In Situ Misurazione e la correlazione di densità delle cellule ed emissione di luce di batteri bioluminescenti

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della bioluminescenza. Ad esempio, trovare le condizioni di crescita ottimali per la massima intensità luminosa dei batteri bioluminescenti e determinare il meccanismo di regolazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è la facilità di configurazione, che può essere utilizzata per vari ceppi e organismi, nonché le possibilità di regolazione semplici e veloci.

Seguire questo metodo può fornire informazioni sulle caratteristiche dell'operone lux. Può essere applicato anche ad altri sistemi, come sistemi batterici, ambientali, di reportistica o sensori. Per iniziare, preparare una coltura notturna inoculando 100 millilitri di terreno LB con kanamicina, con cellule di E.coli BL21 trasformate in operone lux da stock di glicerolo o direttamente da una piastra di trasformazione.

Incubare la coltura a 37 gradi Celsius e 120 giri/min durante la notte. Il giorno seguente, inoculare 800 millilitri di terreno di kanamicina LB con 8 millilitri di coltura notturna. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius e 120 giri/min in un agitatore incubatore, fino a quando la densità cellulare raggiunge un OD600 compreso tra 0,6 e 0,8.

Ridurre la temperatura di incubazione a 28 gradi Celsius e indurre l'espressione proteica aggiungendo 0,1 millimolari di IPTG. Quindi osserva le cellule finché non iniziano a brillare. Dopo aver preparato i terreni secondo il protocollo di testo, striare i ceppi batterici bioluminescenti su piastre di agar medie artificiali con acqua di mare e incubarli a 24-30 gradi Celsius durante la notte.

Preparare una coltura notturna inoculando 100 millilitri di terreno di acqua di mare artificiale con una singola colonia dalla piastra. Quindi incubare la coltura a 24-30 gradi Celsius e 120 giri/min durante la notte. Il giorno seguente, inoculare 800 millilitri di terreno di acqua di mare artificiale con 8 millilitri di coltura notturna.

Incubare le cellule batteriche a 24-30 gradi Celsius e 120 giri/min e osservare le cellule fino a quando non iniziano a brillare. Strisciare il ceppo batterico bioluminescente desiderato, o il ceppo di E.coli modificato, su una piastra di agar, e incubare la coltura a 28 gradi Celsius durante la notte. Inoculare 3 millilitri di terreno con una singola colonia dalla piastra notturna e incubare le cellule a 28 gradi Celsius e 180 giri/min per circa una o due ore.

Misurare la densità cellulare di una diluizione da uno a dieci della coltura liquida a 650 nanometri. Quindi calcolare il rapporto e il volume per un millilitro di coltura con un OD650 di 0,05. Pipettare il volume calcolato di coltura e terreno in una piastra a 24 pozzetti con pareti nere e fondo di vetro.

Per garantire che il vettore pET28a contenente l'intero operone lux non vada perduto e che sia espresso nel ceppo di E.coli modificato, aggiungere un microlitro di kanamicina e un microlitro di IPTG ai campioni. Quindi posizionare un coperchio sulla piastra, per evitare l'evaporazione durante le misurazioni. Infine, utilizza un lettore di piastre impostato su 28 gradi Celsius e uno script trovato nel protocollo di testo, per effettuare misurazioni di assorbanza e bioluminescenza ogni 10 minuti, con agitazione tra i punti dati.

Questa figura confronta le misurazioni OD650 delle cellule BL21 di E.coli, delle cellule BL21 contenenti un vettore pET28a vuoto e delle cellule BL21 contenenti un vettore pET28a con l'inserto dell'operone lux-rib, ma senza induzione. Tutte e tre le misure di riferimento per l'emissione di luce mostrano una curva di crescita sigmoidale con fasi di crescita lag, esponenziale e stazionaria, ma nessuna emissione di luce, ad eccezione di quest'ultimo campione, che mostra un'emissione di luce dopo 300 minuti, a causa della perdita del promotore T7. Qui, le curve di crescita e le intensità della luce dell'operone lux espresso in E.coli e il ceppo batterico bioluminescente, photobacterium mandapamensis 27561, sono stati confrontati a 28 gradi Celsius in LB, o mezzo di acqua di mare artificiale.

Il ceppo modificato di E.coli e P.mandapamensis crescono in acqua di mare artificiale, così come in LB, ed entrambi mostrano un'emissione di luce. Ma nel mezzo LB, P.Mandapamensis non emette affatto luce. Sorprendentemente, il ceppo di E.coli modificato mostra un'intensità luminosa massima più elevata rispetto ai batteri bioluminescenti.

In questo esperimento, l'espressione genica dell'operone lux-rib basato su E.coli è stata misurata nell'arco di 24 ore per analizzarne la longevità. L'emissione luminosa è durata 19 ore e mezza, molto più a lungo rispetto ai ceppi batterici, dove si è osservata una graduale diminuzione, con conseguente emissione luminosa molto bassa dopo 10 ore. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della bioluminescenza per esplorare gli operoni lux in organismi modello, come E.Coli.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come lavorare con i batteri bioluminescenti.