Analisi quantitativa di impionbatura alternativo Pre-mRNA nelle sezioni del cervello del Mouse usando analisi di RNA In Situ di ibridazione
26 agosto 2018
È descritto un in situ (ISH) protocollo di ibridazione che utilizza brevi oligonucleotidi antisenso per rilevare modelli d'impionbatura alternativa pre-mRNA nelle sezioni del cervello del mouse.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello splicing alternativo del pre-mRNA. In particolare, fornisce un sistema di analisi robusto e sensibile per esaminare modelli di splicing alternativi in situ in fette di tessuto. Con questo metodo, lo splicing alternativo può essere analizzato simultaneamente in molti sottotipi contenuti in strutture biologiche complesse come il cervello di un topo.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza sonde antistatiche a giunzione esone in urto nell'ibridazione in situ dell'mRNA per produrre segnali di ibridazione isoforma specifici. La tecnologia di amplificazione del segnale Building aumenta la sensibilità del rilevamento per fornire robusti segnali di ibridazione. I segnali rilevati erano l'inclusione dell'esone che sfugge a sonde specifiche che vengono utilizzate per calcolare la percentuale di splicing nei parametri vitali in diverse aree anatomiche del cervello di un topo.
In questo studio l'esone 23a di NF1 viene utilizzato come esempio per illustrare l'uso del sistema di analisi. Tuttavia, il sistema può essere adattato per analizzare i modelli di espressione di molti esoni alternativi. Per iniziare la paraffinazione della sezione D del cervello di topo, riempire due piatti con 250 millilitri di xilene.
E altri due con 250 millilitri di etanolo al 100% all'interno di una cappa aspirante. Inserire i vetrini in tessuto in un cestello per il lavaggio. Quindi, posizionare il cestello in un piatto contenente xilene e incubare per cinque minuti muovendo il cestello su e giù almeno tre volte e ripetere con il secondo piatto di xilene.
Quindi posizionare la griglia in una capsula contenente etanolo e incubare per due minuti con gli stessi movimenti su e giù, quindi ripetere con la seconda capsula a etanolo. Per asciugare i vetrini, spostare la griglia dal secondo piatto di etanolo e posizionarlo all'interno di un'incubatrice a 60 gradi Celsius per cinque minuti. Usa una penna barriera idrofobica per disegnare una barriera di 0,75 pollici per 0,75 pollici attorno alla sezione del tessuto e asciuga all'aria per tre minuti a temperatura ambiente.
Accendi il forno di ibridazione e imposta la temperatura a 40 gradi Celsius. Dopo aver bagnato completamente la carta umidificante con acqua distillata, metterla in una vaschetta per il controllo dell'umidità. Quindi inserire la vaschetta di controllo dell'umidità nel forno di ibridazione.
Dopo aver posizionato i vetrini essiccati su un banco, coprire completamente le sezioni di tessuto su ciascun vetrino con cinque-otto gocce di soluzione di perossido di idrogeno. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Picchiettare i vetrini su una carta assorbente, uno alla volta per rimuovere la soluzione di perossido di idrogeno e inserire i vetrini in un cestello di lavaggio.
Immergere il cestello in una bacinella contenente acqua mentre lo si muove su e giù da tre a cinque volte per lavare i vetrini. Riempire un bicchiere di vetro da un litro posto su una piastra calda con 700 millilitri di trattamento di rimozione del bersaglio 1X e coprirlo con un foglio. Inserire un termometro attraverso il coperchio di alluminio e accendere la piastra riscaldante, impostata su alta temperatura per 10-15 minuti.
Una volta che la temperatura del reagente di recupero raggiunge i 98 gradi Celsius, impostare la piastra riscaldante a bassa temperatura per mantenere una condizione di ebollizione lieve. Quindi, rimuovere con cautela la pellicola e posizionare la griglia all'interno del bicchiere. Coprire il becher con un foglio di alluminio e incubare per 15 minuti.
Utilizzare una pinza per trasferire il rack dal becher a una piastra di lavaggio contenente 200 millilitri di acqua distillata e incubare per 15 secondi. Dopo 15 secondi, mettere il rack in una piastra contenente etanolo al 100% e incubare per tre minuti. Togliere la griglia dalla pirofila e asciugare a 60 gradi Celsius per 10 minuti.
Dopo aver posizionato i vetrini su una rastrelliera per macchie, coprire le sezioni di tessuto con cinque gocce di proteasi 3 per vetrino. Posizionare con cautela la griglia nella teglia per il controllo dell'umidità e inserire la teglia nel forno di ibridazione e incubare a 40 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo aver rimosso la griglia dal vassoio, picchiettare i vetrini per rimuovere il liquido in eccesso e inserirli in un cestello per il lavaggio.
Posizionare la griglia in una teglia contenente acqua distillata e spostare la griglia su e giù da tre a cinque volte per lavare i vetrini. Per prepararsi all'ibridazione in situ, incubare le sonde e i reagenti AMP a temperatura ambiente per 30 minuti. Inserire la vaschetta di controllo dell'umidità nel forno di ibridazione e impostare a 40 gradi Celsius.
Per l'ibridazione della sonda, rimuovere i vetrini dal cestello di lavaggio e picchiettarli per rimuovere il liquido in eccesso. Posizionare i vetrini su una rastrelliera per macchie. Utilizzare una matita per etichettare le diapositive con il nome della sonda.
Posizionare tre vetrini di tessuto cerebrale tagliati adiacenti da ibridare con tre diverse sonde di mitosi neurale di tipo uno. Poiché esistono sonde specifiche per isoforme molto diverse, utilizzo sezioni di tessuto tagliate adiacenti. È fondamentale che queste sezioni siano trattate esattamente allo stesso modo nelle fasi di ibridazione, amplificazione e rilevamento del segnale per garantire l'accuratezza della giunzione percentuale nel calcolo.
Coprire le sezioni di tessuto con quattro gocce di sonda per sezione, un vetrino alla volta per evitare che le sezioni si secchino. Quindi posizionare la griglia antimacchia nella vaschetta per il controllo dell'umidità e inserirla nel forno a 40 gradi Celsius per due ore. Quindi, posizionare uno stendibiancheria in una pirofila riempita con 200 millilitri di tampone di lavaggio 1X.
Quindi picchiettare ogni vetrino, uno alla volta su un tovagliolo di carta per rimuovere il liquido in eccesso. E inserire immediatamente ogni vetrino nel cestello di lavaggio. Incubare a temperatura ambiente per due minuti in una pirofila riempita con un tampone di lavaggio fresco mentre si sposta il cestello su e giù da tre a cinque volte, quindi ripetere il lavaggio in un nuovo piatto.
Per l'amplificazione del segnale, picchiettare ogni vetrino per rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso e posizionarli su uno scolamacchie. Coprire la sezione di tessuto su ciascun vetrino con quattro gocce di reagente AMP zero. Quindi, posizionare la griglia nella teglia per il controllo dell'umidità, inserire la teglia nel forno e incubare a 40 gradi Celsius per 30 minuti.
Lavare il vetrino due volte con un tampone di lavaggio come precedentemente fatto in questo esperimento. Ripetere la fase di amplificazione del segnale con i reagenti AMP da uno a sei, come descritto nel protocollo di testo, e lavare i vetrini dopo ogni passaggio. Per il rilevamento del segnale, rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso dai vetrini picchiettandoli e posizionarli su una griglia antimacchia.
Quindi, mescolare due microlitri di rosso B veloce con 120 microlitri di rosso A veloce in una provetta da microcentrifuga. Aggiungere la soluzione alle sezioni di tessuto su ogni vetrino per coprirle completamente. Posizionare la griglia antimacchia nella vaschetta per il controllo dell'umidità, coprire la teglia e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
Quindi rimuovere la soluzione e inserire i vetrini in un cestello per il lavaggio. Posizionare la griglia in una bacinella contenente acqua di rubinetto per lavare i vetrini e ripetere il lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, picchiettare su carta assorbente per rimuovere l'acqua in eccesso.
Quindi, posizionare la griglia in un piatto contenente il 50% di soluzione colorante con ematossilina. Spostare il rack su e giù più volte. E incubare per due minuti a temperatura ambiente.
Trasferire la griglia in una leccarda contenente acqua di rubinetto. Spostare il cestello su e giù cinque volte e ripetere il lavaggio fino a quando i vetrini diventano chiari, mentre le sezioni di tessuto rimangono viola. Quindi trasferire la griglia in un piatto contenente lo 0,02% di acqua di ammoniaca.
Spostare il rack su e giù da due a quattro volte finché le sezioni non diventano blu. Lavare i vetrini con acqua di rubinetto da tre a cinque volte nella vaschetta per la colorazione. Quindi, posizionare il rack all'interno di un'incubatrice e incubare per 15 minuti a 60 gradi Celsius per asciugare i vetrini.
Quando è completamente asciutto, aggiungere una goccia di mezzo di montaggio su ogni vetrino per coprire la fetta. Quindi, posizionare con cura un vetrino coprioggetti di 24 x 50 millimetri sulle sezioni di tessuto su ciascun vetrino. Dopo aver asciugato i vetrini all'aria per 30 minuti a temperatura ambiente, procedere con la raccolta dei dati.
Per calcolare la percentuale di splicing in o valore PSI per l'esone 23a, vengono contati il numero di cellule e punti in tre sottoregioni della corteccia e l'ippocampo CA3. Il saggio di ibridazione dell'RNA in situ viene eseguito in sezioni cerebrali di topi CD1 wild type utilizzando tre diverse sonde specifiche per NF1. I punti puntati rossi osservati nelle sezioni della corteccia e dell'ippocampo, indicano segnali positivi per NF1 totale, specifiche per l'inclusione e sonde specifiche per il salto.
I segnali ISH provenienti dalle tre sonde vengono quindi contati e utilizzati per calcolare il PSI. Il saggio di ibridazione dell'RNA in situ viene eseguito nella corteccia di topi C57 neri 6J wild type e di topi neri C57 6J mutanti in cui l'esone 23a è incluso in tutti i tipi di cellule. I punti puntati rossi osservati nella corteccia dei topi C57 neri 6J wild type, indicano segnali positivi da parte di NF1 totale, specifiche per l'inclusione e sonde specifiche per il salto.
Nei topi neri 6J mutanti C57, segnali simili sono ottenuti da sonde totali e specifiche per inclusione NF1. Tuttavia, non viene rilevato alcun segnale quando si utilizza il salto di una sonda specifica, indicando che due sonde che mirano all'inclusione o al salto dell'esone sono altamente specifiche. Poiché per questa procedura non è ancora disponibile l'etichettatura multicolore sugli stessi vetrini di tessuto, vengono utilizzate sonde diverse sui diversi vetrini di tessuto.
Per ottenere i valori di giunzione percentuali accurati, è importante utilizzare vetrini tagliati adiacenti e trattare i vetrini esattamente allo stesso modo durante questa procedura. A complemento di questa procedura ci sono misure come l'immunoistochimica, che possono essere eseguite per rispondere a ulteriori domande riguardanti la localizzazione e la funzione delle isoforme di splicing differenzialmente espresse.
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Panoramica
In questo articolo viene descritto un protocollo di ibridazione in situ (ISH) che utilizza oligonucleotidi antisenso corti per rilevare modelli di splicing alternativo dell'pre-mRNA in sezioni di cervello di topo. Questo metodo consente l'analisi simultanea dei modelli di splicing in diversi sottotipi all'interno di strutture biologiche complesse.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Genetica
- Biologia molecolare
Sfondo
- L'alternanza del processamento dell'RNA messaggero pre-maturo è fondamentale per generare diversità proteica.
- Comprendere i modelli di splicing può fornire informazioni sul funzionamento cerebrale e sui disturbi neurologici.
- Le tecniche di ibridazione in situ sono essenziali per lo studio dello splicing in contesti tissutali.
- Questo studio si concentra su sezioni cerebrali di topo per esplorare le variazioni dello splicing.
Scopo dello studio
- Sviluppare un saggio sensibile per rilevare lo splicing alternativo in situ.
- Analizzare i modelli di splicing in diverse regioni cerebrali.
- Migliorare la comprensione dei meccanismi di splicing nel cervello.
Metodi Utilizzati
- Ibridizzazione in situ mediante oligonucleotidi antisenso brevi.
- Probbe anti-statiche per giunzioni esoniche per segnali specifici degli isoformi.
- Tecnologia di amplificazione del segnale per aumentare la sensibilità di rilevamento.
- Analisi dell'inclusione degli esoni e delle percentuali di splicing in diverse aree anatomiche.
Risultati principali
- Segnali di ibridazione robusti sono stati ottenuti utilizzando il metodo sviluppato.
- I modelli di splicing alternativo sono stati rilevati con successo in sezioni di cervello di topo.
- La tecnica consente l'analisi simultanea di multipli eventi di splicing.
- I risultati contribuiscono alla comprensione della complessità dello splicing nei tessuti neurali.
Conclusioni
- Il protocollo ISH fornisce uno strumento prezioso per lo studio dello splicing alternativo.
- I risultati aumentano la conoscenza dei meccanismi di splicing nel cervello.
- Questo metodo può facilitare ulteriori ricerche sulle condizioni neurologiche correlate allo splicing.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente la quantificazione con risoluzione spaziale di eventi di splicing alternativo in tessuti complessi, affrontando una lacuna critica nella validazione degli obiettivi in cui gli approcci bulk di RNA mascherano l'eterogeneità cellulare. Fornendo segnali specifici per isoforma con risoluzione a livello di singola cellula in regioni cerebrali anatomicamente definite, supporta la riduzione del rischio meccanicistica di bersagli dipendenti dallo splicing nella scoperta di farmaci nel campo delle neuroscienze. La possibilità di calcolare i valori di percentuale di inclusione dell'esone (PSI) a partire dai segnali di inclusione e salto dell'esone offre una metrica quantitativa e riproducibile per valutare l'interazione con il bersaglio e la modulazione del percorso in modelli preclinici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche collegando specifici isoformi di splicing a modelli di espressione specifici per tipo cellulare in regioni cerebrali rilevanti per la malattia.
- Valore operativo: Fornisce un sistema di saggio robusto e sensibile per esaminare in situ i modelli di splicing alternativo all'interno di sezioni di tessuto, riducendo la dipendenza da modelli di cellule dissociate che perdono il contesto spaziale.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Utilizza sonde anti-statiche per i giunti esonici per generare segnali di ibridazione specifici per isoforma, consentendo l'analisi simultanea di sottotipi multipli all'interno di strutture biologiche complesse.
- Valore operativo: La tecnologia di amplificazione del segnale aumenta la sensibilità di rilevamento, producendo segnali robusti adatti all'analisi quantitativa mediante imaging e flussi di lavoro automatizzati.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Facilita l'analisi di sistemi rilevanti per le malattie mappando i modelli di splicing in aree anatomiche come la corteccia e l'ippocampo, sostenendo la scoperta di biomarcatori per indicazioni neuropsichiatriche.
- Valore operativo: Consente l'elaborazione parallela di sezioni di tessuto adiacenti tagliate in condizioni identiche, garantendo l'accuratezza dei dati per confronti trasversali in studi preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nella fase di biologia della scoperta, in cui dati sullo splicing risolti spazialmente guidano la selezione delle target e la comprensione meccanicistica prima dello sviluppo di saggi per lo screening ad alto rendimento.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi rivelando modelli di splicing alternativo specifici per tipo cellulare che potrebbero risultare oscurati nelle analisi di tessuto bulk.
- Screening: Genera letture quantitative con risoluzione spaziale (ad esempio, valori PSI) che possono guidare la progettazione di saggi per composti modulatori dello splicing.
- Analisi: Permette il calcolo della percentuale di inclusione dell'esone a partire dai conteggi dei segnali di inclusione ed esclusione dell'esone, fornendo una metrica normalizzata per confrontare condizioni in diverse regioni cerebrali.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati della scoperta alla continuità preclinica validando i cambiamenti nello splicing in regioni anatomicamente definite rilevanti per i modelli di malattia.
- Riutilizzo aziendale: L'approccio basato su sonde è adattabile a diversi esoni alternativi, posizionandolo come una piattaforma riutilizzabile per l'analisi dello splicing in una vasta gamma di bersagli e aree patologiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica collegando specifici isoformi di splicing a localizzazioni anatomiche definite, aumentando la fiducia nelle relazioni tra bersaglio e malattia.
- Valore operativo: Un protocollo standardizzato con controlli integrati (ad esempio, sezioni adiacenti, elaborazione identica) migliora la riproducibilità tra diversi siti e utilizzatori.
- Valore strategico: Consente decisioni più informate su prosegui/non prosegui fornendo precocemente dati sull'efficacia e sul meccanismo con risoluzione spaziale nel percorso di scoperta.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei bersagli adeguata al rischio, basata sull'espressione di splicing validata nei circuiti neurali rilevanti per la malattia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'ibridazione in situ dell'RNA, nella sezionatura dei tessuti e nell'analisi quantitativa delle immagini per il conteggio dei puntini discreti.
- Dipende da forni per ibridazione, vassoi per il controllo dell'umidità e sistemi di reagenti per l'ibridazione delle sonde, l'amplificazione del segnale e la rivelazione (ad esempio, Fast Red).
- Necessita di standardizzazione tra i gruppi di lavoro per la preparazione dei vetrini, l'incubazione delle sonde e i passaggi di lavaggio, al fine di garantire la comparabilità dei calcoli del PSI.
- L'adattamento a nuovi esoni richiede la progettazione e la validazione di sonde specifiche per le giunzioni degli esoni, con sensibilità all'accessibilità della sequenza bersaglio.
- Limite pratico: l'etichettatura multicolore non è attualmente disponibile, richiedendo analisi sequenziali su vetrini separati, il che aumenta le richieste di sezionamento e lavorazione dei tessuti.
