Valutazione della funzione respiratoria in topi cosciente da doppia camera pletismografia
10 luglio 2018
L'obiettivo del presente articolo è quello di fornire una descrizione dettagliata delle procedure consigliate per valutare la funzione respiratoria in topi cosciente da pletismografia a doppia camera.
Questa tecnica aiuterà ad affrontare questioni chiave in vari campi, tra cui la ricerca respiratoria, la farmacologia della sicurezza e lo sviluppo di farmaci. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce letture affidabili per valutare la funzione respiratoria in animali coscienti sia al basale che durante le sfide. La tecnica è particolarmente utile quando il protocollo sperimentale richiede una piccola deviazione dal normale stato fisiologico degli animali.
L'animale è trattenuto, ma per il resto respira normalmente, il che consente di valutare il modello di respirazione oltre all'ostruzione delle vie aeree. Il giorno dell'esperimento, avviare una sessione sperimentale e caricare il file di configurazione appropriato. Inserisci l'esperimento e le informazioni sull'animale.
Una volta terminato, fai clic sul pulsante Esegui nella parte inferiore della finestra. Procedere con la calibrazione del sistema. Calibrare separatamente ogni sito e il segnale di ingresso.
Accendere il generatore di flusso di polarizzazione collegato alla camera di testa tramite un pezzo di tubo e regolare la portata. Chiudere l'apertura superiore della camera di testa con un tappo. Staccare il pannello posteriore della camera toracica.
Quindi inserire saldamente lo strumento di calibrazione all'interno dell'apertura in gomma tra la testa e la camera del corpo per creare una tenuta ermetica. Chiudere e riattaccare il pannello posteriore della camera toracica. Dal menu della barra degli strumenti del software, vai su Sintonizzazione e poi su Calibra.
Vai su Input one e seleziona calibra per avviare la finestra di dialogo di calibrazione per il segnale del flusso toracico. Verificare che i parametri elencati nella finestra di dialogo di calibrazione mostrino le impostazioni appropriate. Il valore basso della sollecitazione fisica applicata dovrebbe essere zero.
Il valore elevato dello stress fisico applicato dovrebbe essere inferiore a 20 millilitri al secondo e i campioni dovrebbero essere impostati per integrarsi. Una volta terminato, fai clic su basso nella finestra degli esempi. Verificare che il segnale generato sia costante in tutta la finestra del display e quindi fare clic su chiudi.
Collegare una siringa da 20 millilitri attraverso la porta laterale della camera toracica utilizzando un connettore di plastica in un pezzo di tubo. Selezionare in alto nella finestra dei campioni e iniettare immediatamente 20 millilitri di aria nella camera in un periodo di due secondi a una velocità di flusso il più costante possibile. Verificare che il segnale generato appaia completamente all'interno della finestra del display.
Utilizzare l'icona della freccia per verificare se il segnale è centrato e simmetrico attorno alla linea dello zero. Quindi fare clic su Chiudi. Rimuovi qualsiasi offset da zero facendo clic su Rimuovi offset AC nella finestra dei campioni.
Calibrare la camera della testa in modo simile alla camera toracica selezionando l'ingresso numero due. Questa volta, impostare il valore alto su più 20 millilitri al secondo invece di meno 20. Lavora in una zona tranquilla lontana dalla stanza dell'alloggio.
Acclimatare gli animali al sistema di contenzione e alle procedure prima dell'inizio dell'esperimento. Poiché non è invasivo e non richiede anestesia, lavorare in condizioni in cui l'animale è a suo agio, ben adattato e calmo limiterà la propensione alle perdite di pelo tra le camere e quindi massimizzerà la qualità dei dati. Pesa gli animali.
Selezionare il sistema di ritenuta appropriato per l'animale. Inserire l'animale all'interno del sistema di ritenuta procedendo dall'apertura posteriore. Tenere il dispositivo in verticale può essere utile.
Una volta che l'animale è in posizione, inserire lo stantuffo posteriore e bloccarlo delicatamente in posizione senza applicare una forza eccessiva. Controllare visivamente che l'animale respiri normalmente. Se necessario, regolarne la posizione spostando il meccanismo di bloccaggio.
Assicurati che le narici dell'animale sporgano all'esterno del cono del naso con il muso appoggiato contro le pareti interne del sistema di contenzione. Staccare il pannello posteriore della camera toracica. Inserire il sistema di ritenuta contenente l'animale attraverso l'apertura in gomma nella camera toracica e chiudere la camera.
Attacca la camera della testa, fornisci un flusso di polarizzazione e lascia che l'animale si rilassi per almeno cinque minuti. Una volta che l'animale è calmo, avvia il protocollo dei comandi selezionando il primo passaggio e poi clicca su Esegui. Controlla sullo schermo del computer che i segnali respiratori dell'animale siano regolari e regolari.
Il software visualizza automaticamente i parametri calcolati respiro per respiro. Verificare che i parametri dell'animale siano stabili. Registrare il modello di respirazione in condizioni di base per un massimo di 10 minuti.
Per i protocolli che prevedono la somministrazione di una sostanza in esame tramite aerosol, regolare innanzitutto il nebulizzatore in tempo e nel ciclo di lavoro secondo necessità. Esegui una sfida con il veicolo e registra la risposta. Se necessario, esporre l'animale a concentrazioni crescenti della sostanza in esame modificando la concentrazione nel nebulizzatore e aumentando le fasi.
Registrare la risposta dopo ogni somministrazione. In questo esempio vengono testati 15 milligrammi per millilitro di metacolina. L'aumento di picco della resistenza specifica delle vie aeree viene registrato un momento successivo e quindi si vede tornare lentamente al valore basale.
Al termine della sessione sperimentale, riportare l'animale nella sua stanza e nella gabbia di alloggiamento. Tra una sessione e l'altra, pulire le camere del pletismografo e sciacquare il nebulizzatore con acqua. Procedere all'analisi dei dati come descritto nel protocollo di testo.
Di seguito è mostrato l'esito di una valutazione ripetuta della funzione respiratoria al basale per tre giorni consecutivi in due gruppi di topi BALB/c. Uno di controllo e uno con infiammazione allergica polmonare. Valori stabili e comparabili sono stati ottenuti per una selezione di parametri forniti dalla pletismografia a doppia camera.
Questi valori sono stati tracciati per la frequenza respiratoria, il volume del titolo, la ventilazione al minuto, la pausa di fine inspirazione, il flusso a metà del volume espiratorio del titolo e la resistenza specifica delle vie aeree. Cambiamenti nella funzione respiratoria e nella risposta all'aumento delle dosi di metacolina per via inalatoria sono stati eseguiti anche in giorni successivi per valutare il grado di responsività nei topi di controllo e allergici C57BL/6. I risultati mostrano l'atteso aumento progressivo della resistenza specifica delle vie aeree con l'aumento delle dosi di metacolina con un grado esagerato di reattività nei topi allergici il secondo e il terzo giorno.
Il giorno seguente la resistenza newtoniana è stata misurata con la tecnica dell'oscillazione forzata. Le variazioni di questo parametro riflettono principalmente le variazioni nella resistenza delle grandi vie aeree conduttrici. La resistenza newtoniana misurata al basale e in risposta alla metacolina era ben correlata con la resistenza specifica delle vie aeree misurata ottenuta il giorno precedente negli stessi animali.
Questa tecnica è utile per valutare numerosi animali contemporaneamente, per catturare la cinetica di una risposta acuta, nonché per misurare la funzione respiratoria in modo ripetuto durante un esperimento durato diversi giorni. Dopo la procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la tecnica dell'associazione forzata, al fine di integrare la valutazione con misurazioni dirette della meccanica respiratoria, come la resistenza delle vie aeree. La pletismografia a doppia camera fornisce davvero un approccio interessante per valutare il modello di respirazione e la geografia dell'ostruzione delle vie aeree, specialmente quando il protocollo sperimentale richiedeva che gli animali fossero coscienti.
Panoramica
Questo articolo descrive le procedure per valutare la funzione respiratoria in topi consci utilizzando la pletismografia a doppia camera. Questa tecnica è cruciale per la ricerca respiratoria e lo sviluppo di farmaci.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Ricerca respiratoria
- Farmacologia di sicurezza
- Sviluppo di farmaci
Conoscenze di base
- La pletismografia a doppia camera permette la valutazione della funzione respiratoria senza anestesia.
- La tecnica mantiene lo stato fisiologico normale dell'animale.
- Fornisce dati affidabili sui modelli di respirazione e l'ostruzione delle vie aeree.
- L'acclimatazione degli animali è essenziale per la qualità dei dati.
Obiettivo dello studio
- Fornire un protocollo dettagliato per la valutazione della funzione respiratoria nei topi.
- Migliorare la comprensione delle risposte respiratorie in varie condizioni.
- Facilitare i test sui farmaci e le valutazioni di sicurezza.
Metodi utilizzati
- Calibrazione del sistema di pletismografia.
- Restrizione degli animali in modo confortevole.
- Registrazione dei modelli di respirazione di base.
- Somministrazione di sostanze di prova tramite aerosol.
Risultati principali
- Sono stati registrati parametri respiratori stabili per giorni consecutivi.
- Le risposte alla metacolina sono state valutate nei topi di controllo e allergici.
- È stata osservata un'aumentata resistenza delle vie aeree con dosi crescenti di metacolina.
- I dati hanno mostrato differenze significative nella reattività tra i gruppi.
Conclusioni
- La pletismografia a doppia camera è efficace per la valutazione della funzione respiratoria.
- Il metodo fornisce dati affidabili sia per gli stati di base che per gli stati sfidanti.
- È adatto per valutare gli effetti dei farmaci nella ricerca respiratoria.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Assessing respiratory function in conscious animals is critical for preclinical safety pharmacology and respiratory drug development, where maintaining physiological relevance improves translational confidence. Double-chamber plethysmography enables non-invasive, repeated measurements of breathing patterns and airway resistance in unrestrained, spontaneously breathing mice, supporting mechanistic de-risking of inhaled therapeutics. The technique provides quantitative, reproducible readouts that align with early discovery to lead optimization workflows by delivering reliable baseline and challenge-response data without anesthetic confounders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to airway reactivity and bronchoconstriction pathways in disease models.
- Operational Value: Supports functional target validation by measuring physiological outputs in conscious animals under baseline and challenged conditions.
- Predictive Value: Provides respiratory function readouts that help de-risk target engagement and mechanism of action in early-stage programs.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Delivers standardized, quantitative parameters such as specific airway resistance, tidal volume, and minute ventilation for compound screening.
- Reproducibility: Enables parallel monitoring of multiple animals and repeated assessments over days, improving assay robustness.
- Scalability: Compatible with aerosolized substance administration, supporting dose-response profiling in safety pharmacology.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Demonstrated utility in allergic inflammation models, enabling evaluation of genotype-phenotype correlations in respiratory disease.
- Translational Continuity: Connects discovery-phase respiratory phenotypes to preclinical validation through consistent, anesthesia-free measurements.
- Risk-Adjusted Decisions: Facilitates go/no-go assessments by quantifying responsiveness to bronchoconstrictive agents like methacholine across experimental groups.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for respiratory and inhaled therapeutic programs requiring functional respiratory endpoints.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of airway obstruction mechanisms and pathway modulation in genetic or disease models.
- Screening: Enables assay standardization and reproducible quantification of respiratory parameters for compound effect assessment.
- Analytics: Provides breathe-by-breathe calculated parameters including specific airway resistance and flow metrics for comparative condition analysis.
- Translational Research: Maintains physiological continuity from in vivo discovery to preclinical studies by avoiding anesthetic artifacts.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for longitudinal respiratory monitoring across multiple studies and compound series.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by delivering physiologically relevant respiratory data in conscious, unrestrained animals.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and minimal procedural bias through acclimatization and bias flow control.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by reducing false positives from anesthetic or stress-induced respiratory artifacts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of respiratory compounds based on validated, repeatable airway resistance measurements.
Implementation Considerations
- Requires expertise in animal handling, restrainer use, and plethysmograph system operation.
- Depends on calibrated instrumentation, bias flow generators, and nebulizer systems for aerosol delivery.
- Necessitates cross-team standardization of acclimatization protocols and environmental controls to minimize data variability.
- Involves adaptation considerations across mouse strains and disease models, as demonstrated in BALB/c and C57BL/6 backgrounds.
- Limited by potential hair leaks and chamber seal integrity, which can be mitigated through proper animal acclimatization and quiet experimental conditions.
