Name: Metabolismo di mappatura: Monitoraggio dellattività della deidrogenasi del lattato direttamente nel tessuto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Scopri come mappare l'attività della deidrogenasi del lattato direttamente nei campioni di tessuto. Questo metodo consente di rilevare la distribuzione spaziale dell'attività enzimatica NAD(P)H nei tessuti.

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HAC fu lo studioso di Milton E. Cassel della Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni per HAC dal National Institute di R01 di scienze mediche generali GM081686, R01 AR070245, Istituto nazionale di generali (Medical Sciences R01 GM0866465, Eli ed Edythe Broad centro di medicina rigenerativa e ricerca sulle cellule staminali Colline di rose e Hal Gaba awards), Health Center/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, alla Leukemia Lymphoma Society, impatto Iris Cantor femminile premi da Jonsson Comprehensive Cancer Center a WEL e HAC. Ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Cancer Institute del National Institutes of Health, sotto Premio numero P50CA092131. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto. HAC è un membro della Eli & Edythe Broad centro di medicina rigenerativa & ricerca sulle cellule staminali, l'Istituto di biologia molecolare di UCLA e il programma interdipartimentale di bioinformatica di UCLA.

Tutti gli esperimenti descritti sono stati approvati dal comitato di cura animale presso l'Università di California, Los Angeles.
1. generare diapositive della pelle del topo congelati
<ol><li>Eutanasia topi in conformità alla politica di istituzione. Nota: Seguire la politica istituzionale per indumenti di protezione. Tutti i protocolli che coinvolgono gli animali devono essere approvati dal Comitato cura animale istituzionale.</li>
	<li>Rimuovere i capelli del mouse con un trimmer peli di animali.</li>
	<li>Fare delle incisioni nella pelle usando le forbici. Usando il forcipe, sollevare la pelle dal mouse. Utilizzando le forbici, tagliare la sezione di pelle.</li>
	<li>Riempire il cryomold con congelamento reagente composto (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Sezioni di pelle posto in cryomolds riempito usando il forcipe dal naso dell'ago. Orientare la pelle affinché fettine di tessuto genererà una sezione trasversale della pelle dall'epidermide al derma, ipoderma e muscolo (Figura 2). Nota: se possibile, montare sperimentale e topi di controllo insieme alla cryomold stesso modo possono essere sezionati sulla diapositiva stessa ed elaborate insieme. Fare attenzione a non per creare bolle.</li>
	<li>Posto cryomold sulla superficie piana di un blocco di ghiaccio secco in un secchio di ghiaccio e far congelare. Continuare ad osservare l'orientamento della pelle. Regolare se necessario. Nota: Indossare guanti criogenici maneggiare ghiaccio secco.</li>
	<li>Trasferimento cryomolds in un congelatore-80 ° C per la conservazione. I campioni possono essere mantenuti in freezer per circa 3 mesi senza una significativa perdita di attività enzimatica. Sezioni congelate non lasciare asciugare.</li>
	<li>Utilizzando un criostato a-20 ° C, fetta del tessuto per creare sezioni 7-10 µm di spessore per la miglior pelle morfologia21.</li>
</ol>2. preparazione diapositive per la colorazione
<ol><li>Stabilire il set di diapositive da testare. Includono un vetrino di controllo su cui sarà trattenuto il NAD e far scorrere un altro controllo in cui il substrato, lattato, verrà trattenuto. Includere un vetrino di controllo positivo da un blocco di tessuto congelato precedentemente studiato.</li>
	<li>Brevemente Difficoltà diapositive contenente sezioni di pelle con formalina 4% per 5 min da pipettaggio 1 mL di formalina 4% sulla diapositiva, o durante l'elaborazione di più diapositive, immergendo i vetrini in un recipiente contenente formalina 4%. Nota: La fissazione garantirà che la pelle non staccare dalle diapositive durante le seguenti procedure e preservare la morfologia della pelle. Attenzione: La formalina è un agente cancerogeno e pericolose; indossare guanti, non lasciare che toccare la tua pelle ed eseguire questo passaggio in una cappa chimica.</li>
	<li>Lavare i vetrini con il fosfato di almeno 1 mL tampone, pH 7.4, per ogni diapositiva o pipettando o immersione.</li>
</ol>3. preparare la soluzione di colorazione
<ol><li>I reagenti insieme vortice per la colorazione di attività della deidrogenasi del lattato (Tris 50 mM a pH 7.4, 750 µM NADP, 80 µM fenazina methosulfate (PMS), cloruro di nitrotetrazolium blu 600 µM e lattato di 30 mM) in un tubo di dimensione appropriate a seconda della quantità di macchiatura soluzione necessaria. Nota: 1 mL è sufficiente per coprire completamente una diapositiva.</li>
	<li>Preparare una seconda soluzione in cui tutti i reagenti sono presenti tranne NAD. Preparare una terza soluzione in cui tutti i reagenti sono presenti ad eccezione del lattato.</li>
</ol>4. Incubare i vetrini nella soluzione di colorazione
<ol><li>Delicatamente dispensare la soluzione colorante o soluzioni per il controllo sui vetrini preparati che coprono la sezione nella sua interezza (1 mL è sufficiente per una diapositiva). Se più diapositive vengono elaborati insieme, immergere tutti i vetrini nella soluzione colorante allo stesso tempo (assicurarsi che il contenitore è una soluzione abbastanza per coprire completamente la sezione di tessuto).</li>
	<li>Incubare i vetrini in un ambiente umidificato a 37 ° C al buio. Se la soluzione di colorazione è in cima alla diapositiva, è possibile collocare il vetrino in un ambiente umidificato per evitare l'evaporazione.</li>
</ol>5. monitorare le diapositive
<ol><li>Monitorare la conversione della soluzione colorante da chiaro a blu mediante ispezione visiva. Quando i campioni hanno raggiunto il livello desiderato di azzurro, arrestare la reazione rimuovendo la soluzione colorante. Nota: Per la pelle, 10 min è sufficiente. Il tempo dipenderà l'organo e l'attività enzimatica.</li>
	<li>Sciacquare i vetrini con tamponato fosfato salino pipettando (1 mL è sufficiente per ogni diapositiva) o immersione. Nota: Eventuali campioni che saranno confrontati a vicenda devono essere mantenuti nella soluzione colorante per la stessa quantità di tempo.</li>
</ol>6. colorante di contrasto e montare
<ol><li>Dispensare una colorazione sui vetrini quando le diapositive hanno raggiunto un livello adeguato di azzurro. Nota: Coloranti che trasformano i nuclei rossi o verdi fornirà buon contrasto con il blu creato dal formazano precipitante.</li>
	<li>Montare con acquoso o non acquoso montaggio medio22. Una-tre gocce (40-50 µ l) di mezzo di montaggio è sufficiente a seconda delle dimensioni del vetrino coprioggetti.</li>
</ol>7. immagini diapositive e quantificare
<ol><li>Diapositive di immagini al microscopio ottico. Prendere fotografie di sperimentale e campioni di controllo e tutti i controlli negativi a 10x, 20x e 40x.</li>
	<li>Determinare l'intensità della macchia blu in diverse regioni con software di analisi di immagine.</li>
</ol>

<ol><li>Boonacker, E., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+cytochemical+techniques+for+metabolic+mapping+in+living+cells%2C+with+special+reference+to+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis.</a> J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).</li>
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<li>Zhao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine-5+acetylation+negatively+regulates+lactate+dehydrogenase+A+and+is+decreased+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Lysine-5 acetylation negatively regulates lactate dehydrogenase A and is decreased in pancreatic cancer.</a> Cancer Cell. 23, 464-476 (2013).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno concorrenti interessi di divulgare.

Il metodo qui descritto può essere utilizzato per monitorare l'attività della deidrogenasi del lattato o altri enzimi metabolici che generano NADH o NADPH, in diversi tipi cellulari all'interno di un tessuto o di diverse porzioni di un tessuto nel corso del tempo. Lattato deidrogenasi è un enzima importante per la comprensione della biologia delle cellule staminali e tumori, e la capacità di monitorare l'attività della deidrogenasi del lattato in singole celle rischia di fornire le comprensioni importanti nella funzione ...

Capire le posizioni all'interno dei tessuti in cui gli enzimi hanno attività alta o bassa è essenziale per la fisiologia e sviluppo di comprensione. Livelli di trascrizione o di proteine sono spesso utilizzati come surrogati per l'attività enzimatica. Mentre tali studi possono essere ben informativi, non forniscono informazioni che possono essere critici per determinare l'attività di un enzima, quali modificazioni post-traduzionali, la presenza di complessi proteici, o localizzazione subcellulare dell'enzima. Quando l'attività enzimatica è misurata direttamente, spesso è monitorato nei lisati di omogeneizzato proteine che non contengono informazioni su singole celle all'interno della miscela o la distribuzione spaziale delle cellule con alta o bassa attività all'interno di un tessuto.
Forniamo qui un protocollo dettagliato per mappare la distribuzione spaziale dell'attività enzimatica all'interno di un campione di tessuto. La metodologia si basa su precedenti studi che dimostrano che sali di tetrazolio possono essere utilizzati per localizzare l'attività della deidrogenasi, riduttasi e ossidasi in tessuto congelato1. Con questi metodi, un formazan insolubili in acqua si forma quando protoni vengono trasferiti a un tetrazolium sale2,3. Glucosio-6-fosfato deidrogenasi genera NADPH e un protone ed è stata rilevata con attività di tetrazolium. Glucosio-6-fosfato deidrogenasi è stata monitorata epatociti Platichthys flesus4, nelle cellule alveolari di tipo 2 del polmoni5 e nefroni del rene5. Sali di tetrazolio sono stati utilizzati anche per monitorare l'attività di transketolase in tessuto congelato6. Un approccio simile è stato recentemente utilizzato per monitorare l'attività della deidrogenasi multiple nel tessuto stesso su diapositive adiacenti7.
Descriviamo qui un metodo per utilizzare sali di tetrazolio per monitorare la distribuzione spaziale delle attività della deidrogenasi del lattato (Figura 1). Lattato deidrogenasi può convertire piruvato generato da glicolisi di lattato e la reazione inversa. L'attività della deidrogenasi del lattato è di conseguenza un determinante importante dell'entrata di piruvato nel ciclo dell'acido tricarbossilico contro sua secrezione come lattato. Livelli di lattato nel sangue sono spesso utilizzati per diagnosticare una gamma di malattie, compreso cancro8,9,10, perché può segnalare che la malattia o infortunio ha danneggiato le cellule e l'enzima è stato rilasciato.
Ci sono quattro geni di lattato deidrogenasi: LDHA, LDHB, LDHC e LDHD11. LDHA e LDHB sono pensati per risultare dalla duplicazione di un gene di iniziali LDHA12. LDH è attivo come un tetramero e LDHA e LDHB possono formare homotetramers ed eterotetrameri con a vicenda. LDHA è segnalato per avere maggiore affinità per piruvato, mentre LDHB è segnalato per avere maggiore affinità per lattato e preferenzialmente convertire lattato in piruvato13. Il promotore LDHA contiene siti di legame per fattori di trascrizione HIF1α, cMYC e FOXM111. Inoltre, come molti altri enzimi glicolitici14,15, LDH può essere modificato da modificazioni post-traduzionali. Ricevitore di fattore di crescita del fibroblasto 1 può fosforilare LDHA Y10, che promuove la formazione di tetramero, o Y83, che promuove il NADH substrato associazione16. LDHA può anche essere acetilata17. Per questi motivi, una comprensione completa delle attività LDH richiede un monitoraggio non solo i livelli di proteina LDH, ma l'attività dell'enzima pure.
Oltre al metodo che presentiamo qui, altri approcci sono stati utilizzati per monitorare l'attività della deidrogenasi del lattato. L'attività della deidrogenasi del lattato può essere monitorata spettrofotometricamente a lisato proteico omogeneizzato. La generazione del NADH come lattato viene convertito in piruvato può essere misurata basata su assorbanza a 340 nm, mentre la scomparsa del NADH può essere monitorata come piruvato viene convertito in lattato18. L'attività della deidrogenasi del lattato è stata monitorata anche con risonanza magnetica (MRI). 13 C-piruvato può essere somministrato e la conversione di piruvato a lattato possa essere monitorata come il rapporto di [1 -13C] lattato / [1 -13C] piruvato. Elevati coefficienti di [1 -13C] lattato / [1 -13C] piruvato sono stati osservati in cancro del tessuto19. Mentre gli approcci basati su MRI possono fornire informazioni sulle attività della deidrogenasi del lattato nel normale e tessuti malattia, le metodologie non hanno la risoluzione necessaria per determinare il livello di attività in celle specifiche. La metodologia fornita qui può fornire informazioni sull'attività della deidrogenasi del lattato in aree di tessuto e anche in singole cellule.
Usando in situ analisi di attività, abbiamo trovato che l'attività della deidrogenasi del lattato è ricco di cellule staminali del follicolo pilifero di mouse pelle20. Abbiamo anche usato il metodo per monitorare l'attività del lattato deidrogenasi in cellule staminali embrionali coltivate e l'attività è più alto nelle cellule staminali dello strato dell'alimentatore. Infine, abbiamo monitorato l'attività del lattato deidrogenasi nell'aorta del mouse fresco e osservato la macchiatura in cellule di muscolo liscio. Descriviamo qui un protocollo dettagliato per monitorare l'attività della deidrogenasi del lattato nella pelle del topo congelati.

<table><tbody><tr><td>Strumenti</td><td></td><td></td> chirurgici <td>Per la raccolta della pelle da topi soppressi</td></tr><tr><td>Cryomold Tissue-tek 25 mm x 20 mm x 5 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9511236</td><td>Per il congelamento della pelle di topo</td></tr><tr><td>Composto Tissue-Tek O.C.T. Fisher</td><td>Scientific</td><td>NC9638938</td><td>Per il montaggio di criostampi</td></tr><tr><td>Secchiello</td> per il ghiaccio <td>Fisher Scientific</td><td>07-210-106</td><td></td></tr><tr><td>Ghiaccio secco</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrino di adesione polisinica</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-78</td><td></td></tr><tr><td>formalina al 4%</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-245-684</td><td>diluito in acqua</td></tr><tr><td>soluzione salina tamponata con fosfato, pH 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-245-684</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7004</td><td></td></tr><tr><td>Fenazina metosolfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>Nitrotetrazolio cloruro blu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>Litio L-lattato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2250</td><td>Substrato</td></tr><tr><td>37&deg; Incubatore C (o incubatore per colture tissutali)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brasiliano! Contromacchia</td><td>Anatech</td><td>861</td><td>Contromacchia</td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-5000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprivetrini Fisher</td><td>Scientific</td><td>12-544D</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td><td></td> ottico</tr></tbody></table>

metabolismo di mappatura: monitoraggio dell'attività della deidrogenasi del lattato direttamente nel tessuto

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Mappatura attività enzimatica nello spazio e nel tempo è fondamentale per comprendere le basi molecolari del comportamento delle cellule nel tessuto normale e malattia. Le analisi in situ attività metabolica possono fornire informazioni sulla distribuzione spaziale delle attività metabolica all'interno di un tessuto. Forniamo qui un protocollo dettagliato per monitorare l'attività dell'enzima lattato deidrogenasi direttamente nei campioni di tessuto. Lattato deidrogenasi è un determinante importante di se consumato glucosio verrà convertito in energia mediante glicolisi aerobica o anaerobica. Una soluzione contenente lattato e NAD è fornita di una sezione di tessuto congelato. Cellule con attività alto lattato deidrogenasi converte il lattato fornito a piruvato, mentre convertendo simultaneamente fornito nicotinamide adenina dinucleotide (NAD) a NADH e un protone, che può essere rilevato sulla base della riduzione di nitrotetrazolium blu di formazan, che è visualizzato come un precipitato blu. Descriviamo un protocollo dettagliato per monitorare l'attività della deidrogenasi del lattato nella pelle del topo. Applicazione del presente protocollo, abbiamo trovato che l'attività della deidrogenasi del lattato è alta nelle cellule staminali del follicolo pilifero quiescente all'interno della pelle. Applicazione del protocollo di cellule staminali embrionali di topo coltivate ha rivelato la macchiatura più alto in cellule staminali embrionali coltivate di fibroblasti embrionali del mouse. Analisi dell'aorta del mouse appena isolato ha rivelato la macchiatura in cellule di muscolo liscio perpendicolare all'aorta. La metodologia fornita può essere utilizzata per mappare spazialmente l'attività degli enzimi che generano un protone nel tessuto fresco o congelato.

Precedentemente abbiamo segnalato risultati per analisi di attività in situ in mouse pelle20. Come mostrato nella Figura 3, abbiamo osservato che alti livelli di attività della deidrogenasi del lattato in cellule staminali del follicolo pilifero, alla base del follicolo di capelli quando le procedure descritte sopra sono stati seguiti. Questi risultati sono stati confermati da celle attivate la fluorescenza ordinamento della p...

Descriviamo un protocollo per mappare la distribuzione spaziale dell'attività enzimatica per enzimi che generano nicotinatmide adenina dinucleotide fosfato (NAD + H + direttamente nei campioni di tessuto.

Metabolismo di mappatura: Monitoraggio dell'attività della deidrogenasi del lattato direttamente nel tessuto

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia, come l'attività degli enzimi in diverse posizioni all'interno dei tessuti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente al ricercatore di rilevare l'attività enzimatica direttamente nei campioni di tessuto. Per iniziare questa procedura, rimuovere i peli del mouse con un tagliapeli di animali.Fai un'incisione sulla pelle della schiena usando le forbici. Quindi, solleva la pelle e tagliala via. Quindi, riempi il Cryomold con il composto reagente congelante.Utilizzando una pinza per aghi, posizionare le sezioni di pelle nel Cryomold del campo. Orientare le sezioni cutanee in modo che sia visibile la sezione trasversale della pelle dall'epidermide al derma, all'ipoderma e al muscolo. Se possibile, montare i topi sperimentali e di controllo insieme nello stesso Cryomould, in modo che possano essere sezionati sullo stesso vetrino e lavorati insieme.Fare attenzione a non creare bolle. Posiziona il Cryomold su una superficie piana di un blocco di ghiaccio secco in un secchiello per il ghiaccio. Per la conservazione, trasferisci il Cryomold in un congelatore a 80 gradi Celsius negativi.I campioni possono essere conservati in congelatore per circa tre mesi senza perdita significativa di attività enzimatica. Per il sezionamento, utilizzando un criostato impostato a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius, affettare il tessuto per creare sezioni spesse da sette a 10 micrometri per la migliore morfologia della pelle. In questa procedura, stabilire la serie di vetrini da testare, che include un vetrino di controllo su cui verrà trattenuto il NAD, un altro vetrino di controllo su cui verrà trattenuto il lattato del substrato e un vetrino di controllo positivo da un blocco di tessuto congelato precedentemente studiato.Fissare brevemente i vetrini contenenti le sezioni cutanee con il 4% di formalina per cinque minuti. Quindi, lavare i vetrini con PBS. Successivamente, agitare i reagenti, tra cui NADP, PMS, nitrotetrazolio cloruro blu e lattato insieme per la colorazione dell'attività della lattato deidrogenasi in una provetta di dimensioni adeguate.Successivamente, preparare una seconda soluzione in cui siano presenti tutti i reagenti tranne il NAD. Successivamente, preparare una terza soluzione in cui siano presenti tutti i reagenti tranne il lattato. Per incubare i vetrini e la soluzione colorante o le soluzioni di controllo, immergerli contemporaneamente nella soluzione.Quindi, incubarli in un ambiente umidificato a 37 gradi Celsius al buio. Monitorare la conversione della soluzione colorante da trasparente a blu. Quando i campioni hanno raggiunto il livello di blu desiderato, arrestare la reazione rimuovendo la soluzione colorante e risciacquandoli con PBS.Successivamente, una contromacchia sui vetrini quando i vetrini hanno raggiunto un livello appropriato di blu. Le contromacchie che trasformano il nucleare in rosso o verde forniranno un buon contrasto con il blu creato dal precipitante di Formosa. Quindi, montare le guide con un mezzo di montaggio acquoso o non acquoso.Da una a tre gocce di mezzo di montaggio sono sufficienti a seconda delle dimensioni del vetrino coprioggetto. Successivamente, visualizzare i vetrini al microscopio ottico. Scattare fotografie di campioni sperimentali e di controllo e di tutti i controlli negativi con ingrandimento 10X, 20X e 40X.L'intensità della colorazione aumenterà nel tempo man mano che la stessa viene incubata con la soluzione colorante. Come mostrato qui, sono stati osservati alti livelli di attività della lattato deidrogenasi nelle cellule staminali del follicolo pilifero alla base del follicolo pilifero. I campioni di controllo che non hanno ricevuto il substrato di lattato non hanno mostrato colorazioni.Questi risultati sono stati corroborati dallo smistamento cellulare fluorescente attivato della pelle per le cellule staminali del follicolo pilifero e dalla conferma dell'elevata attività della lattato deidrogenasi nel compartimento delle cellule staminali con attività sulle cellule selezionate. Sulla base dei risultati che le cellule staminali del follicolo pilifero hanno un'elevata attività della lattato deidrogenasi, sono state testate cellule staminali embrionali in coltura. I fibroblasti embrionali di topo che fungono da strato di alimentazione sono stati analizzati in presenza di cellule staminali embrionali o da soli.Un'elevata attività della lattato deidrogenasi è stata osservata nelle cellule staminali embrionali rispetto al fibroblasto embrionale di topo, come mostrato in diversi punti temporali. Il protocollo di colorazione è stato applicato anche al tessuto appena isolato. Le aorte di topo sono state sezionate.I campioni sono stati incubati con la soluzione salina bilanciata di Hank contenente lo 0,5% di Triton X per 10 minuti. Quindi, con la soluzione colorante di lattato deidrogenasi per 10 minuti. Le immagini qui mostrano la soluzione di lattato deidrogenasi con e senza lattato.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare fette di tessuto congelate con attività enzimatica intatta e i blocchi congelati non devono essere troppo vecchi. Se le sezioni preparate vengono conservate, le sezioni non devono essere lasciate asciugare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare l'attività della lattato deidrogenasi nella pelle del topo.

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