Name: Visualizzazione del Microbiota in Tick budella di intero-monta In Situ di ibridazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Impara a visualizzare il microbiota intestinale nei tick con ibridazione in situ whole-mount. Questo metodo permette l'analisi spaziale e temporale dei batteri vitali senza sezionamento o attrezzature costose.

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Ringraziamo sinceramente Dr. Mustafa Khokha, Università di Yale, per fornire l'uso delle sue risorse di laboratorio. Siamo grati a Mr. Wu Ming-Jie per l'eccellente assistenza tecnica. EF è un investigatore HHMI. Questo lavoro è stato supportato da un dono dal John Monsky e fondo per la ricerca di Jennifer Weis Monsky malattia di Lyme.

1. preparazione di modelli del DNA
<ol><li>Scarica la sequenza del rRNA 16S specifica ad ogni generi batterica dal NCBI database e progettazione catena della polimerasi (PCR) compatibile avanti e reverse primer che amplificheranno generi specifiche regioni (~ 200-250 base-accoppiamenti lungo) come descritto in precedenza 19. riferirsi alle risorse open source database SILVA20,21 e probeBase22 online per sonde del oligonucleotide rRNA-mirati e primer, come le sonde del RNA per alcuni generi batterici possono essere commercialmente disponibili. Nota: È importante selezionare regioni del gene che sono specifici per specifici generi e garantire che gli iniettori progettati non amplificare generi correlati batterici. Questo è fondamentale per ottenere l'ibridazione sonda gene/generi-specific.</li>
	<li>Mangime, zecche per 24, 48 o 72 h sui topi, sezionare budella tick e preparare il RNA e cDNA da budella di graduazione come descritto precedente23. CDNA di uso come modello per PCR amplificano ampliconi di generi specifici utilizzando un termociclatore. Eseguire un'aliquota del PCR-prodotto/amplicon su gel di agarosio 1.5% e confermare che l'amplicone corrisponde al formato previsto da visualizzazione sotto la luce ultravioletta (UV) usando un gel del sistema di imaging.</li>
	<li>Clonare l'amplicone di RNA ribosomiale batterica 16S di interesse in un vettore di TA commercialmente disponibile (Tabella materiali) contenenti promotori RNA polimerasi adatti a polimerasi del batteriofago (SP6, T7 o T3). Sequenza i cloni per confermare l'identità del amplicon e la direzionalità del clone con riferimento a ciascuno dei promotori. Su questa base, determinare il promotore di scelta per generare senso o RNA antisenso sonde (Figura 1).</li>
	<li>Linearizzare 1 mg del plasmide con un enzima di restrizione appropriato in un volume di reazione di fino a 30 µLfor 2 ore a temperature consigliate dal produttore. Scegliere gli enzimi di restrizione basati sul promotore che sarà utilizzato per generare il senso o la sonda antisenso (Figura 1). Verificare linearizzazione di visualizzazione di 2 µ l di reazione digest su gel di agarosio 1%.</li>
	<li>Purificare i restanti 28 µ l di DNA digerito utilizzando un kit di purificazione di PCR prodotto colonna disponibile in commercio e quantificare la concentrazione di DNA mediante lo spettrofotometro. Nota: Alcune sonde di senso possono causare una colorazione di fondo molto superiore la sonda antisenso corrispondente e potrebbero essere necessario essere esplorato altre opzioni. Controlli negativi alternativi includono plasmidi codifica di sequenze non rappresentati nel campione ovvero un'altra sonda che produce un modello distintivo di ibridazione.</li>
</ol>2. costruzione di sonde del RNA Digoxygenin-UTP
<ol><li>Preparare la miscela del nucleotide combinando 7,5 µ l di 100 mM UTP, 25 µ l di 10 mM digoxygenin-UTP e 10 μl di 100mm ATP e GTP CTP in una provetta da centrifuga da 1,5 mL.</li>
	<li>Eseguire la trascrizione in vitro utilizzando kit di polimerasi T7 o Sp6 RNA commercialmente disponibili, con 1 µ l della miscela del nucleotide (punto 2.1) e 0,25 - 1 µ g di DNA del modello. Portare il volume fino a 20 µ l con acqua. Scorri il tubo per combinare e impulsi spin. Incubare a 37 ° C per 2,5-3 ore. Nota: La sonda costruzione ha avuto successo con plasmide digerito concentrazioni basse quanto 7 ng / µ l, ma le concentrazioni tipiche in questa fascia di passaggio da 15-25 ng / µ l. La reazione di trascrizione può essere incubata anche durante la notte a 37 ° C, ma questo non aumenta significativamente il rendimento di RNA.</li>
	<li>Aggiungere 1 µ l di dnasi (2.000 unità / µ l) e incubare a 37 ° C per 10 min. Non superare i 10 minuti, o l'enzima può iniziare a degradare il RNA.</li>
	<li>Aggiungere 30 µ l di cloruro di litio ghiacciata 7,5-8 M e 30 µ l di acqua refrigerata senza nucleasi a precipitare il RNA. Scorri il tubo per mescolare. Consentire la precipitazione di RNA di procedere durante la notte a-20 ° C.</li>
	<li>Raccogliere RNA mediante centrifugazione a 17.000 x g per 20 min a 4 ° C. Lavare la pallina una volta con 1 mL di etanolo di 75% preparata in dietil pirocarbonato (DEPC) acqua, quindi ripetere la centrifugazione.</li>
	<li>Rimuovere e scartare il surnatante, capovolgere la provetta su una salvietta di carta pulita e lasciare per asciugare per 10 min. Risospendere il pellet in acqua priva di nucleasi. Se la pallina è facilmente visibile, risospendere in 25 µ l. Se il pellet è molto piccolo o non visibile, risospendere in 15-20 µ l. ottenere una stima della concentrazione di RNA mediante lo spettrofotometro. Note: Intervallo di concentrazioni di RNA tipiche da 200-500 ng / µ l.</li>
</ol>3. visualizzazione di RNA sonde tramite l'elettroforesi del Gel di formaldeide di RNA per valutare la purezza di RNA
Attenzione: Formaldeide pone un pericolo di inalazione; di conseguenza, generare le soluzioni necessarie per l'analisi di gel di RNA in una cappa aspirante. Il bromuro di etidio è un sospetto cancerogeno; maneggiare con cura.
<ol><li>Preparare un gel di agarosio 1% formaldeide come precedentemente descritto24 e ghisa il gel in una scatola di gel libera delle RNasi. Una volta fredda, riempire la vaschetta del gel con 1x tampone (1 x MOPS a pH 7,0, 5% formaldeide) di corsa.</li>
	<li>Preparare il tampone del campione (bromuro di etidio 400 mg/mL 5 µ l, 20 µ l 10 x MOPS, 35 formaldeide µ l e 100 µ l formammide). Combinare 2 µ l di sonda RNA (passo 2.6) con 8 µ l di Sample Buffer. Incubare a 70 ° C per 10 min.</li>
	<li>Preparare Buffer di caricamento del RNA dalla combinazione di glicerolo al 50% 5ml, formaldeide al 10% 1 mL, blu di bromofenolo 40 mg, 40 mg xilene cianolo e 20 µ l di EDTA 0.5 M (pH 7.5). Dopo l'uso, conservare questo buffer a-20 ° C.</li>
	<li>Aggiungere 3 µ l di tampone di caricamento per il campione di RNA da passo 3.2 e mescolare. Mantenere le provette dei campioni su ghiaccio.</li>
	<li>Caricare il volume del campione intero dal passo 3.4 nel gel. Caricare un'aliquota della scaletta di RNA singolo-incagliato a fianco per verificare la dimensione del RNA. Esegua il gel a 100 V o inferiore fino a quando il colorante blu migra circa il 75% di strada lungo il gel. Visualizzare il RNA sotto luce UV utilizza un sistema di imaging del gel. Nota: Una sonda del RNA di buona qualità dovrebbe apparire come una fascia discreta con una mobilità corrispondente alla dimensione prevista della sonda (Figura 2, corsia 1). Se la sonda viene visualizzato come una banda diffusa e untuosa (Figura 2lane 2) questo non dovrebbe essere usato.</li>
</ol>4. spuntare Gut accumulazione e fissazione
<ol><li>Raccogliere Ixodes scapularis ninfe che sono alimentati sui topi per i punti di tempo di interesse. Nota: Ai fini di questa tecnica, le zecche alimentati per 48 o 72 h lavoro meglio.</li>
	<li>Sezionare l'intestino dal segno di spunta in MEMFA (tabella 1) su un vetrino con un microscopio di dissezione, evitando di danneggiare l'organo per quanto possibile. Inserire un segno di spunta su un vetrino pulito in 20-30 µ l di MEMFA. Usando un paio di sterile alto tenore di carbonio acciaio rasoio lama #11 fetta regione capa a scuto della zecca lasciando il corpo della zecca. Premere delicatamente il corpo per spingere i diverticoli dell'intestino e delle ghiandole salivari fuori la cuticola del corpo. Separare le ghiandole salivari e nell'intestino e scoop il coraggio della lama di rasoio.</li>
	<li>Raccogliere le budella in una provetta da 1,5 mL contenente 500 µ l MEMFA. Incubare la provetta a temperatura ambiente con dolce dondolo per 1 h o durante la notte a 4 ° C. Nota: Ghiandole salivari Tick anche sezionate e similmente determinazione e possono essere macchiate.</li>
	<li>Disidratare il tessuto lavando delicatamente 3 volte con 1 mL di etanolo al 100% ghiacciata. Lasciate che le budella affondare naturalmente verso il basso del tubo tra ogni lavaggio, centrifugazione potrebbe danneggiare il tessuto. Per l'archiviazione a lungo termine, mantenere i campioni in etanolo al 100% a-20 ° C.</li>
</ol>5. costruzione di maglia campione cesti e Portacesto 24 pozzetti
<ol><li>Tagliare i fondi al largo di 2 mL o 5 mL provette da centrifuga snap-top utilizzando una lama di rasoio taglio singolo riscaldata su un bisturi. Attenzione: La lama potrebbe essere necessario essere riscaldato più volte prima che venga completato il taglio.</li>
	<li>Tagliare quadrati di una maglia di nylon 110 µm leggermente più grande apertura del nuovo. Bond la maglia alla parte inferiore del tubo premendo loro insieme leggermente su un piatto caldo su fuoco medio-basso finché non viene effettuata una buona tenuta. Lasciate raffreddare, assicurarsi che non ci siano lacune tra la maglia e il tubo e tagliare l'eccesso rete intorno ai bordi.</li>
	<li>Tagliare fori presenti sul coperchio di una piastra a 24 pozzetti, tale che il labbro del cestello campione fatto nel passo 5.2 siederà al foro e non cadere attraverso, producendo un set-up dove le parti inferiori dei cestelli campione siederà tutto nei pozzetti quando essi sono posti nella fori nella copertura.</li>
	<li>Utilizzare questo supporto cesto montato per trasferire cestini da un piatto a altro con relativa facilità per l'intero il protocollo di ibridazione in situ . Utilizzare due piastre da 24 pozzetti in modo che mentre si sta verificando una incubazione, l'altra piastra è pronta per il lavaggio successivo.</li>
</ol>6. ibridazione in Situ : giorno 1 (Timing: 4-5 h)
<ol><li>Coraggio di trasferimento di etichettato cesti di campione, separati da condizione sperimentale e inteso sonda del RNA. Nota: Macchia almeno 5 budella a condizione per influenzare la variazione naturale tra repliche.</li>
	<li>Reidratare i campioni delicatamente per evitare di introdurre bolle d'aria nel tessuto aumentando gradualmente il rapporto di tampone fosfato salino con 0,1% tensioattivi non ionici (PTw; Tabella 1) di etanolo nei lavaggi. Nota: Completare tutti i lavaggi nel supporto cesto 24 pozzetti a temperatura ambiente con agitazione delicata se non specificato diversamente. Aliquota di 500-600 µ l di soluzioni di lavaggio in ogni pozzetto del titolare tali che il coraggio in ogni cestino è completamente sommerse. Preparare tutte le soluzioni con acqua trattata con DEPC per evitare la degradazione del RNA.<ol>
<li>Lavare i campioni per 5 min in etanolo al 100% 500 µ l.</li>
		<li>Preparare almeno 500 µ l per cesto campione del 75%, 50% e 25% di etanolo in PTw. reidratare i campioni di lavaggio per 5 min in ogni soluzione di etanolo, lo spostamento dalla più alta concentrazione di etanolo al più basso.</li>
		<li>Lavare i campioni 4 volte per 5 minuti ciascuno in PTw.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Permeabilize i campioni con proteinasi K (10 µ g/mL) in PTw per 5 min.</li>
	<li>Preparare il tessuto per l'ibridazione con le sonde del RNA.<ol>
<li>Lavare i campioni due volte come descritto al punto 6.2 nel supporto cesto 24 pozzetti a temperatura ambiente con agitazione delicata per 5 minuti ciascuno, in 500 µ l di tampone di trietanolammina (0,1 M, pH 7,0-8,0) (tabella 1) per mantenere i campioni in un ambiente privo di ammine.</li>
		<li>Trattare i campioni due volte con 500 µ l 0,25% l'anidride acetica nel buffer di trietanolammina (0,1 M, pH 7,0-8,0) per 5 minuti ciascuno, quindi lavare i campioni due volte in PTw per 5 minuti ciascuno. Nota: L'anidride acetica acetila gratis ammine per neutralizzare la carica positiva, che è fondamentale per evitare interazioni elettrostatiche non specifici e garantire l'associazione specifica della sonda e mRNA.</li>
		<li>Difficoltà le budella per 20 min con paraformaldeide al 4% a 500 µ l di PTw, quindi lavare 5 volte in PTw per 5 minuti ciascuno.</li>
		<li>Prehybridize incubando i campioni in 500 µ l ibridazione buffer /in titolare del cestino 24 pozzetti della piastra ben 24 (tabella 1) per 1,5-2,5 ore a 60 ° C con agitazione delicata in un bagnomaria con agitazione. Salvare il tampone di ibridazione utilizzato per il passaggio di prehybridization per riutilizzare nel giorno 2 protocollo (punto 7.1).</li>
		<li>Preparare soluzioni di ibridazione sonda diluendo le sonde del RNA in tampone di ibridazione ad una concentrazione finale di 1 µ g/mL.  Incubare i campioni con soluzioni di ibridazione sonda nel supporto cesto 24 pozzetti a 60 ° C con agitazione delicata durante la notte in un bagnomaria con agitazione (tabella 2). Coprire la piastra che trasportano il cestello porta comodamente con carta stagnola per evitare l'evaporazione della soluzione di ibridazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. ibridazione in Situ : giorno 2 (Timing: 4.5-5.5 h)
<ol><li>Rimuovere i campioni dalle soluzioni di ibridazione della sonda e inserirli nel tampone di ibridazione riservati dal giorno precedente. Incubare a 60 ° C con agitazione delicata per 3 min. Nota: Sonda di ibridazione soluzioni possono essere conservati a-20 ° C per il riutilizzo fino a 3 volte.</li>
	<li>Preparare 2 x tampone salino-sodio citrato (SSC) diluendo 20 x SSC in acqua trattata con DEPC (tabella 1). Lavare i campioni due volte per 3 min con 2 x SSC, poi 3 volte per 20 min con 2 x SSC a 60 ° C per rimuovere tutte le tracce della sonda e tampone di ibridizzazione.</li>
	<li>Trattamento con RNasi A (20 µ g/mL) e RNasi T1 (10 µ g/mL) in 2X SSC per 30 min a 37 ° C per rimuovere singolo incagliato sonda RNA che rappresenta gratis RNA non ibridate.</li>
	<li>Lavare una volta con 2 x SSC per 10 min a temperatura ambiente. Preparare 0.2 x SSC di diluizione 2 x SSC in acqua trattata con DEPC, poi lavare due volte con 0,2 x SSC per 30 min a 60 ° C per rimuovere l'eccesso RNasi.</li>
	<li>Lavare due volte con 500 µ l di tampone di acido maleico (MAB; Tabella 1) per 10 min.</li>
	<li>Incubare i campioni con soluzione (2% di Reagente Bloccante in MAB) per 1,5-2 h di blocco. Nota: Il reagente bloccante può essere difficile da sciogliere; riscaldamento delicato aiuta la dissoluzione.</li>
	<li>Sostituire la soluzione bloccante con anti-digossigenina alcalino fosfatasi-coniugata 500 µ l di anticorpo ad una diluizione di 1:3,000 nella soluzione di blocco e incubare a temperatura ambiente per circa 4 h o a 4 ° C durante la notte.</li>
</ol>8. ibridazione in Situ : giorno 3 (Timing: 6 h a tutta la notte)
<ol><li>Lavare i campioni almeno 5 volte per 30 minuti ciascuno, con 500 µ l MAB per rimuovere l'anticorpo in eccesso. Nota: Questi lavaggi sono flessibili e possono essere prorogate per 1-2 h, o 3-4 lavaggi possono essere sostituiti per un lavaggio overnight a 4 ° C con un impatto minimo sull'efficacia.</li>
	<li>Lavare due volte per 5 min con tampone di fosfatasi alcalina pH 9.5 (buffer di AP; Tabella 1).</li>
	<li>Iniziare la reazione di colore, sostituendo l'ultimo lavaggio con 500 µ l di substrato cromogenico per la fosfatasi alcalina (Tabella materiali). Coprire la piastra campione con carta stagnola e lasciare che la macchiatura procedere a temperatura ambiente per 3 - 5 h o overnight a 4 ° C. Monitorare la reazione di macchiatura periodicamente esaminando il tessuto al microscopio per dissezione per evitare overstaining. Nota: Quando la colorazione è completa, una tinta viola è rilevabile dall'occhio nei campioni antisenso-sondato al microscopio, ma il tessuto non dovrebbe essere consentito di diventare molto scuro. La macchiatura procede molto lentamente a 4 ° C e può richiedere fino a 20-24 h.</li>
	<li>Arrestare la reazione al colore di lavaggio per 5 min in 500 µ l MAB, quindi fissare il tessuto durante la notte nella soluzione di Bouin. Attenzione: Maneggiare soluzione di Bouin in una cappa; è un agente cancerogeno corrosivo.</li>
</ol>9. ibridazione in Situ : giorno 4 (Timing: 3-3.5 h)
<ol><li>Preparare almeno 7 mL per cesto di campione di 1 x SSC di diluire 20 x SSC in acqua trattata con DEPC. Rimuovere la soluzione di Bouin lavando i campioni 4 a 6 volte con etanolo al 70% in 1 x SSC fino a quando il tessuto non è più giallo.</li>
	<li>Preparare 500 µ l per cesto di campione di 75%, 50% e 25% soluzioni di etanolo in 1 x SSC. Lavare i campioni per 5 min in ogni soluzione, dalla più alta concentrazione di etanolo in movimento al più basso per reidratare il tessuto. Lavare due volte per 5 min ogni 1 in x SSC.</li>
	<li>Incubare i campioni della soluzione di candeggina (tabella 1) per 90 min su una lightbox in una cappa aspirante. Nota: Questo passaggio consente qualsiasi pigmentazione nei campioni o la colorazione da Bouins la soluzione per essere rimosso e migliora il segnale di sonda per visualizzazione libera.</li>
	<li>Lavare i campioni due volte con 500 µ l di 1 x SSC per 5 min.</li>
	<li>Riposizionare le budella con minimo danno capovolgendo il cestello di campione in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti nuovo e lavare con etanolo al 70% attraverso il fondo di rete usando una pipetta di trasferimento. Conservare a-20 ° C se necessario.</li>
	<li>Per ottenere una panoramica dei modelli di macchiatura di campioni multipli, come illustrato nella Figura 3, mantenere il fegato in etanolo al 70% in 24-piastra e Mostra con qualsiasi microscopio a campo chiaro. Per esaminare i singoli budella con un microscopio a campo chiaro come mostrato in Figura 4, Figura 5, e nella figura 6, montare le budella in 100% glicerolo sotto vetrini coprioggetti. Utilizzare una spatola di plastica per manipolare delicatamente il tessuto con il minimo danno. Nota: L'elevata viscosità del glicerolo aiuta a proteggere i tessuti da danni da compressione e permette il posizionamento accurato dei diverticoli tale che il tessuto può essere visionato in modo ottimale a ingrandimenti superiori.</li>
	<li>Catturare immagini il microscopio usando software di acquisizione di immagini specifiche di microscopio (Tabella materiali) ed esportare come immagini Tiff a una generica immagine software di editing. Per quantificare le differenze relative di colorazione tra trattamenti sperimentali, scaricare un software di analisi di immagine generica (Tabella materiali). Aprire l'immagine all'interno del software di analisi e utilizzare le istruzioni all'interno del software per misurare pixel intensità della colorazione e calcolare trame istogramma della colorazione.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

Questo è il primo uso di una tecnica di ibridazione (WMISH) intero-monta in situ per studiare il microbiota di un artropodo vettore di agenti patogeni. Il nostro protocollo è stato adattato da quello utilizzato nello studio dello sviluppo in Drosophila che in rana embrioni25,26. Intero-monta RNA in situ ibridazione venga ordinariamente utilizzato per localizzare le trascrizioni del gene spazialmente e temporalmente27</...

Gli agenti patogeni umani e bestiame, trasmessi da artropodi vettori si trovano in tutto il mondo e rappresentano circa il 20% delle malattie infettive a livello globale1, ma efficace e sicuro vaccini contro la maggior parte di questi agenti patogeni non sono disponibili. Nostra comprensione dell'importanza del ruolo dei microrganismi commensali, simbiotici e patogeni, conosciuti collettivamente come il microbioma2, modulante e plasmare la salute di quasi tutti i metazoi3 si sta espandendo. Ora è evidente che anche Porto di artropodi vettori di agenti patogeni microbiota dell'intestino e questi microbiota vettoriale-collegata hanno dimostrato di influenzare diversi agenti patogeni vettore4,5. Il microbioma dell'artropodo è composto di eubatteri, archaea, virus e microbi eucarioti come protozoi, nematodi e funghi6. Tuttavia, il focus della ricerca predominante è stato il eubatteri dovuta, in parte, alla disponibilità di geni marcatori e banche dati di riferimento per identificare i membri batterici specifici.
Con un focus su Ixodes scapularis, tick vettoriale di agenti patogeni umani multipli compreso Borrelia burgdorferi7, l'agente eziologico della malattia di Lyme, l'ottimizzazione di una tecnica di visualizzazione microbica mirava a miglioramento della nostra comprensione del microbiota dell'intestino tick nel contesto delle interazioni di vettore-patogeno. Parecchie domande rimangono da risolvere nel campo microbiome tick. L'intestino è il sito del primo incontro esteso tra il segno di spunta e l'agente patogeno in arrivo nel contesto degli agenti patogeni orizzontalmente trasferiti; Pertanto, la comprensione del ruolo del microbiota dell'intestino vettoriale nel modulare le interazioni di vettore-patogeno rivelerà significativi approfondimenti. Le zecche hanno una modalità unica di digestione del pasto di sangue, dove l'elaborazione del pasto di sangue componenti prende posto intracellulare8. Lume dell'intestino apparentemente serve come recipiente per contenere il pasto di sangue come i feed di tick, e assimilazione e digestione nutriente derivarne durante i diversi giorni di alimentazione e continuare post replezione. Gli agenti patogeni acquisiti dal segno di spunta durante l'alimentazione Inserisci lume dell'intestino con le farine di sangue e il lume diventa così un sito primario delle interazioni tra il tick, agente patogeno e microbiota residente. Come digestione procede attraverso la replezione e zecche Ixodidae molting, intestino subisce modificazioni strutturali e funzionali9. È anche probabile che variano in concerto con il milieu di intestino cambiando la composizione e l'organizzazione spaziale dei batteri dell'intestino. Pertanto, è importante capire l'architettura di batteri residenti nell'intestino tick per comprendere appieno l'interazione di tick, agente patogeno e microbiota dell'intestino.
Tecniche molecolari per descrivere il microbiota host associato abitualmente utilizzano high throughput sequenziamento parallelo strategie10 per amplificare e sequenza DNA ribosomal 16S batterica (rDNA). Queste strategie di sequenziamento eludere la necessità di ottenere colture axeniche di batteri specifici e forniscono una descrizione approfondita di tutti i membri batterici rappresentata nel campione. Tuttavia, tali strategie sono confusi dall'incapacità di distinguere contaminazioni ambientali da residenti di bona fide . Ulteriormente, quando valutare i campioni, come le zecche, che sono di piccole dimensioni e quindi contengono DNA microbiota-specific basso cede, la probabilità di amplificazione di contaminanti ambientali è aumentato11 e risultati nell'interpretazione ambigua della microbioma composizione. Caratterizzazione funzionale in combinazione con la visualizzazione di specifici batteri vitali, pertanto, sarà fondamentale per definire e discernere il microbioma del battito temporalmente e spazialmente. Verso questo obiettivo, abbiamo approfittato dell'intero-monta RNA in situ ibridazione. Questa tecnica è usata ordinariamente per valutare il pattern di espressione genica in organi ed embrioni12,13,14 e permette l'analisi semiquantitativa dell'espressione sopra l'intero campione di interesse. Questo comportamento differisce da tecniche tradizionali in situ di ibridazione che utilizzano sezioni di tessuto e spesso richiedono un'approfondita analisi di materiale sezionato con un assembly computazionale per predire l'espressione in organi interi15. Mentre intero-monta si riferisce generalmente a interi organismi12, qui intero-monta si riferisce all'intero fegato o organi. I vantaggi di utilizzare l'intero-monta RNA in situ ibridazione approccio per valutare l'architettura del microbiota dell'intestino tick sono molteplici. L'intestino di graduazione è composto da 7 paia di diverticoli, ogni coppia variano in dimensione16. Le differenze funzionali, se qualcuno, tra questi diverticoli, non sono compresi nell'ambito della biologia di tick, tick interazioni microbiota o tick-patogeno. Manipolazioni dell'intestino che rompersi i diverticoli intestino sarebbero spostare il microbiota presente nel lume dell'intestino o quelle associate senza bloccare l'intestino e il risultato in un'interpretazione errata della localizzazione spaziale del microbiota. Fluorescenza-identificato RNA in situ ibridazione è stata utilizzata in precedenza per esaminare tick gut trascrizioni17 fissando e diverticoli intestino individuali per garantire l'ibridazione della sonda e per localizzare b. burgdorferi di apertura trascrizioni sezionando paraffina tutta zecche18. Entrambi questi approcci richiedono manipolazioni dei tessuti tick prima dell'ibridazione che interesserebbero l'architettura del microbiota intestinale.
In questo rapporto, descriviamo in dettaglio il protocollo per esaminare il battito vitale microbiota dell'intestino intero-monta in situ ibridazione (WMISH). L'uso dell'intero-monta RNA in situ ibridazione consente una comprensione globale della presenza e abbondanza di batteri dell'intestino specifici nelle diverse regioni dell'intestino e può stimolare nuove intuizioni biologia di intestino tick nel contesto della colonizzazione del patogeno e trasmissione. Ulteriormente, l'uso di sonde di RNA nei confronti di specifico RNA batterico permette la rilevazione di batteri vitali nell'intestino tick.

<table><tbody><tr><td>Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron</td><td>Amazon</td><td>03-110/47</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T Easy Vector System</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>Digoxygenin-11-UTP</td><td>Roche</td><td>1209256910</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I(senza RNAsi)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>Kit di sintesi dell'RNA HiScribe SP6</td><td>New England Biolabs</td><td>E2070S</td><td></td></tr><tr><td>Kit di sintesi dell'RNA ad alto rendimento HiScribe T7 New</td><td>England Biolabs</td><td>E2040S</td><td></td></tr><tr><td>Acqua, senza RNasi, trattato con DEPC</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02128-00500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0,5 M, pH 8,0</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00502-01000</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide, 37%</td><td>JT Baker</td><td>2106-01</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600-00500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 10X</td><td>Gibco</td><td>14300-075</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>Trietanolammina HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1502-100G</td><td></td></tr><tr><td>Anidride acetica</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320102-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>ThermoScientific/Pierce</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>SSC, 20X</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB13156-01000</td><td></td></tr><tr><td>RNA da lievito</td> <td>torulaSigma Aldrich</td><td>R3629-5G</td><td></td></tr><tr><td>Eparina, sale sodico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di Denhardt, 50X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2532-5ML</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS idrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3023-1G</td><td></td></tr><tr><td>RNasi A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10109142001</td><td></td></tr><tr><td>RNasi T1</td><td>ThermoScientific&nbsp;</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>Acido maleico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0375-100G</td><td></td></tr><tr><td>Reagente bloccante</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenina-AP, Fab frammenti Sigma</td><td>Aldrich</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Levamisol cloridrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31742-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Substrato cromogenico per fosfatasi alcalina</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Soluzione di 11442074001</td></tr><tr><td>Bouin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT10132-1L</td><td></td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno</td><td>Mallinkrodt Baker, Inc</td><td>2186-01</td><td></td></tr><tr><td>Scala RNA a filamento singolo</td><td>Ambion -Millenium</td><td>AM7151</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;#11 Lame in acciaio ad alto tenore di carbonio&nbsp;</td><td>C e A Scientific Premiere</td><td>#11-9411</td><td></td></tr><tr><td>Termociclatore</td><td>BioRad, CA</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>ThermoScientific&nbsp;</td>Agitatore orbitale <td>NanoDrop 2000C</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>DS-500E Agitatore</td><td></td>orbitale digitale</tr><tr><td>Bagno d'acqua con agitazione</td><td>BELLCO Glass, Inc</td><td>Hot Shaker-7746-12110</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di documentazione in gel</td><td>BioRad</td><td>Gel Doc XR+ Sistema</td><td></td>di documentazione in</tr><tr><td>gel Microscopio a campo chiaro</td><td>Nikon</td><td>NikonSM2745T</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a campo chiaro&nbsp;</td><td>Microscopio da dissezione Zeiss</td><td>AXIO Scope.A1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>STEMI 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Kit di</td> purificazione PCR <td>VWR</td><td>102097-658</td><td></td>light box</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Software di acquisizione immagini</td><td>Zeiss</td><td>Zen lite</td><td></td></tr><tr><td>Software di elaborazione immagini&nbsp;</td><td>Adobe&nbsp;</td><td>Adobe Photoshop CS4 versione 11.0</td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi</td><td>delle immagini National Institutes of Health</td><td>ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>Strumentazione compatibile con l'automazione</td><td>Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germania).&nbsp;</td><td>Intavis, Biolane HT1.16v</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizzazione del microbiota in tick budella di intero-monta in situ di ibridazione

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Malattie infettive trasmesse da artropodi vettori continuano a costituire una grave minaccia per la salute umana in tutto il mondo. Gli agenti patogeni che causano queste malattie, non esistono in isolamento quando essi colonizzano il vettore; piuttosto, essi probabilmente impegnarsi nelle interazioni con microrganismi residenti nel lume dell'intestino. Il microbiota di vettore ha dimostrato di giocare un ruolo importante nella trasmissione di patogeni per parecchie malattie trasmesse da vettori. Se i batteri residenti nell'intestino della zecca Ixodes scapularis , il vettore di agenti patogeni umani diversi tra cui burgdorferi di Borrelia, influenzano trasmissione di graduazione degli agenti patogeni non è determinato. Abbiamo bisogno di metodi per caratterizzare la composizione dei batteri associati con l'intestino di graduazione per agevolare una migliore comprensione delle interazioni potenziali interspecie nell'intestino tick. Utilizzo intero-monta in situ ibridazione di visualizzare trascrizioni del RNA associate a particolari specie batteriche consente la raccolta dei dati qualitativi per quanto riguarda l'abbondanza e la distribuzione del microbiota in tessuto intatto. Questa tecnica può essere utilizzata per esaminare le modifiche il milieu di microbiota dell'intestino nel corso del tick alimentazione e può essere applicata anche per analizzare l'espressione dei geni di segni di graduazione. Macchiatura di zecca tutta budella informazioni rendimento lorda distribuzione spaziale del target RNA nel tessuto senza la necessità di ricostruzione tridimensionale e risente meno di contaminazione ambientale, che spesso confonde il sequenziamento-based Metodi frequentemente utilizzati per lo studio di comunità microbiche complesse. Nel complesso, questa tecnica è uno strumento prezioso che può essere utilizzato per meglio capire vettoriale-patogeno-microbiota interazioni e il loro ruolo nella trasmissione della malattia.

La misurazione e la valutazione della qualità delle sonde del RNA sono fondamentali prima di iniziare la colorazione. In vitro trascrizione efficienza dipende altamente la quantità e la qualità del modello del DNA. Abbiamo visualizzato ordinariamente le sonde del RNA su un gel di formaldeide per verificare la purezza e la quantità di sonda generata dalle reazioni di trascrizione. Le sonde dovrebbero essere visualizzato come bande luminose, discreti (Figura 2<...

Qui, presentiamo un protocollo per spazialmente e temporalmente valutare la presenza del microbiota praticabile nelle viscere di segno di spunta utilizzando un approccio modificato intero-monta l'ibridazione in situ.

Visualizzazione del Microbiota in Tick budella di intero-monta In Situ di ibridazione

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sull'entomologia delle zecche, come valutare la presenza di batteri vitali nella zecca spazialmente e temporalmente. I principali vantaggi di questa tecnica sono che non richiede il sezionamento delle zecche o attrezzature costose e che consente la visualizzazione spaziale e temporale dei trascritti genici. In generale, le persone che non conoscono questa tecnica avranno difficoltà perché coinvolge più passaggi e reagenti.Tuttavia, questa tecnica non è laboriosa. Sebbene il completamento possa richiedere circa tre giorni, il tempo a disposizione è di poche ore al giorno. In preparazione, nutrire le zecche raccolte per 48-72 ore prima della raccolta intestinale.Per sezionare l'intestino dalla zecca, aggiungere da 20 a 30 microlitri di soluzione di MEMFA a un vetrino pulito. Quindi posiziona la zecca nel MEMFA e regola la messa a fuoco sulla testa della zecca. Ora, usando un paio di lame di rasoio sterili in acciaio ad alto tenore di carbonio, taglia la regione della testa allo scutum lasciando intatto il corpo della zecca.Quindi, premere delicatamente il corpo per spingere i diverticoli intestinali e le ghiandole salivari fuori dalla cuticola del corpo. Quindi, senza danneggiare le budella, separarle accuratamente dalle ghiandole salivari e raccogliere con cura i tagli su una lama di rasoio. Raccogli tutte le budella raccolte in una provetta da 1,5 millilitri in 500 micrometri di MEMFA.Quindi incubare la provetta a temperatura ambiente con un leggero dondolio per un'ora. Il giorno successivo disidratare il tessuto come indicato nel protocollo di testo e conservarlo a meno 20 gradi Celsius. Per preparare un cestello a rete, per prima cosa, utilizzare una lama a lama singola riscaldata su un bisturi per tagliare il fondo di una provetta da centrifuga con tappo a scatto da due millilitri o cinque millilitri.Potrebbe essere necessario riscaldare la lama più volte prima che il taglio sia completato. Quindi, taglia un quadrato di una rete di nylon da 110 micron che è leggermente più grande delle nuove aperture. Quindi, incollare la rete all'apertura premendo leggermente il tubo nella rete su una piastra riscaldante impostata a fuoco medio/basso fino a ottenere un buon seel.Dopo che si è raffreddato, taglia la rete in eccesso e assicurati che non ci siano spazi vuoti. Crea 24 di questi cestelli in modo che corrispondano a una piastra da 24 pozzetti. Quindi, praticare dei fori nel coperchio di una piastra a 24 pozzetti, in modo che il bordo del cestello del campione aderisca al foro e non cada.Una volta completati, i cestelli per campioni assemblati dovrebbero essere posizionati fino in fondo nei pozzetti. Ora, usa questo supporto per cestelli montato per trasferire i cestelli da una piastra all'altra con relativa facilità durante l'ibridazione in situ. Utilizzare due piastre di questo tipo in modo che, mentre il campione è in incubazione in una, l'altra possa essere preparata per il lavaggio successivo.Questa sezione copre alcune fasi dell'ibridazione in situ. Vedere il protocollo di testo per una descrizione completa. Per iniziare, trasferire ogni campione di tessuto fissato in un cestello etichettato.Organizza la piastra in base alle condizioni sperimentali e macchia almeno cinque budella per condizione. Per prima cosa, reidratare delicatamente i campioni. Evitare l'introduzione di bolle d'aria aumentando gradualmente il rapporto tra PBS-T ed etanolo ad ogni lavaggio.Durante il primo giorno, dopo la fase di pre-ibridazione di due ore, invece di scartare il tampone di ibridazione, conservarlo per un uso futuro durante il saggio. Successivamente, quando si trattano i campioni con una soluzione di ibridazione della sonda, coprire accuratamente la piastra con un foglio di alluminio per evitare l'evaporazione della soluzione. Il secondo giorno, caricare il tampone di ibridazione riservato nella piastra a 24 pozzetti e riscaldare la piastra fino a 60 gradi Celsius.Più tardi quel giorno, per rimuovere tutte le tracce della sonda e del tampone di ibridazione, lavare i campioni due volte con 2x SSC per tre minuti per lavaggio. Quindi lavare i campioni tre volte con 2x SSC per 20 minuti per lavaggio a 60 gradi Celsius. Quindi preparare l'anticorpo primario nel tampone bloccante.Caricare 500 microlitri di questa miscela in ogni pozzetto. Dopo la fase di blocco, incubare a temperatura ambiente per circa quattro ore o a quattro gradi Celsius durante la notte. Il terzo giorno, eseguire la reazione cromatica nel substrato cromogenico.Coprire la piastra del campione con un foglio di alluminio. E durante la reazione, controllare periodicamente la presenza di sovracolorazione con il microscopio di dissezione. Il quarto giorno è importante incubare e sbiancare su una scatola luminosa in quanto ciò consente di rimuovere qualsiasi pigmentazione nei campioni o colorazione dalla soluzione di Bouin e migliora il segnale della sonda per una visualizzazione chiara.Quindi, dopo il lavaggio con SSC, trasferire con cura i campioni di intestino capovolgendo il cestello in una nuova piastra a 24 pozzetti. Mentre si è nei pozzi, sciacquare accuratamente i cestelli con etanolo al 70%. Quindi precedere con l'imaging dei campioni.È fondamentale stimare la qualità delle sonde di RNA prima di utilizzarle. Le sonde possono essere controllate su un gel di formaldeide. Se appaiono come bande luminose e discrete, sono di buona qualità.Quando si colora, alcune variazioni nella distribuzione sono normali tra le repliche biologiche e tra le sette paia di diverticoli dei singoli intestini. Pertanto, è meglio colorare almeno cinque budella per condizione per avere un'idea del modello di colorazione medio. Il successo complessivo è meglio misurato confrontando la colorazione dei campioni di senso e antisenso per ciascuna condizione.Entrambi devono essere sviluppati per lo stesso periodo di tempo. I campioni di senso dovrebbero avere un colore viola minimo o nullo, mentre i campioni antisenso dovrebbero mostrare una colorazione robusta con uno sfondo minimo. In modo critico, i tessuti devono essere completamente immersi nella macchia per un'esposizione uniforme.È importante evitare uno sviluppo eccessivo della reazione cromatica. Ciò può comportare un'elevata quantità di colorazione di fondo e i campioni sensoriali possono iniziare a sembrare campioni antisenso. Un altro fattore che influenza i risultati è la quantità di zecche che vengono nutrite in anticipo.Le zecche che non vengono nutrite o che vengono nutrite solo per 24 ore sono difficili da lavorare. Le loro viscere si danneggiano più facilmente e non si macchiano bene. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni e mezzo o tre se eseguita correttamente.Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di tenere a portata di mano tutte le forniture elencate nella tabella dei reagenti e dei materiali prima di iniziare l'esperimento. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.

visualization-microbiota-tick-guts-whole-mount-situ

Research

Ricerca

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Malattia di Lyme studi di ricerca spesso richiedono la generazione di zecche infette dal patogeno Borrelia burgdorferi, un processo che richiede in genere diverse settimane. Qui si dimostrano una microiniezione procedura basata infezione zecca che può essere compiuto entro poche ore. Abbiamo anche dimostrare un metodo di immunofluorescenza per la localizzazione in situ di B. burgdorferi in zecche.

Metodi per il trasferimento rapido e localizzazione di agenti patogeni malattia di Lyme All&#39;interno della Gut Tick

Visualizzare batteri nei nematodi usando la microscopia a fluorescenza

Fonte: Ng, K. M., Tropini, C. Visualizzazione delle interazioni microbiota-ospite intestinale tramite ibridazione fluorescente in situ , colorazione con lectine e imaging. J. Vis. Esp. (2021).Questo video dimostra la procedura di ibridazione fluorescente in situ (FISH) per colorare il microbiota intestinale all'interno del tessuto intestinale del topo ibridando sonde fluorescenti con rRNA batterico (acido ribosomico ribonucleico) e controcolorando le strutture dell'ospite per analisi...

Ibridazione in situ fluorescente dei batteri intestinali nelle sezioni intestinali del topo

Questo video mostra la visualizzazione di batteri nel tessuto vescicale deparaffinizzato di un paziente infetto dal tratto urinario. La sonda marcata in fluorescenza ibridata con RNA ribosomiale batterico 16s rivela i batteri associati ai tessuti e la loro distribuzione, fornendo preziose informazioni spaziali sulla loro densità all'interno del campione.

Visualizzazione dei batteri nelle sezioni di biopsia vescicale tramite ibridazione in situ a fluorescenza

La malattia di Lyme è la più comunemente riportati vector-borne malattia in Nord America. L'agente eziologico, Borrelia burgdorferi è un batterio spirocheta trasmessa da zecche ixodid. Trasmissione e rilevamento di un'infezione in modelli animali è ottimizzata dall'utilizzo di alimentazione tick, che descriveremo qui.

Alimentazione di zecche su animali per trasmissione e Xenodiagnosis a Lyme Disease Research

Qui presentiamo un protocollo di sequenziamento di nuova generazione per rRNA 16S che consente l'identificazione e la caratterizzazione delle comunità microbiche all'interno di vettori. Questo metodo prevede l'estrazione di DNA, amplificazione e codici a barre dei campioni mediante PCR, sequenziamento su una cella di flusso e la bioinformatica per abbinare i dati di sequenza filogenetica informazioni.

Tick Microbiome caratterizzazione ordinando Amplicon del rRNA 16S di prossima generazione

Lo scopo di questo protocollo è quello di visualizzare Candida albicans forma cellulare e localizzazione nel tratto gastrointestinale dei mammiferi.

Visualizzazione degli albicani Candida nel tratto gastrointestinale Murine utilizzando l'ibridazione fluorescente in Situ

Questo protocollo semplificato descrive in dettaglio un flusso di lavoro per rilevare e visualizzare batteri in campioni di tessuto complessi, dal fissaggio del tessuto alla colorazione dei microbi con ibridazione fluorescente in situ .

Visualizzazione delle interazioni microbiota-ospite intestinale tramite ibridazione fluorescente in situ , colorazione della lectina e imaging

I microbi intestinali, compresi i batteri extracellulari e gli agenti patogeni intracellulari come il virus Orsay e i microsporidi (funghi), sono spesso associati ai nematodi selvatici di Caenorhabditis . Questo articolo presenta un protocollo per rilevare e quantificare i microbi che colonizzano e / o infettano i nematodi C. elegans e per misurare il carico patogeno dopo infezioni controllate in laboratorio.

Ibridazione in situ con fluorescenza dell'RNA (FISH) per visualizzare la colonizzazione microbica e l'infezione nell'intestino di Caenorhabditis elegans

In questo articolo, descriviamo una procedura che consente il rilevamento a livello di organo di batteri patogeni durante l'infezione e la quantificazione delle attività del reporter fluorescente.

Tomografia tridimensionale tridimensionale ad alta risoluzione di infezioni microbiche

Qui, presentiamo un protocollo per raccogliere saliva, emolinfa, ghiandole salivari e intestino medio, dopo la dissezione di una zecca nutrita individualmente, per studiare la localizzazione tessuto-specifica dei patogeni trasmessi dalle zecche per migliorare la comprensione della competenza del vettore e delle interazioni patogeno-microbioma.

Estrazione di saliva, emolinfa, ghiandole salivari e intestino medio da singole zecche (Acari: Ixodidae)

Impara a visualizzare il microbiota intestinale nei tick con ibridazione in situ whole-mount. Questo metodo permette l'analisi spaziale e temporale dei batteri vitali senza sezionamento o attrezzature costose.

Visualizzazione del Microbiota in Tick budella di intero-monta In Situ di ibridazione

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