glicoproteina altamente puro e omogeneo in condizioni adeguate può causare cristalli ben diffrangano. Una volta che un set di dati di diffrazione di raggi x completo è stato ottenuto da tali cristalli, fasi iniziali devono essere determinate per calcolare la densità dell'elettrone della glicoproteina. Grazie a un numero sempre crescente di strutture in Protein Data Bank (PDB), il metodo più comunemente utilizzato per l'eliminazione è diventato di gran lunga sostituzione molecolare (MR), che utilizza una struttura di proteina correlata per ottenere fasi iniziali26. Tuttavia, quando MR non riesce a risolvere il problema di fase, come occasionalmente è stato il caso per multi-Ig dominio glicoproteine27,28,29, metodi alternativi sono necessari. In questo articolo, abbiamo un metodo in ammollo cristalli con atomi pesanti (HA) per fasatura, che era necessario per risolvere la struttura del CD22 ectodomain28in dettaglio. Identificare il diritto HA graduale è un processo iterativo che dipende dalla reattività HA, atomi disponibili nella glicoproteina in una determinato grata di cristallo e la cristallizzazione soluzione30,31. In alternativa, gli atomi di zolfo naturale nei residui di cisteina e metionina possono essere utilizzati per l'eliminazione se presenti un rapporto abbastanza alto per altri atomi nella glicoproteina e dati di diffrazione di raggi x possono essere raccolti con ridondanza abbastanza alto32, 33.
La funzione biologica di glicoproteine della membrana è spesso mediata da interazioni proteina-proteina o interazioni proteina-ligando, come con i carboidrati. Quando il ligando è abbastanza piccolo per diffondere dalla soluzione per il sito di legame della glicoproteina nella grata di cristallo, ammollo esperimenti può avere successo per ottenere una struttura di co-cristallo glicoproteina-ligando per comprendere meglio il riconoscimento del ligando.
I protocolli presentati qui sono anche rilevanti per la comprensione delle interazioni di glicoproteine di superficie con ligandi sintetici terapeutico34,35 e anticorpo terapeutica36,37. Quando combinato con informazioni strutturali, associazione cinetica e termodinamica può essere potente per capire e migliorare i loro meccanismi di azione. Una tecnica che permette l'analisi cinetica di anticorpi terapeutici in associazione a una glicoproteina è BLI38,39. BLI utilizza biosensori con un ligando immobilizzato per misurare la cinetica di associazione e dissociazione con un partner di associazione, in definitiva determinare una costante di dissociazione di equilibrio (KD). BLI è un approccio attraente poiché piccole quantità di glicoproteine sono necessari (< 100 µ g), tempo di esperimento è veloce (~ 10-15 min per corsa), e può essere automatizzato. ITC è inoltre utile per lo studio delle affinità tra glicoproteine e associazione partner40,41,42,43. Mentre ITC è più tempo e reagente intensivo, preziose informazioni sono ottenibili per quanto riguarda la termodinamica dell'interazione (ΔG, ΔH, ΔS e stechiometria). ITC è anche molto utile per lo studio delle interazioni deboli che sono spesso associati con l'associazione transitoria di glicoproteine di superficie di ligandi. Inoltre, queste tecniche possono essere utilizzate in combinazione per valutare l'associazione di diversi costrutti e valutare l'effetto di differenti glicoforme N-collegati ottenuti dall'esprimere la glicoproteina in differenti linee cellulari. Esecuzione di BLI e ITC con glicoproteine prodotte in HEK293F, HEK293S e trattati con Endo H può fornire una visione approfondita del ruolo dei glicani attività biologica ed impegno terapeutico.
Abbiamo applicato con successo questi protocolli per caratterizzare il dominio extracellulare (ECD) di umano CD2228, un membro della glicoproteina della famiglia di lectine (Siglecs) per acido sialico-associazione Ig-like che è essenziale per il mantenimento dell'omeostasi delle cellule di B44 . Abbiamo effettuato approfondite costrutto design per facilitare la cristallizzazione e gradualmente il dataset di raggi x da HA ammollo con Hg. Abbiamo anche bagnato CD22 cristalli con suo acido sialico di ligando (α2-6 sialyllactose) per ottenere una struttura del complesso recettore-ligando immuni e così forniti i progetti per la progettazione della struttura-Guida di glycan mimetics45,46. Inoltre, abbiamo generato l'associazione di antigene di frammento (Fab) dell'epratuzumab anticorpo terapeutico anti-CD22 - un candidato terapeutico attualmente in studi clinici di fase III per non-Hodgkin linfoma47- per determinare la sua affinità di legame di BLI e ITC a differenzialmente glicosilata CD22 ECD costruisce. Questi studi hanno rivelato un ruolo critico per N-collegata della glicosilazione nel fidanzamento epratuzumab, con potenziali implicazioni per CD22 riconoscimento sulle cellule B disfunzionale.

<table><tbody><tr><td>0,22 &mu; m Filtro Steritop</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPS02RE</td><td></td></tr><tr><td>10 pozzetti 4-15% gradiente SDS-PAGE gel</td><td>Bio-Rad</td><td>4561084</td><td></td></tr><tr><td>10x glicotampone 3</td><td>New England Biolabs</td><td>P0702S</td><td>Viene fornito con reagente Endo H</td></tr><tr><td>10x Kinetics Buffer</td><td>PALL Fort&eacute; Bio</td><td>18-1092</td><td></td></tr><tr><td>10x tampone Tris/Glycine/SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>1 mL fondo rotondo blocco da 96 pozzetti</td><td>ThermoFisher</td><td>260251</td><td></td></tr><tr><td>22 mm vetrino coprioggetto</td><td>Hampton research</td><td>HR3-231</td><td></td></tr><tr><td>4x tampone per campioni Laemmli</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>96-3 pozzetti INTELLIPLATE&nbsp; riserva a basso volume</td><td>Art Robbins Strumenti</td><td>102-0001-03</td><td></td></tr><tr><td>AgeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0552S</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; KTA Pure</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&Auml; Inizio KTA&nbsp;</td>Dispositivo di filtrazione centrifuga <td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 10KDa MWCO</td><td>Millipore</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo di filtrazione centrifuga Amicon Ultra 4 10KDa MWCO</td><td>Millipore</td><td>UFC801008</td><td></td></tr><tr><td>Auto-iTC200</td><td>Malvern</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axygen MaxyClear Snaplock 1,5 mL microprovette</td><td>Fisher Scientific</td><td>MCT150C</td><td></td></tr><tr><td>Countess Cell Counting Camera Vetrini</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>CryoLoop 18 x 0,05-0,1 mm</td><td>Hampton research</td><td>HR4-945</td><td></td></tr><tr><td>CryoLoop 18 x 0,1-0,2 mm</td><td>Hampton research</td><td>HR4-947</td><td></td></tr><tr><td>CryoLoop 18 x 0,2-0,3 mm</td><td>Hampton research</td><td>HR4-970</td><td></td></tr><tr><td>Bagno a secco digitale</td><td>Bio-Rad</td><td>1660562EDU</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH5&alpha;</td><td>Invitrogen</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>Endo H</td><td>New England Biolabs</td><td>P0702S</td><td></td></tr><tr><td>Pallone di Erlenmeyer (base deflettore), policarbonato, sterile, 500 mL, DuoCAP</td><td>TriForest Labware</td><td>FBC05000S</td><td></td></tr><tr><td>pallone di Erlenmeyer 125 mL (base deflettore), policarbonato, sterile, 125 mL con tappo ventilato</td><td>VWR</td><td>89095-258</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Pipetta sierologica sterile monouso, apirogena, 10 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Pipetta sierologica sterile monouso, apirogena, 25 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>760180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Pipetta sierologica sterile monouso, apirogena, 5 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Pipetta sierologica sterile monouso, apirogena, 50 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>768180</td><td></td></tr><tr><td>FectoPRO Reagente per trasfezione DNA, Polyplus</td><td>VWR</td><td>10118-842</td><td></td></tr><tr><td>Cellule Freestyle 293F</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R79007</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di espressione Freestyle</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12338001</td><td></td></tr><tr><td>Schermi per atomi pesanti Au</td><td>Hampton research</td><td>HR2-444</td><td></td></tr><tr><td>Schermi per atomi pesanti Hg Hampton</td><td>research</td><td>HR2-446</td><td></td></tr><tr><td>Schermi Heavy Atom M1</td><td>Hampton research</td><td>HR2-448</td><td></td></tr><tr><td>Schermi Heavy Atom M2</td><td>Hampton research</td><td>HR2-450</td><td></td></tr><tr><td>Schermi Heavy Atom Pt</td><td>Hampton research</td><td>HR2-442</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293S</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap Affinity Column</td><td>GE Healthcare</td><td>17525501</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap KappaSelect Affinity Columns</td><td>GE Healthcare</td><td>17545811</td><td></td></tr><tr><td>Colonne di affinità HiTrap LambdaSelect GE</td><td>Healthcare</td><td>17548211</td><td></td></tr><tr><td>KpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>MCSG-1 Crystal Screen Blocco da 1,7 mL Anatrace</td><td></td><td>MCSG-1</td><td></td></tr><tr><td>MCSG-2 Crystal Screen Blocco da 1,7 mL</td><td>Anatrace</td><td>MCSG-2</td><td></td></tr><tr><td>MCSG-3 Crystal Screen Blocco</td> <td>da 1,7 mLAnatrace</td><td>MCSG-3</td><td></td></tr><tr><td>MCSG-4 Crystal Screen Blocco da 1,7 mL</td><td>Anatrace</td><td>MCSG-4</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di mercurio</td><td>Sigma</td><td>1044170100</td><td></td></tr><tr><td>Micropiastra, 96 pozzetti, polipropilene, fondo piatto, nero&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655209</td><td></td></tr><tr><td>Minstrel DT UV</td><td>Formulatrix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multitron Pro shaker</td><td>Infors HT</td><td>MP25-TA-CO2HB</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000/2000c Spettrofotometro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Nanosep 3K Omega dispositivo centrifugo</td><td>PALL Life Science</td><td>OD003C33</td><td></td></tr><tr><td>Biosensori Ni-NTA</td><td>PALL Forte&eacute; Bio</td><td>18-5102</td><td></td></tr><tr><td>Ottetto RED96</td><td>PALL ForteBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oryx 4 robot cristallizzato</td><td>Douglas Instrument</td><td>ORY-4/1</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di platino</td><td>Sigma</td><td>520632-1g</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K210006</td><td></td></tr><tr><td>Quick Coomassie Stain</td><td>Protein Ark</td><td>GEN-QC-STAIN-1L</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip Sterile 50 mL Monouso Sistema di Filtrazione Sottovuoto 0,22 &; m Millipore Express</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17517201</td><td></td></tr><tr><td>Cluster di bromuro di tantalio</td><td>Jena bioscience</td><td>PK-103</td><td></td></tr><tr><td>Top96 Schermo di cristallizzazione</td><td>Reagenti Rigaku</td><td>1009846</td><td></td></tr><tr><td>Tryphan Blue</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>VDX 24 pozzetti con sigillante</td><td>Hampton research</td><td>HR3-172</td><td></td></tr><tr><td>&alpha; 2-6 sialillattosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8556-1mg</td><td></td></tr></tbody></table>

caratterizzazione delle glicoproteine con la piega di immunoglobulina mediante cristallografia a raggi x e tecniche biofisiche

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Glicoproteine sulla superficie delle cellule giocano un ruolo critico nella funzione cellulare, compresi segnalazione, adesione e trasporto. Sui leucociti, diverse di queste glicoproteine possiedono pieghe dell'immunoglobulina (Ig) e sono al centrali di regolazione e riconoscimento immune. Qui, presentiamo una piattaforma per la progettazione, l'espressione e la caratterizzazione biofisica del dominio extracellulare del recettore umano delle cellule di B CD22. Proponiamo che questi approcci sono ampiamente applicabili alla caratterizzazione della glicoproteina mammiferi extracellulari contenenti domini Ig. Due sospensione linee cellulari embrionali umane del rene (HEK), HEK293F e HEK293S, sono usati per esprimere le glicoproteine che harbouring glicani complessi e ad alta-mannosio, rispettivamente. Queste glicoproteine ricombinanti con differenti glicoforme consentono lo studio dell'effetto di glycan dimensioni e composizione il grippaggio del ligand. Discutiamo i protocolli per lo studio della cinetica e termodinamica dell'associazione glicoproteina da ligandi biologicamente rilevanti e anticorpo terapeutico candidati. Glicoproteine ricombinanti prodotte nelle cellule HEK293S sono suscettibili di cristallizzazione a causa di omogeneità glycan, ridotta flessibilità e suscettibilità al trattamento endoglycosidase H. Vi presentiamo metodi per ammollo cristalli glicoproteina con atomi pesanti e piccole molecole per fase determinazione e analisi del grippaggio del ligand, rispettivamente. I protocolli sperimentali discussi qui tengono la promessa per la caratterizzazione delle glicoproteine mammiferi per dare loro funzione: spaccato e studiare il meccanismo di azione di terapeutica.

Diversi costrutti di CD22 ECD sono stati con successo clonati nel vettore di espressione pHLsec e overexpressed in mammiferi linee di cellulari HEK293F e HEK293S (Figura 2 e 3A). Tutti i costrutti sono stati purificati per omogeneità di dimensioni di cromatografia di esclusione di formato e ha reso un campione altamente puro per gli studi di cristallizzazione (Figura 3B e 3C). Il costrutto di CD22 che ha portato a ben generano cristalli era il troncamento d1-d3 (residui 20-330), con cinque dei sei siti previsti N-collegata della glicosilazione mutati da Asn a Ala (N67A, N112A, N135A, N164A e N231A), prodotta nelle cellule HEK293S, tali che solo il sito di glicosilazione posizione N101 è stato mantenuto (questo costrutto è denominato CD2220-330, 5A). Cristalli sono stati ottenuti in diverse condizioni dello schermo matrice sparsa MCSG-1, ma i migliori cristalli erano da una condizione contenente 30% (p/v) di polietilenglicole 4000, 0,2 M di cloruro di litio e 0,1 M Tris, pH 8.5. Questi cristalli nativi diffratte 2.1 risoluzione Å; utilizzando strutture conosciute di domini Ig delle proteine relative Siglec non ha dato alcun soluzioni nelle ricerche di MR.
Per acquisire informazioni phasing, ci siamo immersi cristalli nativi con un pannello di composti HA incluso Hg, Pt, Os, Ta e Br alle concentrazioni che variano da 1 a 20 mM di HA composto per un periodo di incubazione da 5 min di 1 d (Figura 4). Abbiamo monitorato i cristalli per i cambiamenti nella morfologia e abbiamo trovato che cristalli imbevuto con composto a 20mm HA provocato la fessurazione rapida e la dissoluzione del cristallo. Abbiamo congelato un totale di 63 cristalli che conservava la loro forma seguendo i tempi di incubazione indicati che sono stati impregnati con cluster di tantalio bromuro, cloruro di platino, acetato mercurico e cloruro mercurico. Cristalli imbevuto con 7 mM di cloruro mercurico per 30 min ha mostrato il segnale anomalo su un'esplorazione di fluorescenza presso la sorgente di luce canadese (CLS) 08-BM beamline (Saskatoon, Canada) e ammessi per dispersione anomala di multi-lunghezza d'onda raggi x raccolta dati su un singolo cristallo. Questi set di dati ha permesso di risolvere la sottostruttura di mercurio di CD2220-330, 5A, che ha rivelato un atomo di mercurio singolo associato a una cisteina libera alla posizione C308 e in ultima analisi ci ha permesso di costruire la struttura del CD225A 20-330, nella graduale Mappa di densità dell'elettrone utilizzando AutoBuild78.
Una volta che la struttura unliganded è stato risolto, eravamo interessati a risolvere la struttura del CD22 associato a suo ligando, α2-6 siallylactose. In primo luogo abbiamo calcolato l'affinità del CD22 verso α2-6 sialyllactose usando ITC per caratterizzare la termodinamica di associazione dell'interazione. Abbiamo osservato un'affinità di ~ 280 µM e utilizzato queste informazioni per identificare una concentrazione iniziale (~ 100 x KD) del ligando da utilizzare per l'ammollo dei nostri cristalli di20-330, 5A CD22 nativi. Abbiamo imbevuto i CD2220-330, 5A cristalli con 25 mM siallylactose per 5 min, 2 h, 14 h, 40h e 5D e monitorato per i cambiamenti nella morfologia di cristallo. Un totale di ~ 75 cristalli furono congelati da vari momenti e CLS sincrotrone beamline 08-ID (Saskatoon, Canada) per la raccolta dei dati remota. Un totale di sei raggi x DataSet sono stati raccolti da cristalli ben diffrangano. La struttura di ogni set di dati di raggi x è stato risolto da MR utilizzando il legame CD2220-330, 5A struttura come un modello di ricerca iniziale. La densità risultante dell'elettrone per tutti i DataSet è stato poi ispezionata per densità positiva nella mappa Fo-Fc che corrisponderebbe per associato α2-6 sialyllactose all'interno del sito di associazione di CD22. Notevolmente, tutti i set di dati raccolti, anche quelli da cristalli imbevuti dopo soli 5 minuti del tempo di incubazione, contenuta densità positiva corrispondente ligando nel sito di legame. Strutture complessive del legame e CD22 liganded erano altamente simili con minimi cambiamenti conformazionali, che potrebbero spiegare il successo degli esperimenti a immersione totale con α2-6 sialyllactose.
Successivamente abbiamo caratterizzato la superficie antigenica del CD22 riconosciuto da anticorpo terapeutico epratuzumab in esperimenti BLI e ITC (Figura 5). Cinetica e termodinamica profili di epratuzumab associazione Fab per CD22 costrutti con differenti glicoforme ha rivelato un'affinità crescente per CD22 con dimensione ridotta glycan N-collegati, con fino a un 14-fold miglioramento nell'affinità per piccoli glicani (327 nM vs 24 nM in BLI; 188 nM nM di vs 58 in ITC). Il CD22 N-collegati glycan che limitano l'accesso dell'anticorpo a suo epitopo è stato identificato da BLI usando mutanti di singolo punto di CD22 e risolvendo l'epratuzumab Fab-CD22 d1-d3 co-cristallo struttura28.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig1.jpg"> Figura 1 . Panoramica di caratterizzazione della glicoproteina dal costrutto design alla caratterizzazione strutturale e biofisiche. (1) analisi di sequenza primario della glicoproteina rappresentativa. In grigio, il dominio extracellulare (ECD); in verde, il segmento transmembrana (TM); e in blu, il dominio citosolico della glicoproteina. Predetto glycans N-collegati sono etichettati. (2) clonazione dei costrutti di ECD. (3) espressione di costrutti di ECD in cellule di mammifero. (4) purificazione della glicoproteina. Mentre proteine espresse in HEK293F conterrà glicani complessi, proteine espresse in HEK293S avrà alta mannosio glicani. Trattamento enzimatico delle glicoproteine prodotte nelle cellule HEK293S con Endo H risultati in glicoproteine con solo una frazione di GlcNAc presso siti di glicosilazione N-collegati. (5a) glicoproteine sono testati per il loro legame degli anticorpi da interferometria biolayer (BLI) e calorimetria isotermica di titolazione (ITC). Affinità per i ligandi del piccoli può anche essere misurata da ITC. (5b) prove di cristallizzazione delle glicoproteine con omogeneo glycans N-collegati, come quelli espressi in HEK293S e deglicosilata con Endo H. (6) In alcuni casi, la mutazione di N-collegata della glicosilazione siti è necessario ottenere cristalli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig2.jpg"> Figura 2 . Progettazione di CD22 ectodomain DNA costruisce per l'espressione in cellule di mammifero. A) rappresentazione del plasmide pHLsec utilizzato per trasfezione transiente di costrutti CD22 ECD. AgeI e KpnI siti utilizzati per la clonazione sono indicati con caselle rosse. B) The CD22 ECD contiene sette domini Ig (d1-d7) e 12 previsto N-collegata della glicosilazione siti (in blu). Quattro costrutti sono stati progettati da DCE CD22. C) gel di agarosio 1% risultati amplificati PCR di ECD CD22 costruisce per clonazione nel vettore di espressione di pHLsec. Prima corsia contiene 1 kb DNA marker. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig3.jpg"> Figura 3 . Espressione e purificazione delle glicoproteine. A) effetto della densità delle cellule sui rendimenti di espressione. Espressione della glicoproteina in cultura su piccola scala 25 mL di HEK293F sospensione cellule trasfettate utilizzando tre differenti densità iniziale delle cellule (0,5 x 106 cellule mL-1, 1,0 x 106 cellule mL-1e 1,5 x 106 cellule mL -1). Quantificazione effettuata da densitometria da SDS-PAGE nel pannello di sinistra e di BLI quantitativa nel pannello di destra. Valori sono rappresentativi di una preparazione di glicoproteina. B) cromatogramma del primo passaggio di purificazione per costruire CD2220-330, 5A da 600 mL di surnatante utilizzando una colonna di affinità Ni-NTA. La glicoproteina è stata eluita utilizzando un gradiente di imidazolo (linea grigia), dove 100% corrisponde al buffer di eluizione, che contiene imidazolo di 500 mM. Frazioni raccolte vengono rappresentate con linee verticali. C) cromatogramma di esclusione dimensionale per costruire CD2220-330, 5A utilizza un alto rendimento del gel colonna di filtrazione. Frazioni raccolte dal picco di eluizione sono rappresentate con linee verticali. Inserto: Macchiato di Coomassie SDS-PAGE gel mostrando la purezza della glicoproteina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig4.jpg"> Figura 4 . Cristallo con atomi pesanti ammollo. A) workstation campione per ammollo cristalli nativi con composti HA. Tutti i necessari strumenti sono etichettati. B) i passi seguiti ammollo cristalli di costruire CD2220-330, 5A con composti HA. Passaggio 1, aprire bene contenente cristalli e cristalli di trasferimento utilizzando un ciclo ad un calo di 0.2 µ l su un vetrino coprioggetto contenente soluzione HA diluito nella condizione di cristallizzazione in modo tale che la concentrazione finale di HA varia da 1-10 mM. Passaggio 2, la goccia nella piastra di cristallizzazione ed incubare cristalli con l'HA composto per diversi periodi di tempo. Passaggio 3, montare il cristallo imbevuto nel ciclo e retro in ammollo per 30 s in tre consecutivi 0,2 µ l gocce contenente la soluzione di liquore madre completata con 20% (v/v) glicerolo erogata su un vetrino coprioggetto. Passaggio 4, flash congelare il cristallo montato su un ciclo con azoto liquido e posizionarlo in un disco di gomma per la spedizione per la linea di luce di sincrotrone. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig5.jpg"> Figura 5 . Biolayer interferometria e isotermici misure di calorimetria titolazione. A) esperimento rappresentante BLI. Pannello superiore: esempio di piastra di supporto per un esperimento di cinetica, dove vengono etichettati i seguenti: 1 cinetica x buffer (B), sua6x-tagged glicoproteina caricamento (L), rappresentante Fab concentrazioni (500, 250, 125, 62.5 nM), PBS + 500 mM rigenerazione buffer (R) e neutralizzazione di cinetica: 1x tampone (B). Ciascun pozzetto contiene 200 µ l di soluzione. Numero di step per l'esperimento di cinetica è indicato nella parte superiore della piastra. Pannello centrale: Dati grezzi rappresentativi di BLI esperimento eseguito utilizzando biosensori Ni-NTA e la piastra descritto nel pannello superiore. Passo numeri corrispondono alla linea di base (1), sua glicoproteina6 x caricamento (2), della linea di base (3), associazione in diluizione seriale di Fab (4) e dissociazione (5). Procedura di rigenerazione non è rappresentati (passaggi 6 e 7). Pannello di fondo: Dati analizzati rappresentativi risultati grezzi associazione e dissociazione (linea blu) con il corrispondente 1:1 in forma (linea rossa). B) Pannello superiore: installazione piatto rappresentativo per un singolo ITC eseguito su uno strumento automatizzato di ITC con sette esperimenti in un 96 pozzetti tondo blocco inferiore. Ogni esperimento è composto da tre pozzi. Il primo pozzo (rosso) corrisponde al campione per la cella (400 µ l), il secondo pozzo (verde) corrisponde al campione per la siringa (120 µ l). Il terzo bene viene lasciato vuoto, e i campioni misti verranno restituiti a questo bene dopo il completamento di esperimento. Esperimenti di 1, 2 e 7 sono buffer nei controlli di buffer. Esperimenti di 3-5 rappresentano la triplice copia esperimenti con glicoproteina (P) nella cella e Fab o ligando (L) nella siringa. Esperimento 6 rappresenta un calore di ligando di controllo di diluizione e dovrebbe essere sottratto da esperimenti 3-5 durante l'analisi dei dati. Pannello di fondo: Rappresentanza crudo (in alto) e trasformati (in basso) ITC dati risultati Fab (epratuzumab) vincolanti per CD22 ECD prodotta nelle cellule HEK293F. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Vi presentiamo gli approcci per la caratterizzazione biofisica e strutturale delle glicoproteine con la piega di immunoglobulina biolayer interferometria, calorimetria isotermica di titolazione e cristallografia a raggi x.

Caratterizzazione delle glicoproteine con la piega di immunoglobulina mediante cristallografia a raggi x e tecniche biofisiche

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle glicoproteine. Fornisce informazioni sulla funzione della proteina, sul ruolo dei glicani legati all'N e sul meccanismo e l'azione degli antibiotici che prendono di mira la glicoproteina. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere applicata a qualsiasi glicoproteina di interesse.Facilitare la caratterizzazione strutturale e biofisica di un'ampia gamma di bersagli glicoproteici. A dimostrare questa procedura sarà Hong Cui, coordinatore di progetti di ricerca nel nostro laboratorio. Per iniziare, preparare e trasfettare le cellule come indicato nel protocollo di testo.Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 6, 371 volte g e quattro gradi Celsius per 20 minuti. Conservare il surnatante e quindi utilizzare un filtro da 0,22 micron per filtrarlo. Caricare il surnatante filtrato a quattro millilitri al minuto su una colonna Ni-NTA in un sistema cromatografico da banco.Dopo questo lavare la colonna con tre o quattro volumi di tampone di lavaggio. Diluire la glicoproteina purificata dalla colonna utilizzando un gradiente di tampone di eluizione, raccogliendo le frazioni. Estrarre le frazioni contenenti il picco eluso in un dispositivo di filtrazione centrifuga con un limite di peso molecolare nominale di 10 kilodalton.Quindi concentrare centrifugando a 4.000 volte G e quattro gradi Celsius per 15 minuti o fino a quando il campione raggiunge un volume di 500 microlitri. Iniettare la glicoproteina concentrata in un circuito di campionamento da 500 microlitri. Caricare la glicoproteina su una colonna di esclusione dimensionale pre-equilibrata ad alte prestazioni su un sistema FPLC a quattro gradi Celsius durante la raccolta delle frazioni.Successivamente, eseguire un gel SDS-PAGE per identificare quali frazioni eluse contengono la glicoproteina ed estrarre quelle che lo fanno. Utilizzando un dispositivo di filtrazione centrifuga con un limite di peso molecolare nominale di 10 kilodalton, concentrare ECD deglicosilato puro a 4.000 volte G e quattro gradi Celsius fino a ottenere la concentrazione desiderata. Dopo aver determinato la concentrazione proteica, centrifugare il campione a 12.000 volte G e quattro gradi Celsius per cinque minuti, per rimuovere polvere e altri contaminanti.Quindi, aggiungere 80 microlitri di soluzione di cristallizzazione da uno schermo di cristallizzazione commerciale a ciascun pozzetto del serbatoio in una piastra di cristallizzazione a goccia da 96 pozzetti. Utilizzare un robot di cristallizzazione per erogare gocce di proteine nei pozzetti della piastra di cristallizzazione. Utilizzando un volume di gocce totale di 200 nanolitri con un rapporto uno a uno tra proteina purificata e soluzione di cristallizzazione.Successivamente, sigillare la piastra con del nastro adesivo. Trasferire la piastra sigillata in un imager per l'ispezione alla luce visibile e ultravioletta. Identificare le condizioni che danno le teste iniziali dei cristalli di glicoproteina e ottimizzare ulteriormente questi cristalli come indicato nel protocollo di testo.Crioproteggere i cristalli immergendoli in una soluzione di liquore madre integrata con il 20% di glicerolo. Quindi monta i cristalli in CryoLoops. Utilizzando azoto liquido, congelare i cristalli montati prima della raccolta dei dati.Dopo aver prodotto cristalli ben diffranti in una piastra di cristallizzazione a 24 pozzetti, preparare una soluzione madre di legante da 50 millimolari e Tris da 20 millimolari a pH 9,0 con cloruro di sodio da 150 millimolari. Aggiungere varie concentrazioni di questa soluzione di legante alla goccia precedentemente preparata contenente i cristalli ECD. Sigillare la goccia per un tempo di incubazione compreso tra cinque minuti e cinque giorni.Utilizzando un microscopio ottico, traccia visivamente i cristalli per identificare eventuali cambiamenti nella morfologia. Dopo l'incubazione, montare i cristalli utilizzando CryoLoops e crioproteggerli in una soluzione di liquore madre integrata con glicerolo al 20%. Per iniziare l'interferometria a biostrati, preparare 50 millimetri di 1X Kinetics Buffer da 10X Kinetics Buffer come indicato nel protocollo di testo.Aggiungere 200 microlitri di questo tampone a una piastra di pre-bagnatura. Trasferire sei biosensori Ni-NTA sulla piastra e lasciarli idratare nel tampone per 10 minuti. Successivamente, diluire l'ECD marcato con His in un millilitro di tampone cinetico 1X a una concentrazione finale di 25 nanogrammi per microlitro.E preparare diluizioni seriali del FAB purificato. Ora acquare i reagenti in una micropiastra a 96 pozzetti, come si vede qui. Dove B rappresenta il tampone cinetico 1X, L rappresenta il carico di glicoproteina con tag His, le voci numeriche rappresentano le concentrazioni di FAB diluite e R rappresenta il tampone di rigenerazione.Trasferire i biosensori idrati in pozzetti contenenti 1X Kinetics Buffer per 60 secondi per la loro linea di base. Quindi, caricare la glicoproteina a una concentrazione di 25 nanogrammi per microlitro per 240 secondi a 1.000 giri/min. Riposizionare i biosensori nei pozzetti contenenti il tampone cinetico 1X per 60 secondi per una seconda linea di base.Trasferire i sensori nei pozzetti contenenti le diluizioni seriali di FAB per 180 secondi. Dopo questa fase di associazione, trasferire nuovamente i biosensori nel tampone cinetico 1X per una fase di dissociazione di 180 secondi. Quindi, apri il software di analisi.Nella prima scheda, importa e quindi seleziona i dati. Nella scheda due, passaggio uno selezione dati, scegli selezione sensore. Evidenziare i pozzetti di riferimento, quindi fare clic con il pulsante destro del mouse per impostare il pozzetto di riferimento.Nella seconda fase, la sottrazione, selezionare i pozzetti di riferimento. Successivamente, nel passaggio tre allinea l'asse Y, selezionare la linea di base e impostare un intervallo di tempo compreso tra 0,1 secondi e 59,8 secondi. Nel passaggio quattro, selezionare la correzione tra i passaggi e allineare alla dissociazione.Quindi, nel passaggio cinque, elaborare il filtro Savitzky-Golay e fare clic su Elabora dati. Il cancello per la scheda tre. Nel passaggio due analizza con un modello uno-a-uno, selezionare Associazione e dissociazione, selezionare Adattamento globale e Raggruppa per colore.Fare clic con il pulsante destro del mouse sulle curve, fare clic su imposta colore e impostare tutte le curve sui colori desiderati. Successivamente, selezionare Adatta curve. Se i dati sono corretti, esportare il risultato facendo clic su Salva report.Ripeti l'esperimento per tutte le condizioni desiderate. In questo studio diversi costrutti del dominio extracellulare CD22 sono stati clonati con successo nel vettore di espressione pHL-sec. Questi costrutti sono poi sovraespressi nelle linee cellulari HEK293-F e HEK293-S dei mammiferi.Mentre le colture contenenti circa un milione e un milione e mezzo di cellule per millilitro, esprimevano livelli molto simili di glicoproteine. Le colture di solo mezzo milione di cellule per millilitro esprimevano notevolmente meno. Successivamente, le colture vengono raccolte e la glicoproteina ECD viene isolata mediante cromatografia di affinità e di esclusione dimensionale per purificare tutti i costrutti fino all'omogeneità dimensionale.Produzione di un campione altamente puro per la cristallizzazione e gli studi biofisici. Seguendo queste procedure, è possibile eseguire altri metodi, come la microscopia elettronica a particelle singolari, al fine di rispondere a ulteriori domande sulla struttura tridimensionalista del dominio extracellulare a lunghezza intera o dei complessi proteici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come esprimere, purificare e caratterizzare strutturalmente e biofisicamente le glicoproteine, i loro ligandi e gli anticorpi mirati.

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