Visualizzazione del Microbiota in Tick budella di intero-monta In Situ di ibridazione

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sull'entomologia delle zecche, come valutare la presenza di batteri vitali nella zecca spazialmente e temporalmente. I principali vantaggi di questa tecnica sono che non richiede il sezionamento delle zecche o attrezzature costose e che consente la visualizzazione spaziale e temporale dei trascritti genici. In generale, le persone che non conoscono questa tecnica avranno difficoltà perché coinvolge più passaggi e reagenti.

Tuttavia, questa tecnica non è laboriosa. Sebbene il completamento possa richiedere circa tre giorni, il tempo a disposizione è di poche ore al giorno. In preparazione, nutrire le zecche raccolte per 48-72 ore prima della raccolta intestinale.

Per sezionare l'intestino dalla zecca, aggiungere da 20 a 30 microlitri di soluzione di MEMFA a un vetrino pulito. Quindi posiziona la zecca nel MEMFA e regola la messa a fuoco sulla testa della zecca. Ora, usando un paio di lame di rasoio sterili in acciaio ad alto tenore di carbonio, taglia la regione della testa allo scutum lasciando intatto il corpo della zecca.

Quindi, premere delicatamente il corpo per spingere i diverticoli intestinali e le ghiandole salivari fuori dalla cuticola del corpo. Quindi, senza danneggiare le budella, separarle accuratamente dalle ghiandole salivari e raccogliere con cura i tagli su una lama di rasoio. Raccogli tutte le budella raccolte in una provetta da 1,5 millilitri in 500 micrometri di MEMFA.

Quindi incubare la provetta a temperatura ambiente con un leggero dondolio per un'ora. Il giorno successivo disidratare il tessuto come indicato nel protocollo di testo e conservarlo a meno 20 gradi Celsius. Per preparare un cestello a rete, per prima cosa, utilizzare una lama a lama singola riscaldata su un bisturi per tagliare il fondo di una provetta da centrifuga con tappo a scatto da due millilitri o cinque millilitri.

Potrebbe essere necessario riscaldare la lama più volte prima che il taglio sia completato. Quindi, taglia un quadrato di una rete di nylon da 110 micron che è leggermente più grande delle nuove aperture. Quindi, incollare la rete all'apertura premendo leggermente il tubo nella rete su una piastra riscaldante impostata a fuoco medio/basso fino a ottenere un buon seel.

Dopo che si è raffreddato, taglia la rete in eccesso e assicurati che non ci siano spazi vuoti. Crea 24 di questi cestelli in modo che corrispondano a una piastra da 24 pozzetti. Quindi, praticare dei fori nel coperchio di una piastra a 24 pozzetti, in modo che il bordo del cestello del campione aderisca al foro e non cada.

Una volta completati, i cestelli per campioni assemblati dovrebbero essere posizionati fino in fondo nei pozzetti. Ora, usa questo supporto per cestelli montato per trasferire i cestelli da una piastra all'altra con relativa facilità durante l'ibridazione in situ. Utilizzare due piastre di questo tipo in modo che, mentre il campione è in incubazione in una, l'altra possa essere preparata per il lavaggio successivo.

Questa sezione copre alcune fasi dell'ibridazione in situ. Vedere il protocollo di testo per una descrizione completa. Per iniziare, trasferire ogni campione di tessuto fissato in un cestello etichettato.

Organizza la piastra in base alle condizioni sperimentali e macchia almeno cinque budella per condizione. Per prima cosa, reidratare delicatamente i campioni. Evitare l'introduzione di bolle d'aria aumentando gradualmente il rapporto tra PBS-T ed etanolo ad ogni lavaggio.

Durante il primo giorno, dopo la fase di pre-ibridazione di due ore, invece di scartare il tampone di ibridazione, conservarlo per un uso futuro durante il saggio. Successivamente, quando si trattano i campioni con una soluzione di ibridazione della sonda, coprire accuratamente la piastra con un foglio di alluminio per evitare l'evaporazione della soluzione. Il secondo giorno, caricare il tampone di ibridazione riservato nella piastra a 24 pozzetti e riscaldare la piastra fino a 60 gradi Celsius.

Più tardi quel giorno, per rimuovere tutte le tracce della sonda e del tampone di ibridazione, lavare i campioni due volte con 2x SSC per tre minuti per lavaggio. Quindi lavare i campioni tre volte con 2x SSC per 20 minuti per lavaggio a 60 gradi Celsius. Quindi preparare l'anticorpo primario nel tampone bloccante.

Caricare 500 microlitri di questa miscela in ogni pozzetto. Dopo la fase di blocco, incubare a temperatura ambiente per circa quattro ore o a quattro gradi Celsius durante la notte. Il terzo giorno, eseguire la reazione cromatica nel substrato cromogenico.

Coprire la piastra del campione con un foglio di alluminio. E durante la reazione, controllare periodicamente la presenza di sovracolorazione con il microscopio di dissezione. Il quarto giorno è importante incubare e sbiancare su una scatola luminosa in quanto ciò consente di rimuovere qualsiasi pigmentazione nei campioni o colorazione dalla soluzione di Bouin e migliora il segnale della sonda per una visualizzazione chiara.

Quindi, dopo il lavaggio con SSC, trasferire con cura i campioni di intestino capovolgendo il cestello in una nuova piastra a 24 pozzetti. Mentre si è nei pozzi, sciacquare accuratamente i cestelli con etanolo al 70%. Quindi precedere con l'imaging dei campioni.

È fondamentale stimare la qualità delle sonde di RNA prima di utilizzarle. Le sonde possono essere controllate su un gel di formaldeide. Se appaiono come bande luminose e discrete, sono di buona qualità.

Quando si colora, alcune variazioni nella distribuzione sono normali tra le repliche biologiche e tra le sette paia di diverticoli dei singoli intestini. Pertanto, è meglio colorare almeno cinque budella per condizione per avere un'idea del modello di colorazione medio. Il successo complessivo è meglio misurato confrontando la colorazione dei campioni di senso e antisenso per ciascuna condizione.

Entrambi devono essere sviluppati per lo stesso periodo di tempo. I campioni di senso dovrebbero avere un colore viola minimo o nullo, mentre i campioni antisenso dovrebbero mostrare una colorazione robusta con uno sfondo minimo. In modo critico, i tessuti devono essere completamente immersi nella macchia per un'esposizione uniforme.

È importante evitare uno sviluppo eccessivo della reazione cromatica. Ciò può comportare un'elevata quantità di colorazione di fondo e i campioni sensoriali possono iniziare a sembrare campioni antisenso. Un altro fattore che influenza i risultati è la quantità di zecche che vengono nutrite in anticipo.

Le zecche che non vengono nutrite o che vengono nutrite solo per 24 ore sono difficili da lavorare. Le loro viscere si danneggiano più facilmente e non si macchiano bene. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni e mezzo o tre se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di tenere a portata di mano tutte le forniture elencate nella tabella dei reagenti e dei materiali prima di iniziare l'esperimento. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.