Analisi quantitativa di impionbatura alternativo Pre-mRNA nelle sezioni del cervello del Mouse usando analisi di RNA In Situ di ibridazione
August 26th, 2018
È descritto un in situ (ISH) protocollo di ibridazione che utilizza brevi oligonucleotidi antisenso per rilevare modelli d'impionbatura alternativa pre-mRNA nelle sezioni del cervello del mouse.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello splicing alternativo del pre-mRNA. In particolare, fornisce un sistema di analisi robusto e sensibile per esaminare modelli di splicing alternativi in situ in fette di tessuto. Con questo metodo, lo splicing alternativo può essere analizzato simultaneamente in molti sottotipi contenuti in strutture biologiche complesse come il cervello di un topo.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza sonde antistatiche a giunzione esone in urto nell'ibridazione in situ dell'mRNA per produrre segnali di ibridazione isoforma specifici. La tecnologia di amplificazione del segnale Building aumenta la sensibilità del rilevamento per fornire robusti segnali di ibridazione. I segnali rilevati erano l'inclusione dell'esone che sfugge a sonde specifiche che vengono utilizzate per calcolare la percentuale di splicing nei parametri vitali in diverse aree anatomiche del cervello di un topo.
In questo studio l'esone 23a di NF1 viene utilizzato come esempio per illustrare l'uso del sistema di analisi. Tuttavia, il sistema può essere adattato per analizzare i modelli di espressione di molti esoni alternativi. Per iniziare la paraffinazione della sezione D del cervello di topo, riempire due piatti con 250 millilitri di xilene.
E altri due con 250 millilitri di etanolo al 100% all'interno di una cappa aspirante. Inserire i vetrini in tessuto in un cestello per il lavaggio. Quindi, posizionare il cestello in un piatto contenente xilene e incubare per cinque minuti muovendo il cestello su e giù almeno tre volte e ripetere con il secondo piatto di xilene.
Quindi posizionare la griglia in una capsula contenente etanolo e incubare per due minuti con gli stessi movimenti su e giù, quindi ripetere con la seconda capsula a etanolo. Per asciugare i vetrini, spostare la griglia dal secondo piatto di etanolo e posizionarlo all'interno di un'incubatrice a 60 gradi Celsius per cinque minuti. Usa una penna barriera idrofobica per disegnare una barriera di 0,75 pollici per 0,75 pollici attorno alla sezione del tessuto e asciuga all'aria per tre minuti a temperatura ambiente.
Accendi il forno di ibridazione e imposta la temperatura a 40 gradi Celsius. Dopo aver bagnato completamente la carta umidificante con acqua distillata, metterla in una vaschetta per il controllo dell'umidità. Quindi inserire la vaschetta di controllo dell'umidità nel forno di ibridazione.
Dopo aver posizionato i vetrini essiccati su un banco, coprire completamente le sezioni di tessuto su ciascun vetrino con cinque-otto gocce di soluzione di perossido di idrogeno. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Picchiettare i vetrini su una carta assorbente, uno alla volta per rimuovere la soluzione di perossido di idrogeno e inserire i vetrini in un cestello di lavaggio.
Immergere il cestello in una bacinella contenente acqua mentre lo si muove su e giù da tre a cinque volte per lavare i vetrini. Riempire un bicchiere di vetro da un litro posto su una piastra calda con 700 millilitri di trattamento di rimozione del bersaglio 1X e coprirlo con un foglio. Inserire un termometro attraverso il coperchio di alluminio e accendere la piastra riscaldante, impostata su alta temperatura per 10-15 minuti.
Una volta che la temperatura del reagente di recupero raggiunge i 98 gradi Celsius, impostare la piastra riscaldante a bassa temperatura per mantenere una condizione di ebollizione lieve. Quindi, rimuovere con cautela la pellicola e posizionare la griglia all'interno del bicchiere. Coprire il becher con un foglio di alluminio e incubare per 15 minuti.
Utilizzare una pinza per trasferire il rack dal becher a una piastra di lavaggio contenente 200 millilitri di acqua distillata e incubare per 15 secondi. Dopo 15 secondi, mettere il rack in una piastra contenente etanolo al 100% e incubare per tre minuti. Togliere la griglia dalla pirofila e asciugare a 60 gradi Celsius per 10 minuti.
Dopo aver posizionato i vetrini su una rastrelliera per macchie, coprire le sezioni di tessuto con cinque gocce di proteasi 3 per vetrino. Posizionare con cautela la griglia nella teglia per il controllo dell'umidità e inserire la teglia nel forno di ibridazione e incubare a 40 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo aver rimosso la griglia dal vassoio, picchiettare i vetrini per rimuovere il liquido in eccesso e inserirli in un cestello per il lavaggio.
Posizionare la griglia in una teglia contenente acqua distillata e spostare la griglia su e giù da tre a cinque volte per lavare i vetrini. Per prepararsi all'ibridazione in situ, incubare le sonde e i reagenti AMP a temperatura ambiente per 30 minuti. Inserire la vaschetta di controllo dell'umidità nel forno di ibridazione e impostare a 40 gradi Celsius.
Per l'ibridazione della sonda, rimuovere i vetrini dal cestello di lavaggio e picchiettarli per rimuovere il liquido in eccesso. Posizionare i vetrini su una rastrelliera per macchie. Utilizzare una matita per etichettare le diapositive con il nome della sonda.
Posizionare tre vetrini di tessuto cerebrale tagliati adiacenti da ibridare con tre diverse sonde di mitosi neurale di tipo uno. Poiché esistono sonde specifiche per isoforme molto diverse, utilizzo sezioni di tessuto tagliate adiacenti. È fondamentale che queste sezioni siano trattate esattamente allo stesso modo nelle fasi di ibridazione, amplificazione e rilevamento del segnale per garantire l'accuratezza della giunzione percentuale nel calcolo.
Coprire le sezioni di tessuto con quattro gocce di sonda per sezione, un vetrino alla volta per evitare che le sezioni si secchino. Quindi posizionare la griglia antimacchia nella vaschetta per il controllo dell'umidità e inserirla nel forno a 40 gradi Celsius per due ore. Quindi, posizionare uno stendibiancheria in una pirofila riempita con 200 millilitri di tampone di lavaggio 1X.
Quindi picchiettare ogni vetrino, uno alla volta su un tovagliolo di carta per rimuovere il liquido in eccesso. E inserire immediatamente ogni vetrino nel cestello di lavaggio. Incubare a temperatura ambiente per due minuti in una pirofila riempita con un tampone di lavaggio fresco mentre si sposta il cestello su e giù da tre a cinque volte, quindi ripetere il lavaggio in un nuovo piatto.
Per l'amplificazione del segnale, picchiettare ogni vetrino per rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso e posizionarli su uno scolamacchie. Coprire la sezione di tessuto su ciascun vetrino con quattro gocce di reagente AMP zero. Quindi, posizionare la griglia nella teglia per il controllo dell'umidità, inserire la teglia nel forno e incubare a 40 gradi Celsius per 30 minuti.
Lavare il vetrino due volte con un tampone di lavaggio come precedentemente fatto in questo esperimento. Ripetere la fase di amplificazione del segnale con i reagenti AMP da uno a sei, come descritto nel protocollo di testo, e lavare i vetrini dopo ogni passaggio. Per il rilevamento del segnale, rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso dai vetrini picchiettandoli e posizionarli su una griglia antimacchia.
Quindi, mescolare due microlitri di rosso B veloce con 120 microlitri di rosso A veloce in una provetta da microcentrifuga. Aggiungere la soluzione alle sezioni di tessuto su ogni vetrino per coprirle completamente. Posizionare la griglia antimacchia nella vaschetta per il controllo dell'umidità, coprire la teglia e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
Quindi rimuovere la soluzione e inserire i vetrini in un cestello per il lavaggio. Posizionare la griglia in una bacinella contenente acqua di rubinetto per lavare i vetrini e ripetere il lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, picchiettare su carta assorbente per rimuovere l'acqua in eccesso.
Quindi, posizionare la griglia in un piatto contenente il 50% di soluzione colorante con ematossilina. Spostare il rack su e giù più volte. E incubare per due minuti a temperatura ambiente.
Trasferire la griglia in una leccarda contenente acqua di rubinetto. Spostare il cestello su e giù cinque volte e ripetere il lavaggio fino a quando i vetrini diventano chiari, mentre le sezioni di tessuto rimangono viola. Quindi trasferire la griglia in un piatto contenente lo 0,02% di acqua di ammoniaca.
Spostare il rack su e giù da due a quattro volte finché le sezioni non diventano blu. Lavare i vetrini con acqua di rubinetto da tre a cinque volte nella vaschetta per la colorazione. Quindi, posizionare il rack all'interno di un'incubatrice e incubare per 15 minuti a 60 gradi Celsius per asciugare i vetrini.
Quando è completamente asciutto, aggiungere una goccia di mezzo di montaggio su ogni vetrino per coprire la fetta. Quindi, posizionare con cura un vetrino coprioggetti di 24 x 50 millimetri sulle sezioni di tessuto su ciascun vetrino. Dopo aver asciugato i vetrini all'aria per 30 minuti a temperatura ambiente, procedere con la raccolta dei dati.
Per calcolare la percentuale di splicing in o valore PSI per l'esone 23a, vengono contati il numero di cellule e punti in tre sottoregioni della corteccia e l'ippocampo CA3. Il saggio di ibridazione dell'RNA in situ viene eseguito in sezioni cerebrali di topi CD1 wild type utilizzando tre diverse sonde specifiche per NF1. I punti puntati rossi osservati nelle sezioni della corteccia e dell'ippocampo, indicano segnali positivi per NF1 totale, specifiche per l'inclusione e sonde specifiche per il salto.
I segnali ISH provenienti dalle tre sonde vengono quindi contati e utilizzati per calcolare il PSI. Il saggio di ibridazione dell'RNA in situ viene eseguito nella corteccia di topi C57 neri 6J wild type e di topi neri C57 6J mutanti in cui l'esone 23a è incluso in tutti i tipi di cellule. I punti puntati rossi osservati nella corteccia dei topi C57 neri 6J wild type, indicano segnali positivi da parte di NF1 totale, specifiche per l'inclusione e sonde specifiche per il salto.
Nei topi neri 6J mutanti C57, segnali simili sono ottenuti da sonde totali e specifiche per inclusione NF1. Tuttavia, non viene rilevato alcun segnale quando si utilizza il salto di una sonda specifica, indicando che due sonde che mirano all'inclusione o al salto dell'esone sono altamente specifiche. Poiché per questa procedura non è ancora disponibile l'etichettatura multicolore sugli stessi vetrini di tessuto, vengono utilizzate sonde diverse sui diversi vetrini di tessuto.
Per ottenere i valori di giunzione percentuali accurati, è importante utilizzare vetrini tagliati adiacenti e trattare i vetrini esattamente allo stesso modo durante questa procedura. A complemento di questa procedura ci sono misure come l'immunoistochimica, che possono essere eseguite per rispondere a ulteriori domande riguardanti la localizzazione e la funzione delle isoforme di splicing differenzialmente espresse.
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Panoramica
Questo articolo descrive un protocollo di ibridazione in situ (ISH) che utilizza brevi oligonucleotidi antisenso per rilevare modelli di splicing alternativo del pre-mRNA in sezioni di cervello di topo. Questo metodo permette l'analisi simultanea dei modelli di splicing in vari sottotipi all'interno di strutture biologiche complesse.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Genetica
- Biologia molecolare
Sfondo
- Lo splicing alternativo del pre-mRNA è cruciale per generare diversità proteica.
- Comprendere i modelli di splicing può fornire informazioni sulla funzione cerebrale e sui disturbi.
- Le tecniche di ibridazione in situ sono essenziali per studiare lo splicing in contesti tissutali.
- Questo studio si concentra su sezioni di cervello di topo per esplorare le variazioni di splicing.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un saggio sensibile per rilevare lo splicing alternativo in situ.
- Analizzare i modelli di splicing in diverse regioni cerebrali.
- Migliorare la comprensione dei meccanismi di splicing nel cervello.
Metodi utilizzati
- Ibridazione in situ utilizzando brevi oligonucleotidi antisenso.
- Sonde anti-statiche per giunzioni esoniche per segnali isoforma-specifici.
- Tecnologia di amplificazione del segnale per aumentare la sensibilità di rilevazione.
- Analisi delle percentuali di inclusione esonica e splicing in varie aree anatomiche.
Principali risultati
- Sono stati ottenuti robusti segnali di ibridazione utilizzando il metodo sviluppato.
- I modelli di splicing alternativo sono stati rilevati con successo in sezioni di cervello di topo.
- La tecnica permette l'analisi simultanea di molteplici eventi di splicing.
- I risultati contribuiscono alla comprensione della complessità dello splicing nei tessuti neurali.
Conclusiioni
- Il protocollo ISH fornisce uno strumento prezioso per studiare lo splicing alternativo.
- I risultati migliorano la conoscenza dei meccanismi di splicing nel cervello.
- Questo metodo può facilitare ulteriori ricerche sulle condizioni neurologiche legate allo splicing.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This method enables spatially resolved quantification of alternative splicing events in complex tissues, addressing a critical gap in target validation where bulk RNA approaches mask cellular heterogeneity. By providing isoform-specific signals at single-cell resolution in anatomically defined brain regions, it supports mechanistic de-risking of splicing-dependent targets in neuroscience drug discovery. The ability to calculate percent spliced in (PSI) values from exon inclusion and skipping signals offers a quantitative, reproducible metric for assessing target engagement and pathway modulation in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking specific splice isoforms to cell-type-specific expression patterns in disease-relevant brain regions.
- Operational Value: Provides a robust, sensitive assay system for examining alternative splicing patterns in situ within tissue slices, reducing reliance on dissociated cell models that lose spatial context.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Uses shock anti-static exon junction probes to generate isoform-specific hybridization signals, enabling simultaneous analysis of multiple subtypes within complex biological structures.
- Operational Value: Signal amplification technology increases detection sensitivity, producing robust signals suitable for quantitative imaging and automated analysis workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system analysis by mapping splicing patterns across anatomical areas such as cortex and hippocampus, supporting biomarker discovery for neuropsychiatric indications.
- Operational Value: Enables parallel processing of adjacently cut tissue sections under identical conditions, ensuring data accuracy for cross-sectional comparisons in preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase, where spatially resolved splicing data informs target selection and mechanistic understanding before assay development for high-throughput screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing cell-type-specific alternative splicing patterns that may be obscured in bulk tissue analyses.
- Screening: Generates quantitative, spatially resolved readouts (e.g., PSI values) that can inform assay design for splicing-modulating compounds.
- Analytics: Enables calculation of percent spliced in from exon inclusion and skipping signal counts, providing a normalized metric for comparing conditions across brain regions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by validating splicing changes in anatomically defined regions relevant to disease models.
- Enterprise Reuse: The probe-based approach is adaptable to multiple alternative exons, positioning it as a reusable platform for splicing analysis across diverse targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking specific splice isoforms to defined anatomical locations, increasing confidence in target-disease relationships.
- Operational Value: Standardized protocol with built-in controls (e.g., adjacently cut slides, identical processing) enhances reproducibility across sites and users.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by providing spatially resolved efficacy and mechanism data early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated splicing expression in disease-relevant neural circuits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA in situ hybridization, tissue sectioning, and quantitative image analysis for punctate dot counting.
- Dependent on hybridization ovens, humidity control trays, and reagent systems for probe hybridization, signal amplification, and detection (e.g., Fast Red).
- Necessitates standardization across teams for slide preparation, probe incubation, and washing steps to ensure comparability of PSI calculations.
- Adaptation to new exons requires design and validation of exon junction-specific probes, with sensitivity to target sequence accessibility.
- Practical limitation: Multi-color labeling is not currently available, requiring sequential analysis on separate slides, which increases tissue sectioning and processing demands.
