Definizione attività di Chaperone Redox-regolati di Hsp33 e mappatura cambiamenti conformazionali su Hsp33 usando la spettrometria totale di scambio di idrogeno-deuterio

Il flusso di lavoro qui presentato può aiutare ad ampliare la nostra comprensione del ruolo cellulare degli chaperoni durante le condizioni di stress ossidativo. In particolare, può aiutare a capire come gli chaperoni prevengono l'aggregazione proteica durante le condizioni di unfolding. Per questi due dorsi di tecniche diverse forniscono informazioni sull'attività degli accompagnatori segregati a bandiera.

Può anche essere utilizzato per studiare altre proteine per l'interazione, come le interazioni sociali enzimatiche e la dinamica delle proteine. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto comporta l'uso di diversi strumenti che possono essere difficili per i nuovi utenti. Innanzitutto, centrifuga un campione di proteine precedentemente scongelato per rimuovere gli aggregati.

Quindi aggiungere cinque millimolari di DTT e 20 micromolari di cloruro di zinco e incubare il campione per almeno 1,5 ore a 37 gradi Celsius. Per rimuovere il DTT, equilibrare una colonna di desalinizzazione con un tampone di fosfato di potassio a 40 millimolari, riempiendo completamente la colonna con il tampone e lasciandolo sgocciolare. Usando una pinzetta, spingere delicatamente verso il basso il filtro a disco bianco nella colonna e rimuoverlo.

Riempire la colonna con tampone fosfato di potassio e centrifugare a 1000 volte G per tre minuti. Dopo la centrifugazione, trasferire la colonna in una provetta pulita e aggiungere lentamente il campione di proteine al centro della colonna. Centrifugare la colonna a 1000 volte G per due minuti in modo che la proteina priva di DTT sia nel flusso.

Ora controlla la concentrazione della proteina e misura la sua assorbanza a 280 nanometri. Distribuire metà dei campioni proteici in aliquote. Incubare le aliquote in condizioni anaerobiche per 20 minuti per la completa rimozione dell'ossigeno.

Quindi sigillare le provette con pellicola di plastica e conservare i campioni in condizioni di freddo. Quindi, aggiungi il perossido di idrogeno da cinque millimolari appena preparato al campione proteico rimanente e incuba per tre ore a 40 gradi Celsius agitando. Dopo la centrifugazione, controllare la concentrazione proteica, quindi dividere le proteine ossidate in aliquote e conservarle al freddo.

Preparare il substrato denaturato incubando 12 micromolari di citrato sintasi per una notte in 40 millimolari di HEPES e 4,5 molari di guanidinio cloruro. Il giorno seguente, apri il software del fluorospettrometro e vai alla misurazione dell'andamento temporale. Impostare la larghezza di banda di eccitazione su 2,5 nanometri.

La lunghezza d'onda di eccitazione a 360 nanometri. La lunghezza d'onda di emissione a 360 nanometri. La larghezza di banda di emissione a cinque nanometri.

E l'intervallo dei dati a 0,5 secondi. Impostare la temperatura a 25 gradi Celsius. Preparare il campione aggiungendo 1600 microlitri di HEPES da 40 millimolari a una cuvetta di quarzo.

Inserire la cuvetta nel portacampioni di un fluorospettrometro in modo che il campione raggiunga la temperatura desiderata. Dopo aver impostato l'agitazione a 600 giri/min, iniziare la misurazione fino a stabilire la linea di base. Per misurare l'aggregazione della citrato sintasi in assenza di un chaperone, aggiungere 10 microlitri di citrato sintetasi denaturata, a 120 secondi dall'inizio della misurazione.

Quindi continuare la misurazione per 1200 secondi. Per misurare l'aggregazione della citrato sintasi in presenza di Hsp33, aggiungere Hsp33 60 secondi nella misurazione. Dopo altri 60 secondi aggiungere 10 microlitri di citrato sintetasi denaturato e continuare la misurazione per 1200 secondi.

Successivamente, caricare il file di dati per eseguire l'analisi dei dati e la rimozione del rumore da parte di Kfits. Per rimuovere qualsiasi rumore, scegliere i parametri di analisi, utilizzare il modello migliore automatico e selezionare il rumore è sempre al di sopra del segnale. Rimuovi manualmente i valori anomali evidenti utilizzando le linee regolabili verdi e rosse che filtreranno i rumori sopra la linea verde e sotto la linea rossa.

Successivamente, impostare la linea di base e la curva di adattamento. Dopo aver applicato la soglia di rumore, scaricare i dati elaborati. Preparare campioni di substrato proteico complesso aggiungendo citrato sintetasi a Hsp33 in un rapporto da 1 a 1,5 a 43 gradi Celsius.

Utilizzare almeno quattro passaggi e incubare i campioni per 15 minuti a 43 gradi Celsius dopo ogni aggiunta per consentire la formazione di complessi. Centrifugare i campioni a 16000 volte G a quattro gradi Celsius per 30 minuti per rimuovere eventuali aggregati. Quindi posizionare i campioni in inserti di vetro da 150 microlitri e trasferirli in fiale.

Quindi posizionarli nelle apposite teglie. Tenere i tamponi H e D a 25 gradi Celsius e mantenere i campioni e il tampone di tempra a zero o due gradi Celsius. Quindi, accendere manualmente tutte le unità di raffreddamento dello spettrometro di massa.

Una volta che tutti i sistemi di raffreddamento raggiungono le temperature target, accendere manualmente sia l'HPLC che le pompe di carico. Aprire il software che controlla entrambe le pompe e il software che controlla lo spettrometro di massa e assicurarsi che l'MS sia in standby. Successivamente, scollegare la valvola di uscita HPLC dalla sorgente MS.

Lavare prima il sistema con una soluzione detergente tripla. Poi con il tampone B e infine con il tampone A.Quindi inserire la colonna di pepsina nel sistema. Dopo aver lavato il sistema con un flusso costante e una pressione costante, inserire la valvola di uscita HPLC nella sorgente MS e accendere la MS.

Ora apri il software. Crea una sequenza in esecuzione e inserisci tutti i punti temporali, i nomi dei campioni e le posizioni nei vassoi, nonché i nomi e le posizioni dei buffer. Al termine dell'esecuzione, analizzare la copertura peptidica del campione eseguendo i campioni di controllo non deuterati attraverso il software.

Trasferisci i dati nel software HDX Workbench e analizza i risultati utilizzando il software. Salvare i peptidi selezionati e continuare ulteriormente per l'analisi dell'assorbimento del deuterio. La denaturazione chimica porta ad una rapida aggregazione della citrato sintetasi indotta dal ripiegamento di una proteina completamente denatizzata in condizioni tampone sfavorevoli.

D'altra parte, l'aggregazione indotta termicamente deriva da un dispiegamento relativamente lento del substrato nativamente piegato. In entrambe le forme di denaturazione, l'aggiunta di Hsp33 ossidato ha completamente abolito l'aggregazione, abbassando le letture a 360 nanometri a valori trascurabili. La presenza di una ridotta Hsp33 non ha avuto alcun effetto sulla stabilità della citrato sintetasi e ha dato una curva di aggregazione simile a quella rilevata in assenza di un chaperone.

Il pattern di deuterazione tra il chaperone legato e non legato Hsp33 al suo substrato citrato sintetasi rivela un sito di interazione con il client all'interno del dominio di commutazione redox C-terminale del chaperone. L'Hsp33 ridotto ha una struttura completamente ordinata ma diventa funzionale quando avverte uno stress ossidativo. Mentre l'Hsp33 legato e non legato produce curve peptidiche simili, l'Hsp33 ossidato mostra una differenza di deuterazione del 30% tra il chaperone legato e quello non legato, con aree specifiche della proteina legata che indicano un ostacolo allosterico.

Una volta stabilito, il saggio di scattering può essere completato in poche ore, mentre la metodologia DHEX può essere completata in due-quattro giorni se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura è importante pianificare in anticipo. Ricorda che le condizioni descritte, come la temperatura, i tempi di incubazione e le soluzioni tampone, sono specifiche per ogni proteina e devono essere ottimizzate per ogni proteina.

Seguendo questa procedura, possono essere eseguite altre metodologie come il cross-linking o la precipitazione al fine di integrare gli studi sulle interazioni tra i substrati chaperone. In conclusione, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della biologia strutturale per esplorare la plasticità delle proteine negli chaperoni molecolari.