Tintura di FM in bicicletta alla sinapsi: confronto tra alto potassio depolarizzazione, elettrica e stimolazione Channelrhodopsin

L'obiettivo generale di questo esperimento è osservare il ciclo endoscopico ed esocitotico delle vescicole sinaptiche sulla preparazione dal vivo della giunzione neuromuscolare larvale di Drosophila utilizzando coloranti FM fluorescenti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, ad esempio quali geni sono fondamentali per la funzione del ciclo delle vescicole sinaptiche? Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile tracciare otticamente il ciclo delle vescicole in una preparazione dal vivo utilizzando tre diversi tipi di stimoli, un'elevata depolarizzazione del potassio, la stimolazione elettrica o utilizzando l'optogenetica.

A questa procedura, aggiungere l'anticorpo anti-HRP, coniugato a un lexoflor 647 alla soluzione salina dissecante. Successivamente, aggiungere un vetrino coprioggetti rivestito in elastomero alla camera di dissezione e quindi aggiungere la soluzione di dissezione con anticorpo HRP per marcare il terminale presinaptico NMJ durante la dissezione. Usando un pennello fine, trasferire un terzo stadio vagante dalla fiala di cibo su un vetro di copertura rivestito in elastomero.

Quindi riempire un puntale per micropipette di vetro con un piccolo volume di colla, utilizzando la pressione negativa dell'aria generata dalla bocca. Successivamente, posizionare le larve, con la parte dorsale rivolta verso l'alto, con una pinza e incollare la testa al vetrino coprioggetti rivestito in elastomero con una piccola goccia di colla utilizzando una pressione positiva dell'aria per bocca. Ripeti questa procedura con l'estremità posteriore delle larve, assicurandoti che l'animale sia teso tra i due attacchi di colla.

Usando le forbici, fai un taglio orizzontale di un millimetro nella parte posteriore e un taglio verticale lungo la linea mediana dorsale. Quindi rimuovere delicatamente la trachea dorsale, l'intestino, il corpo adiposo e altri organi interni, coprendo la muscolatura. Ripetere la procedura di incollaggio per i quattro lembi della parete del corpo, assicurandosi di allungare delicatamente il corpo sia orizzontalmente che verticalmente.

Successivamente, sollevare il VNC e tagliare con cura i nervi del motore con le forbici e rimuovere completamente il VNC. Sostituire la soluzione salina di dissezione con soluzione fisiologica priva di calcio per interrompere il ciclo SV. Per la stimolazione elettrica, preparare una pipetta di aspirazione utilizzando l'estrattore per microelettrodi per ottenere la conicità e la dimensione del puntale richieste.

Successivamente, lucidare a fuoco la punta del microelettrodo con una micro forgia per creare una perfetta aderenza quando si aspira un singolo nervo motore. Far scorrere la pipetta di aspirazione sul portaelettrodo di un micromanipolatore, che è collegato a un tubo di plastica lungo e flessibile e a una siringa. Quindi, mettere il preparato con il colorante FM sul tavolino del microscopio e sollevare il tavolino fino a quando le larve e la pipetta di aspirazione non sono a fuoco.

Quindi aspirare un anello del nervo motore tagliato, innervando il segmento emi selezionato con una pressione dell'aria negativa, generata dalla siringa nell'elettrodo di aspirazione. Successivamente, stimolare il nervo motore utilizzando i parametri selezionati per guidare l'endocitosi SV e l'assorbimento del colorante FM 143. Il passaggio più critico a questo punto della procedura consiste nell'aspirare un singolo assone del motore nell'elettrodo di aspirazione con una perfetta aderenza.

Questo potrebbe richiedere alcuni tentativi ed errori. Una volta trovato un elettrodo di aspirazione adeguato, utilizzare lo stesso per tutte le condizioni confrontate per garantire uno sforzo di stimolazione costante. Per lo scarico del colorante FM, aspirare lo stesso nervo motore nello stesso elettrodo e quindi stimolare il nervo motore ad attivare l'esocitosi SV e il rilascio di colorante FM 143.

Per la stimolazione con canalrodopsina, collegare un LED blu a uno stimolatore programmabile utilizzando un cavo coassiale e posizionare il LED nella porta della fotocamera. Focalizzare il fascio di luce LED blu sulla preparazione con colorante FM utilizzando la funzione di zoom del microscopio. Il passaggio più critico a questo punto della procedura è assicurarsi che le impostazioni dei LED siano mantenute costanti e che si illumini la stessa parte di ciascun animale per tutte le condizioni confrontate per garantire uno sforzo di stimolazione costante.

Avviare la stimolazione luminosa e seguire con il timer per la durata predeterminata del periodo di stimolazione optogenetica. Quando il timer si ferma, rimuovere rapidamente la soluzione colorante FM e sostituirla con soluzione salina priva di calcio per arrestare il ciclo SV. Di scarico del colorante FM, avviare la stimolazione luminosa e tracciare con un timer per la durata predeterminata del periodo di stimolazione optogenetica.

Al termine del periodo del timer, rimuovere rapidamente la soluzione colorante FM e posizionarla con soluzione salina priva di calcio per interrompere il ciclo SV. Per quantificare l'immagine fluorescente, caricarla nell'immagine J e creare una proiezione di massima intensità facendo clic su Immagine, Pile, Zprogetto, quindi utilizzando il canale anti-HRP 647, andare su Immagine, Regola, Soglia e far scorrere la barra degli strumenti in alto fino a evidenziare solo l'NMJ. Utilizzando lo strumento bacchetta, fare clic su NMJ.

Se l'NMJ è discontinuo, tenere premuto il pulsante shift e selezionare tutte le parti. Quindi cambia l'immagine sul canale del colorante FM 143 e vai su Analizza, Misura, per ottenere la misurazione della fluorescenza. Ripetere questi passaggi per l'immagine non caricata dallo stesso NMJ.

La fluorescenza FM 143 può essere fotoconvertita in un precipitato denso di elettroni DAB ossidato per la visualizzazione tramite TEM. Ecco un diagramma schematico del metodo di fotoconversione per etichettare la drosophila NMJ dopo il carico di colorante FM 143 dipendente dall'attività. Questa è un'immagine TEM rappresentativa di un bouton sinaptico wild type a riposo, che mostra una densa popolazione di SV di dimensioni uniformi.

Queste immagini mostrano i bottoni sinaptici che sono stati stimolati con un'elevata depolarizzazione salina di potassio per cinque minuti senza fotoconversione o con fotoconversione FM 143. Qui si possono osservare le strutture omo di massa. E queste immagini mostrano i bottoni sinaptici che sono stati stimolati elettricamente con l'elettrodo di aspirazione nervosa a 20 hertz per cinque minuti senza fotoconversione o con fotoconversione FM 143.

Si noti che le vescicole caricate con colorante appaiono molto più scure delle vescicole adiacenti non caricate. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire una dissezione con colla larvale, nonché il carico e lo scarico del colorante FM utilizzando un'elevata depolarizzazione del potassio, la stimolazione elettrica e la stimolazione optogenetica della canalrodopsina. Da quando i coloranti FM sono stati sintetizzati per la prima volta da Fei-Mao, questi coloranti versatili sono stati utilizzati per studiare la mobilizzazione dipendente dall'attività di pool di vescicole distinte per studiare la differenza tra l'endocitosi mediata dalla clatrina, nonché per studiare le attività sinaptiche evocate, spontanee e in miniatura.

Ci sono molti fattori da considerare durante questo esperimento. Per citarne alcuni, la concentrazione esterna di calcio, il tipo di metodo di stimolazione utilizzato, nonché il tempo di caricamento e scarico del colorante FM durante le fasi di assorbimento e rilascio. Si prega di prendere in attenta considerazione questi fattori quando si pianifica il proprio esperimento.

Buona Fortuna!