In Situ Microscopia per la determinazione in tempo reale della morfologia a singola cellula nei bioprocessi

Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave sull'eterogeneità della popolazione attraverso la valutazione morfologica delle cellule. La microscopia in situ consente di studiare le condizioni di coltivazione, le rese di processo e la qualità del prodotto. Il principale vantaggio di questa tecnica è una misurazione in situ, che fornisce dati in tempo reale senza campionamento o portando rischio di contaminazione.

La microscopia in situ abbinata al riconoscimento automatico delle immagini può fornire ulteriori informazioni sulle strutture cellulari, la forma e l'agglomerazione cellulare oltre le dimensioni. È anche possibile misurare le concentrazioni cellulari. Il metodo si è dimostrato uno strumento affidabile.

Nessun metodo alternativo fornisce le stesse informazioni in così poco tempo e basso sforzo per la preparazione del campione. Il metodo è stato adattato a vari bioprocessi e microrganismi, funghi filamentosi SEG, micro-allergia e lievito. La sonda viene utilizzata in combinazione con un computer.

L'hardware è costituito da una singola sonda ad asta con una telecamera CCD ad alta risoluzione. Le celle che passano attraverso uno spazio di misurazione regolabile vengono immagini dalla fotocamera. La luce entra nello spazio di fronte alla fotocamera, il che significa che l'illuminazione è tramite trasmissione.

Impostare i parametri hardware utilizzando concentrazioni di celle che si estendono sull'intervallo previsto. Inizia a preparare le misurazioni offline. Utilizzare uno spessore per regolare lo spazio di misura.

Quindi ruotare il dado della vite della sonda per impostare lo spazio di misurazione su cinque o 10 volte il diametro massimo previsto della cella. Al computer aprire il software del controller della sonda. Nel software, selezionare la sonda desiderata e passare alle azioni di sezione.

Quindi premere Connetti. Passare quindi alla scheda Controllo probe e aprirla. Avvia lo streaming video premendo il pulsante riproduci.

Fissare la sonda a un treppiede ed eseguire i seguenti passaggi per ogni misurazione. Lavorare con la sonda e spruzzare etanolo nello spazio di misurazione. Pulire con cura la polvere o lo sporco con carta ottica.

Al computer, utilizzare la vista dal vivo per verificare che il vetro del sensore sia privo di particelle. Quindi, posizionare una carta ottica asciutta nello spazio di misurazione per la messa a fuoco. Ruotare la vite di attacco per spostare manualmente la messa a fuoco.

Interrompere la messa a fuoco quando le singole fibre della carta nello spazio di misurazione sono chiaramente visibili. Ora, prendi un tubo pieno di brodo di cultura. Immergere il microscopio nel brodo, in modo che lo spazio sia completamente coperto da sospensione cellulare.

Utilizzare le viti di attacco per ottimizzare la messa a fuoco sulle celle. Una volta terminata questa messa a fuoco, non cambiarla di nuovo durante l'esperimento. Tornare al software per l'esperimento.

Passare al menu Attivazione. Nel menu Attivazione impostare la frequenza fotogrammi. Un hertz è consigliato per le misurazioni offline.

Da lì, vai al campo Fotogrammi per trigger e impostalo se necessario per buone statistiche. Qui, circa 200. Inoltre, vai al menu Generale.

Lì, seleziona la directory in cui verranno salvate le immagini. Inizia l'acquisizione dell'immagine con il pulsante Avvia acquisizione trigger immagine. Spostare delicatamente il tubo per indurre il flusso nello spazio di misurazione.

Utilizzare le immagini della prima esecuzione dell'esperimento come set di training. Fai preparare il software open source Fiji e rilascia le immagini dall'esperimento nella sua finestra. Al termine, selezionare Analizza, seguito da Strumenti, quindi ROI Manager.

Scegliere quindi uno strumento di selezione. Nell'immagine, decidi su una particella per annotare che è a fuoco. Disegna un cerchio intorno ad esso con lo strumento di selezione.

Premere Aggiungi per aggiungere l'annotazione a Gestione ROI. Selezionare quindi uno strumento pennello e scegliere una dimensione in pixel appropriata. Utilizzare lo strumento pennello per perfezionare la selezione.

Continua a contrassegnare tutti gli oggetti di interesse allo stesso modo su circa 15 immagini. Salvare i file annotati e utilizzarli come set di training. Quando l'algoritmo di riconoscimento viene sottoposto a training e pronto, utilizzarlo per visualizzare i risultati.

In Analizzatore risultati passare a File, seguito da Importa file. Lì, selezionare il file dei risultati desiderato. Continuare premendo il pulsante Crea grafico.

Selezionare Grafico distribuzione. Questo mostrerà la distribuzione morfologica della cultura. Tornate a Crea grafico (Create Chart) per selezionare Tracciato sensibilità (Sensitivity Plot).

Le informazioni visualizzate possono aiutare a determinare quante celle devono essere analizzate per ottenere l'accuratezza desiderata. Eseguire misurazioni online dopo aver completato le misurazioni offline. Per le misurazioni online, collegare la sonda direttamente a un bioreattore.

Una volta collegato, sterilizzare correttamente l'assemblaggio. Selezionare Monitoraggio nel dashboard. C'è un pulsante di riproduzione per avviare l'acquisizione dell'immagine e un pulsante di arresto per terminarla.

Premere il pulsante di riproduzione. Al bioreattore, inizia l'inoculazione della cultura. La fotocamera acquisirà il video delle celle e le identificherà automaticamente per l'analisi.

Il monitoraggio fornisce dati online di dimensioni cellulari e forme di diverse morfologie cellulari durante l'intera fermentazione. I risultati in tempo reale possono essere formattati in vari modi e anche esportati per ulteriori analisi. Questo grafico delle distribuzioni cumulative del diametro della cella di S.Cerevisiae viene creato dai dati analizzati utilizzando questa tecnica.

Dimostra che il riconoscimento automatico delle celle è in grado di distinguere le cellule in erba e non in erba. La curva solida è la distribuzione durante una coltivazione a tre ore. La curva punteggiata è la distribuzione della stessa coltivazione a sette ore.

La curva tratteggiata rappresenta i dati raccolti a 13 ore. La procedura di annotazione richiede molto tempo, ma è la chiave per ottenere l'accuratezza desiderata per l'identificazione delle celle. Con questa procedura, se i tempi di misurazione sono più brevi della dinamica di processo, la misurazione in tempo reale può essere utilizzata per il controllo del processo.

Questa tecnica apre la strada all'utilizzo della misurazione dell'eterogeneità della popolazione come parametro di processo per le coltivazioni microbiche dalle prime fasi di sviluppo del processo alla scala di produzione.