Caratterizzazione delle glicoproteine con la piega di immunoglobulina mediante cristallografia a raggi x e tecniche biofisiche

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle glicoproteine. Fornisce informazioni sulla funzione della proteina, sul ruolo dei glicani legati all'N e sul meccanismo e l'azione degli antibiotici che prendono di mira la glicoproteina. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere applicata a qualsiasi glicoproteina di interesse.

Facilitare la caratterizzazione strutturale e biofisica di un'ampia gamma di bersagli glicoproteici. A dimostrare questa procedura sarà Hong Cui, coordinatore di progetti di ricerca nel nostro laboratorio. Per iniziare, preparare e trasfettare le cellule come indicato nel protocollo di testo.

Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 6, 371 volte g e quattro gradi Celsius per 20 minuti. Conservare il surnatante e quindi utilizzare un filtro da 0,22 micron per filtrarlo. Caricare il surnatante filtrato a quattro millilitri al minuto su una colonna Ni-NTA in un sistema cromatografico da banco.

Dopo questo lavare la colonna con tre o quattro volumi di tampone di lavaggio. Diluire la glicoproteina purificata dalla colonna utilizzando un gradiente di tampone di eluizione, raccogliendo le frazioni. Estrarre le frazioni contenenti il picco eluso in un dispositivo di filtrazione centrifuga con un limite di peso molecolare nominale di 10 kilodalton.

Quindi concentrare centrifugando a 4.000 volte G e quattro gradi Celsius per 15 minuti o fino a quando il campione raggiunge un volume di 500 microlitri. Iniettare la glicoproteina concentrata in un circuito di campionamento da 500 microlitri. Caricare la glicoproteina su una colonna di esclusione dimensionale pre-equilibrata ad alte prestazioni su un sistema FPLC a quattro gradi Celsius durante la raccolta delle frazioni.

Successivamente, eseguire un gel SDS-PAGE per identificare quali frazioni eluse contengono la glicoproteina ed estrarre quelle che lo fanno. Utilizzando un dispositivo di filtrazione centrifuga con un limite di peso molecolare nominale di 10 kilodalton, concentrare ECD deglicosilato puro a 4.000 volte G e quattro gradi Celsius fino a ottenere la concentrazione desiderata. Dopo aver determinato la concentrazione proteica, centrifugare il campione a 12.000 volte G e quattro gradi Celsius per cinque minuti, per rimuovere polvere e altri contaminanti.

Quindi, aggiungere 80 microlitri di soluzione di cristallizzazione da uno schermo di cristallizzazione commerciale a ciascun pozzetto del serbatoio in una piastra di cristallizzazione a goccia da 96 pozzetti. Utilizzare un robot di cristallizzazione per erogare gocce di proteine nei pozzetti della piastra di cristallizzazione. Utilizzando un volume di gocce totale di 200 nanolitri con un rapporto uno a uno tra proteina purificata e soluzione di cristallizzazione.

Successivamente, sigillare la piastra con del nastro adesivo. Trasferire la piastra sigillata in un imager per l'ispezione alla luce visibile e ultravioletta. Identificare le condizioni che danno le teste iniziali dei cristalli di glicoproteina e ottimizzare ulteriormente questi cristalli come indicato nel protocollo di testo.

Crioproteggere i cristalli immergendoli in una soluzione di liquore madre integrata con il 20% di glicerolo. Quindi monta i cristalli in CryoLoops. Utilizzando azoto liquido, congelare i cristalli montati prima della raccolta dei dati.

Dopo aver prodotto cristalli ben diffranti in una piastra di cristallizzazione a 24 pozzetti, preparare una soluzione madre di legante da 50 millimolari e Tris da 20 millimolari a pH 9,0 con cloruro di sodio da 150 millimolari. Aggiungere varie concentrazioni di questa soluzione di legante alla goccia precedentemente preparata contenente i cristalli ECD. Sigillare la goccia per un tempo di incubazione compreso tra cinque minuti e cinque giorni.

Utilizzando un microscopio ottico, traccia visivamente i cristalli per identificare eventuali cambiamenti nella morfologia. Dopo l'incubazione, montare i cristalli utilizzando CryoLoops e crioproteggerli in una soluzione di liquore madre integrata con glicerolo al 20%. Per iniziare l'interferometria a biostrati, preparare 50 millimetri di 1X Kinetics Buffer da 10X Kinetics Buffer come indicato nel protocollo di testo.

Aggiungere 200 microlitri di questo tampone a una piastra di pre-bagnatura. Trasferire sei biosensori Ni-NTA sulla piastra e lasciarli idratare nel tampone per 10 minuti. Successivamente, diluire l'ECD marcato con His in un millilitro di tampone cinetico 1X a una concentrazione finale di 25 nanogrammi per microlitro.

E preparare diluizioni seriali del FAB purificato. Ora acquare i reagenti in una micropiastra a 96 pozzetti, come si vede qui. Dove B rappresenta il tampone cinetico 1X, L rappresenta il carico di glicoproteina con tag His, le voci numeriche rappresentano le concentrazioni di FAB diluite e R rappresenta il tampone di rigenerazione.

Trasferire i biosensori idrati in pozzetti contenenti 1X Kinetics Buffer per 60 secondi per la loro linea di base. Quindi, caricare la glicoproteina a una concentrazione di 25 nanogrammi per microlitro per 240 secondi a 1.000 giri/min. Riposizionare i biosensori nei pozzetti contenenti il tampone cinetico 1X per 60 secondi per una seconda linea di base.

Trasferire i sensori nei pozzetti contenenti le diluizioni seriali di FAB per 180 secondi. Dopo questa fase di associazione, trasferire nuovamente i biosensori nel tampone cinetico 1X per una fase di dissociazione di 180 secondi. Quindi, apri il software di analisi.

Nella prima scheda, importa e quindi seleziona i dati. Nella scheda due, passaggio uno selezione dati, scegli selezione sensore. Evidenziare i pozzetti di riferimento, quindi fare clic con il pulsante destro del mouse per impostare il pozzetto di riferimento.

Nella seconda fase, la sottrazione, selezionare i pozzetti di riferimento. Successivamente, nel passaggio tre allinea l'asse Y, selezionare la linea di base e impostare un intervallo di tempo compreso tra 0,1 secondi e 59,8 secondi. Nel passaggio quattro, selezionare la correzione tra i passaggi e allineare alla dissociazione.

Quindi, nel passaggio cinque, elaborare il filtro Savitzky-Golay e fare clic su Elabora dati. Il cancello per la scheda tre. Nel passaggio due analizza con un modello uno-a-uno, selezionare Associazione e dissociazione, selezionare Adattamento globale e Raggruppa per colore.

Fare clic con il pulsante destro del mouse sulle curve, fare clic su imposta colore e impostare tutte le curve sui colori desiderati. Successivamente, selezionare Adatta curve. Se i dati sono corretti, esportare il risultato facendo clic su Salva report.

Ripeti l'esperimento per tutte le condizioni desiderate. In questo studio diversi costrutti del dominio extracellulare CD22 sono stati clonati con successo nel vettore di espressione pHL-sec. Questi costrutti sono poi sovraespressi nelle linee cellulari HEK293-F e HEK293-S dei mammiferi.

Mentre le colture contenenti circa un milione e un milione e mezzo di cellule per millilitro, esprimevano livelli molto simili di glicoproteine. Le colture di solo mezzo milione di cellule per millilitro esprimevano notevolmente meno. Successivamente, le colture vengono raccolte e la glicoproteina ECD viene isolata mediante cromatografia di affinità e di esclusione dimensionale per purificare tutti i costrutti fino all'omogeneità dimensionale.

Produzione di un campione altamente puro per la cristallizzazione e gli studi biofisici. Seguendo queste procedure, è possibile eseguire altri metodi, come la microscopia elettronica a particelle singolari, al fine di rispondere a ulteriori domande sulla struttura tridimensionalista del dominio extracellulare a lunghezza intera o dei complessi proteici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come esprimere, purificare e caratterizzare strutturalmente e biofisicamente le glicoproteine, i loro ligandi e gli anticorpi mirati.