Name: Rilevamento di eterodimerizzazione di isoforme della proteina usando unanalisi in Situ vicinanza legatura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Scopri l'uso dell'assay di ligazione di prossimità in situ per visualizzare l'eterodimerizzazione di MST1/MST2 in cellule fissate. Questo metodo sensibile rileva interazioni proteiche senza espressione transgenica.

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Ringraziamo l'intero laboratorio Chernoff per contribuire alla ottimizzazione e convalida del presente protocollo, in particolare Maria Radu e Galina Semenova. Ringraziamo anche Andrey Efimov della struttura cellulare Imaging presso il Fox Chase Cancer Center. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione dal NIH (R01 CA148805) a JC.

1. preparazione delle soluzioni
<ol><li>Preparare soluzione fissante: paraformaldeide al 4% (PFA) in PBS 1X. Per 10ml, prendere 2,5 mL di 16% PFA e aggiungere 7,5 mL di PBS 1X. Pericoli: PFA è cancerogeno a basse dosi. Fumi e contatto con la pelle sono pericolosi. Conservare a-20 ° C.</li>
	<li>Preparare la soluzione di permeabilizzazione: 0,1% Triton X-100 in PBS 1X. Per 100 mL di soluzione, aggiungere 100 µ l di Triton X-100 in 100 mL di 1X PBS. Conservare a temperatura ambiente (TA).</li>
	<li>Preparare il tampone di lavaggio: 1 x TBST. Per 1 L, prendere 100 mL di 10 x TBS, 890 mL di dH2O e 10 mL di Tween 20 (10%).</li>
	<li>Preparare soluzione bloccante come fornito dal kit. In alternativa, utilizzare soluzione PBS 1x contenente 2% BSA.</li>
	<li>Preparare il diluente di anticorpo come fornito dal kit. In alternativa, utilizzare soluzione PBS 1x contenente BSA 1%.</li>
</ol>2. placcatura delle cellule
Nota: In questo studio, abbiamo utilizzato le cellule di Schwann umane immortalizzate (integrazione socio-sanitaria) e cellule umane embrionali del rene 293 (HEK 293); Tuttavia, questo metodo può essere utilizzato per molti tipi di cellule aderenti.
<ol><li>Cultura HEK 293 in DMEM supplementato con 10% FBS, 0,2% glucosio, 2 mM L-Glutammina, 100 U/mL di penicillina G e 100 µ g/mL di streptomicina sulle piastre di coltura del tessuto-trattati a 37 ° C 5% CO2. Mantenere l'integrazione socio-sanitaria in 10% FBS/DMEM completate con Pen/Strep e 2 µM forskolin. Celle per micoplasma ordinariamente di prova. Nessuna autenticazione di linea cellulare è stata eseguita.</li>
	<li>Rivestire una diapositiva 16 pozzetti camera con 50 µ l di 10 µ g/mL naturale laminina o 0,01% poli-L-lisina soluzione mouse e incubare per 30 min a 37 ° C in 5% CO2. Dividere le celle utilizzando 0,04% tripsina-EDTA.</li>
	<li>Piastra di integrazione socio-sanitaria e HEK-293 in 100 µ l di terreno alla confluenza del 80% (15.000-25.000 cellule/pozzetto).</li>
	<li>Incubare le cellule per 12-24 ore a 37 ° C in un umidificata, 5% CO2 incubator.</li>
</ol>3. fissazione e permeabilizzazione
<ol><li>Rimuovere il supporto dai pozzetti e lavare con 100 µ l di 1X PBS. Aspirare con una micropipetta per ridurre al minimo il rischio di rimozione del campione.</li>
	<li>Difficoltà cellule aggiungendo 50 µ l del 4% PFA ogni pozzetto ed incubare per 10 min a RT, senza agitazione. Le cellule sono sensibili al distacco, in modo da evitare le soluzioni direttamente sulle celle di pipettaggio.</li>
	<li>Lavare le cellule con 0.05% TBST tre volte per 5 minuti ciascuno. Aspirare con una micropipetta per ridurre al minimo il rischio di rimozione del campione.</li>
	<li>Trattare le cellule con soluzione di permeabilizzazione (0,1% Triton x-100 in 1X PBS) per 10 min senza agitazione a TA.</li>
	<li>Lavare le cellule con TBST tre volte per 5 minuti ciascuno con agitazione.</li>
</ol>4. blocco
<ol><li>Picchiettare il TBST (molto delicatamente con una micropipetta). Visualizzare la diapositiva in un microscopio per vedere se le cellule rimangono attaccate.</li>
	<li>Aggiungere una goccia (50-60 µ l) di soluzione di blocco: 1x a ciascun campione.</li>
	<li>Pre-riscaldare una camera umidostatica (Tipbox vuoto con acqua) a 37 ° C ed incubare i vetrini in esso per 1h a 37 ° C.</li>
</ol>5. primari anticorpi
<ol><li>Diluire gli anticorpi primari (1: 100) nel diluente dell'anticorpo (Vedi Tabella materiali). Preparare 40 µ l di soluzione di anticorpo per pozzetto.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione bloccante dalle diapositive toccando il liquido. Non permettono che le cellule a secco.</li>
	<li>Vortice e aggiungere 40 µ l delle soluzioni dell'anticorpo in ciascun pozzetto.</li>
	<li>Incubare 1h a 37 ° C in una camera umida preriscaldata.</li>
</ol>6. vicinanza legatura Assay sonde
Nota: Il PLA sonde vengono forniti come parte di un kit (Vedi Tabella materiali). La scelta delle sonde dipenderà la specie di anticorpi primari utilizzati per rilevare le proteine di interesse.
<ol><li>Le due sonde PLA (anti-topo MINUS e PLUS anti-coniglio) di diluire 1:5 in diluente del anticorpo. Per ogni campione, preparare 40 µ l di sonda PLA. Incubare la miscela per 20 minuti a TA.</li>
	<li>Picchiettare la soluzione di anticorpo primario dalle diapositive. Lavare i vetrini due volte per 5 minuti ciascuno con Buffer di lavare a TA.</li>
	<li>Delicatamente toccare del tampone di lavaggio dalle diapositive ed aggiungere la soluzione di sonda PLA diluente a pozzetti (40 µ l/pozzetto).</li>
	<li>Incubare i vetrini in una camera umida preriscaldata per 1h a 37 ° C.</li>
</ol>7. legatura
Nota: L' in situ Detection reagenti Red, ligasi e soluzione di legatura sono forniti come parte di un kit (Vedi Tabella materiali).
<ol><li>Utilizzare la in situ rilevamento reagenti rosso.</li>
	<li>Immediatamente prima dell'uso, vortice e diluire i volumi richiesti del 5 x Stock in legatura acqua 1:5 in ad alta purezza. Nota: Non conservare i reagenti diluiti.</li>
	<li>Picchiettare la soluzione della sonda PLA dalle diapositive. Lavare i vetrini in 1x tampone di lavaggio due volte per 5 minuti ciascuno, a TA.</li>
	<li>Immediatamente prima dell'aggiunta ai campioni, vortice e aggiungere alla soluzione di legatura ligasi alle 01:40 diluizione e vortex nuovamente.</li>
	<li>Toccare il tampone di lavaggio dalle diapositive e aggiungere la soluzione di legatura/ligasi in ciascun pozzetto (40 µ l/pozzetto).</li>
	<li>Incubare i vetrini in una camera di umidità pre-riscaldato per 30 min a 37 ° C.</li>
</ol>8. amplificazione
Nota: Lo stock di amplificazione viene fornito come parte di un kit (Vedi Tabella materiali). I reagenti sono sensibili alla luce; così evitare di esporre le diapositive alla luce.
<ol><li>Vortice e diluire i volumi richiesti del 5 x magazzino amplificazione 1:5 in acqua ad elevata purezza e mescolare.</li>
	<li>Picchiettare la soluzione di legatura/ligasi dalle diapositive. Lavare i vetrini in 1x tampone di lavaggio due volte per 2 minuti ciascuno, a TA.</li>
	<li>Vortice e aggiungere nuovamente la polimerasi alla soluzione di amplificazione a una diluizione di 1: 80 e vortice.</li>
	<li>Picchiettare il tampone di lavaggio dalle diapositive e aggiungere la soluzione di amplificazione/polimerasi ad ogni pozzetto (40 µ l/pozzetto). Incubare i vetrini in una camera umida preriscaldata per 100 min a 37 ° C.</li>
</ol>9. preparazione per l'Imaging
Nota: Si tratta di luce reagenti sensibili. Mantenere le diapositive al riparo dalla luce.
<ol><li>Tocca Disattiva la soluzione di amplificazione-polimerasi dalle diapositive e lavare due volte per 10 min ogni in 1x tampone di lavaggio a TA.</li>
	<li>Rimuovere completamente la chambers e silicone intorno ai pozzi dalla diapositiva. Raschiare i bit rimanenti del silicone con un rasoio. Disegnare una griglia sulla diapositiva separando ogni bene.</li>
	<li>~ 40 µ l di mezzo di montaggio con DAPI. Fare attenzione a non intrappolare bolle d'aria sotto il vetrino coprioggetto. I bordi dei vetrini coprioggetto possono essere sigillati con smalto.</li>
	<li>Attendere almeno 20 minuti prima di eseguire analisi di immagine utilizzando un microscopio confocale. Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.</li>
	<li>Dopo formazione immagine, conservare i vetrini a-20 ° C al buio.</li>
</ol>

<ol><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nore1B%2FMst1+complex+restrains+antigen+receptor-induced+proliferation+of+na%C3%AFve+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).</li>
<li>Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOBKL1A%2FMOBKL1B+phosphorylation+by+MST1+and+MST2+inhibits+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation.</a> Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).</li>
<li>Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ste20+group+kinases+as+regulators+of+MAP+kinase+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades.</a> Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).</li>
<li>Rawat, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H-ras+Inhibits+the+Hippo+Pathway+by+Promoting+Mst1%2FMst2Heterodimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization.</a> Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).</li>
<li>Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ste20-like+protein+kinase%2C+Mst1%2C+dimerizes+and+contains+an+inhibitory+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).</li>
<li>Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Approaches+Toward+Quantitative+Mapping+of+the+Interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome.</a> Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).</li>
<li>Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+assays+for+sensitive+quantification+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">Proximity assays for sensitive quantification of proteins.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).</li>
<li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li>
<li>Leuchowius, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+visualization+of+multiple+protein+complexes+in+individual+cells+in+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Abbiamo trovato utile utilizzare vetrini camera per questo esperimento, come è molto conveniente eseguire l'esperimento con diverse linee di cellule (14-16) e non c'è nessuna necessità di cambiare il campione ogni volta durante l'analisi in microscopia. Alcune complicazioni possono sorgere, ad esempio un aumentato rischio di contaminazione incrociata con gli anticorpi. Pertanto, consigliamo di lavare ogni pozzetto singolarmente anziché utilizzare una vaschetta di Coplin, nonostante l'aumento della durata dell'esperimento...

Rottura di MST1/Hippo segnalazione è stata collegata a disturbi dello sviluppo e carcinogenesi1. Nei mammiferi, attivano le chinasi MST1 e MST2 (fosforilare) MOB1 e LATS1/2, il secondo dei quali poi fosforila ed inattiva co-l'attivatore trascrizionale Yes-associated protein (YAP)2. Nella sua forma attiva (unphosphorylated), YAP ha attività oncogena, migliorando la trascrizione dei geni di proliferazione delle cellule; al contrario, quando YAP è inattivato dalla via del Hippo, è soppressa la proliferazione cellulare e apoptosi promosso3. Nei tessuti, MST1 e MST2 esiste principalmente come attivo omodimeri, ma stimoli oncogeni possono aumentare i livelli di MST1/MST2 eterodimeri, e tali eterodimeri sono inattivo4. Tuttavia, com'è regolata la MST1/MST2 eterodimerizzazione rimane capita male. Omo - ed eterodimeri sono mediati tramite interazioni tra regioni arrotolato-arrotola C-terminale di MST1 e MST2 conosciuta come SARAH domini5. Utilizzando un in situ PLA ha dimostrato in questo articolo, ci mostrano la presenza di MST1/MST2 eterodimeri in cellule di Schwann umane (HSC) e rene embrionale umano cellule (HEK-293). PLA ha un vantaggio rispetto ad altri metodi di rilevazione di interazione proteina/proteina perché permette la rilevazione delle interazioni proteina-proteina endogena, che possono essere individuati e quantificati senza la necessità di espressione del transgene o l'uso di epitopo 6.
Vie di trasduzione del segnale sono in gran parte controllate dall'associazione condizionale delle proteine di componente. Per esempio, stimolazione della maggior parte dei recettori tirosina chinasi conduce alla loro omo - o etero-dimerizzazione e la successiva associazione con altre proteine di segnalazione intracellulare, che a loro volta formare ulteriori complessi. Lo scopo del metodo PLA è visualizzare la vicinanza tra le proteine nelle cellule, purché le proteine sono meno di 30-40 nm apart. Prossimità di proteina è rilevata solitamente incubando le cellule con gli anticorpi primari appropriati generati in specie diverse (ad es., coniglio e il mouse) contro ogni proteina d'interazione, quindi aggiungendo specie-specifici anticorpi secondari, sonde di DNA pre-accoppiato a breve. Se le sonde del DNA sono nelle immediate vicinanze, un oligonucleotide specifico collegamento DNA possibile associare contemporaneamente sia di queste sonde, formando una piattaforma per l'amplificazione in situ PCR o dal meccanismo del cerchio di rotolamento. Fluorescente tag aggiunti per la reazione di amplificazione permettono la visualizzazione delle proteine interagenti, che appaiono come puntini fluorescenti che possono essere facilmente quantificate e localizzate alle regioni particolari nella cella7,8, 9 , 10.

<table><tbody><tr><td>Vetrini da camera</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>178599</td><td>16 pozzetti, vetrino in vetro</td></tr><tr><td>Sonda PLA Anti-Mouse Minus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92004</td><td>Contiene 1x soluzione bloccante, 1x diluente anticorpale</td></tr><tr><td>Sonda PLA Anti-Rabbit PLUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92002</td><td>Contiene 1x soluzione bloccante, 1x diluente anticorpale</td></tr><tr><td>Tamponi di lavaggio, flurescenza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td>Contiene il tampone di lavaggio A e il mezzo di montaggio del tampone di lavaggio B</td></tr> con <tr><td>reagenti di rilevamento</td><td></td> DAPI <td>Sigma-Aldrich DUO82040</td><td>Rosso Sigma-Aldrich DUO92008 contiene 5x legatura, 1x ligasi, 5x rosso di amlificazione, 1x polimerasi</td></tr><tr><td>p44/42 MAPK (Erk1/2) Segnalazione</td><td>cellulare</td><td>9102s</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Fosfo-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187)Cellula <td></td></tr><tr><td></td><td> Segnalazione</td><td>5726s</td><td>pERK anticorpo</td></tr><tr><td>MST2 anticorpo</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>3952s</td><td></td></tr><tr><td>Krs-2 (RJ-5)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-100449</td><td>MST1 anticorpo</td></tr><tr><td>16% Paraformaldeide</td><td>Microscopia elettronica scienze</td><td>15710</td><td>Diluire al 4% PFA in PBS per soluzione di fissaggio</td></tr><tr><td>Triton x100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP 151-500</td><td>Per preparare Triton x-100 allo 0,1% in 1xPBS per la soluzione di permeabilizzazione</td></tr><tr><td>Microscopia confocale</td><td>Leica TCS SP8, 63x</td><td></td><td>Analisi delle immagini con il software ImageJ</td></tr></tbody></table>

rilevamento di eterodimerizzazione di isoforme della proteina usando un'analisi in situ vicinanza legatura

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Interazioni proteina-proteina regolamentati sono un principio guida per molti eventi di segnale, e l'individuazione di tali eventi è un elemento importante nella comprensione di come tali percorsi sono organizzati e come funzionano. Ci sono molti metodi per rilevare le interazioni proteina-proteina in cellule, ma relativamente pochi può essere utilizzati per rilevare le interazioni tra proteine endogene. Uno di questi metodi, il dosaggio di legatura di prossimità (PLA), ha diversi vantaggi per raccomandare l'uso. Rispetto ad altri comuni metodi di analisi di interazione proteina-proteina, PLA ha relativamente alta sensibilità e specificità, possa essere eseguita con la manipolazione di cellule minimal e, nel protocollo descritto nel presente documento, richiede solo due target-specifici anticorpi derivati da specie diverse (ad es., da topo e coniglio) e un reagente specializzato: un set di anticorpi secondari che sono oligonucleotidi covalentemente legati a specifiche che, quando ha portato in prossimità di un altro, creare un amplificabile piattaforma per in situ PCR o rotolamento dell'amplificazione del cerchio. In questa presentazione, mostreremo come applicare la tecnica PLA per visualizzare le modifiche in prossimità di MST1 e MST2 nelle celle fisse. La tecnica descritta in questo manoscritto è particolarmente applicabile per l'analisi di studi di segnalazione delle cellule.

Abbiamo usato l'analisi PLA per testare l'interazione tra MST1 e MST2 in HEK-293 e integrazione socio-sanitaria. Le cellule erano fissi, permeabilizzate e macchiate con vari anticorpi, seguiti dall'amplificazione in situ secondo il protocollo PLA (Figura 1). Per documentare il livello di MST1/MST2 eterodimerizzazione, le cellule sono state macchiate con gli anticorpi MST1 e MST2 (Figura 1A, 1C e 1 G). Co...

Qui, vi mostriamo come utilizzare un dosaggio di legatura di prossimità (PLA) per visualizzare MST1/MST2 eterodimerizzazione in celle fisse con alta sensibilità.

Rilevamento di eterodimerizzazione di isoforme della proteina usando un'analisi in Situ vicinanza legatura

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Il Proximity Ligation Assay o PLA in situ è una tecnologia in grado di rilevare interazioni tra proteine, tessuto apposto e cellule. Le associazioni tra proteine possono essere identificate e quantificate senza la necessità di espressione transgenica o tecnologie aggiuntive. L'unico requisito è la disponibilità di anticorpi specifici ad alta efficienza che possono essere modificati con oligonucleotidi del DNA.Nei tessuti MST1 e MST2 esistono principalmente come omodimeri attivi, ma gli stimoli oncogenici possono aumentare il livello di eterodimeri MST1 MST2 e tali eterodimeri sono inattivi. Dopo l'incubazione con anticorpi primer specifici contro le proteine di interesse, vengono aggiunti allo slot speciali anticorpi secondari specifici, ognuno collegato a un filamento di DNA unico, corto e gratuito ad esso collegato, per legarsi agli anticorpi primari. Se le proteine in questione sono eterodimerizzate, sia gli anticorpi primari che gli anticorpi secondari ad essi legati saranno nelle immediate vicinanze.In questo stato, i filamenti di DNA attaccati sul secondo anticorpo possono interagire attraverso una successiva aggiunta di altri due oligonucleotidi del DNA che formano cerchi. D

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Qui si mostrano come utilizzare Ligation analisi di prossimità (PLA), con una combinazione di anticorpi per visualizzare proteina morfogenetica dell'osso (BMP) di segnalazione nelle cellule fisso. Questa tecnica ci ha permesso di seguire l'accumulo nucleare di BMP endogene attivate effettore complessi e quantificare i loro livelli nel corso del tempo sotto BMP4 stimolazione.

Rilevazione di segnalazione Effettistica-Complessi valle di BMP4 utilizzo In situ PLA, una legatura di prossimità Assay

Questo video descrive il saggio di legatura di prossimità per studiare le interazioni proteina-proteina in situ nelle cellule di nematodi. La stretta vicinanza delle proteine di interesse genera il modello circolare di DNA con l'aiuto di una sonda PLA attaccata a un anticorpo secondario. La sonda viene ulteriormente amplificata utilizzando la soluzione di amplificazione, che produce un lungo DNA a filamento singolo seguito dall'ibridazione della sonda del rivelatore, consentendo la...

Saggio di legatura di prossimità per studiare le interazioni proteina-proteina in situ

In questo video, dimostriamo il test del lievito modificato one-hybrid, che rileva più proteine che interagiscono con il DNA bersaglio. Le cellule di lievito trasformate contengono la sequenza di DNA bersaglio a monte del gene reporter. Inoltre, esprimono proteine del fattore di trascrizione. Quando le proteine formano complessi e si legano al DNA bersaglio, il gene reporter viene espresso e può essere rilevato enzimaticamente.

Saggio ibrido lievito-uno modificato per rilevare le interazioni eteromeriche tra complesso proteico e DNA

Questo video dimostra la visualizzazione delle interazioni proteina-proteina alla giunzione neuromuscolare di Drosophila (NMJ) utilizzando il Proximity Ligation Assay (PLA). Dopo aver isolato le pareti corporee, le proteine interagenti vengono sondate con anticorpi primari e anticorpi secondari coniugati con PLA. La vicinanza delle proteine interagenti facilita la legatura delle sonde con oligonucleotidi connettori, formando DNA circolare, che viene poi amplificato dall'amplificazione del...

Rilevamento delle interazioni proteina-proteina nelle larve di Drosophila utilizzando un saggio di legatura di prossimità

Questo protocollo dimostra come Proximity legatura test può essere utilizzato per rilevare in situ interazioni proteina-proteina in Drosophila larvale neuromuscolare giunzione. Con questa tecnica, dischi grandi e Hu-li Shao tai sono presenti per formare un complesso in corrispondenza della zona postsinaptico, un'associazione precedentemente identificato mediante co-immunoprecipitazione.

Rilevamento di In Situ Complessi proteina-proteina del Drosophila Larvale neuromuscolare Junction Utilizzando prossimità legatura Assay

Qui, descriviamo una procedura per visualizzare e quantificare con alta sensibilità le interazioni endogeni tra il reticolo endoplasmatico e mitocondri nelle cellule fissate. Il protocollo è dotato di un ottimizzato in test legatura situ prossimità targeting inositolo 1,4,5-trifosfato recettore / glucosio-regolata proteina 75 / D complesso canale anionico / cyclophilin voltaggio-dipendente all'interfaccia membrana mitocondriale associata.

Studio del reticolo endoplasmatico e mitocondri interazioni<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Assay legatura in cellule fissate

Le interazioni proteina-proteina possono verificarsi sia nel nucleo che nel citoplasma di una cellula. Per studiare queste interazioni, vengono applicati la tradizionale co-immunoprecipitazione e il moderno saggio di legatura di prossimità. In questo studio, confrontiamo questi due metodi per visualizzare la distribuzione delle interazioni NF90-RBM3 nel nucleo e nel citoplasma.

Visualizzazione di interazione proteina-proteina in nucleare e citoplasmatica frazioni da Co-immunoprecipitazione e<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Assay legatura

Qui viene dimostrato come può essere utilizzato il test di Ligation Proximity (PLA) in situ per rilevare e visualizzare le interazioni proteiche-proteiche dirette tra ATM e p53 nelle colture di cellule di sospensione esposte a stress genotossico.

Rilevamento e visualizzazione di complessi proteici indotti da danni a DNA nelle cellule di cellule di sospensione utilizzando il test di legatura di prossimità

Questo protocollo descrive un approccio privo di calibrazione per la quantificazione della proteina omo-oligomerizzazione in vitro basati sulla spettroscopia di fluorescenza fluttuazione mediante microscopia a scansione di luce commerciale. Le impostazioni di acquisizione corretta e i metodi di analisi sono mostrati.

Privo di calibrazione In Vitro quantificazione delle proteine omo-oligomerizzazione utilizzando Strumentazione commerciale e libero, Open Source Software di analisi di luminosità

Le proteine Cognate J-domain cooperano con l'accompagnatore Hsp70 per assistere in una miriade di processi biologici che vanno dal ripiegamento proteico alla degradazione. Qui, descriviamo un analisi di legatura di prossimità in situ, che consente il monitoraggio di questi macchinari chaperone tradotti transitoriamente in cellule batteriche, lieviti e umane.

Monitoraggio in Situ di gruppi di chaperone molecolari formati in farmaci, lieviti e cellule umane

Questo protocollo dimostra l'uso del saggio di legatura di prossimità per sondare le interazioni proteina-proteina in situ nella germinale C. elegans.

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly nella C. elegans Germline utilizzando Proximity Ligation Assay

Scopri l'uso dell'assay di ligazione di prossimità in situ per visualizzare l'eterodimerizzazione di MST1/MST2 in cellule fissate. Questo metodo sensibile rileva interazioni proteiche senza espressione transgenica.

Rilevamento di eterodimerizzazione di isoforme della proteina usando un'analisi in Situ vicinanza legatura

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