Name: Analisi quantitativa di impionbatura alternativo Pre-mRNA nelle sezioni del cervello del Mouse usando analisi di RNA In Situ di ibridazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Impara l'analisi quantitativa dello splicing alternativo del pre-mRNA nel cervello del topo mediante ibridazione in situ con sonde antisenso. Questo metodo consente di rilevare pattern di splicing in diverse regioni cerebrali con elevata sensibilità.

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Questo lavoro è stato sostenuto dall'associazione americana del cuore [sovvenzione dai 0365274B a H.L.], National Cancer Institute [GI SPORE P50CA150964 a Z.W.], National Institutes of Health [Ufficio di ricerca infrastrutture condivise strumentazione Grant S10RR031845 a la microscopia chiara Imaging Facility presso Case Western Reserve University] e del Consiglio di borsa di studio di Cina [a X.G.]. Gli autori ringraziano Richard Lee nel nucleo Imaging microscopia luce per il suo aiuto con scivolo di scansione.

Tutti gli esperimenti descritti qui che coinvolgono i topi sono stati approvati dal comitato di uso e cura degli animali con istituzionale Case Western Reserve University. Il titolo del protocollo 2016-0068 (PI: Hua Lou) è il "Ruolo di impionbatura alternativo pre-mRNA in vertebrate development".
Nota: Le informazioni di tutte le attrezzature, reagenti e materiali di consumo utilizzati nel presente protocollo sono incluso nella Tabella materiali.
1. preparare la formalina fisso paraffina (FFPE) sezioni incorporate
<ol><li>
Eutanasia 1 CD1 ed 1 mouse C57BL/6J di dislocazione cervicale. Accuratamente tagliato aperto il cranio con forbici e pinze. Rimuovere il cervello con una paletta. Nota: topo maschio di 5 mesi CD1 e topi maschii di C57BL/6J 3 mesi sono stati utilizzati e ha mostrati risultati simili.<ol>
<li>Lavare il cervello con PBS. Riparare il cervello con una soluzione contenente formalina al 10% a temperatura ambiente (TA) per 30 h mettendo l'intero cervello in 50 mL di soluzione di formalina.</li>
		<li>Modificare la soluzione di fissaggio in PBS e incubare il cervello in PBS durante la notte a 4 ° C. Disidratare e incorporare il cervello con xilene e paraffina utilizzando le procedure standard18.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Utilizzare un microtomo per tagliare il tessuto incorporato in 5 sezioni di µm. Mettere il nastro di paraffina a bagnomaria RT prima e poi in un bagno di acqua 45 ° C per diffondere la barra multifunzione.
	<ol>
<li>Quando scompaiono le rughe e le pieghe sulla barra multifunzione, montare immediatamente sezioni sulle lastre di vetro. Aria secche diapositive durante la notte alle diapositive RT. cuocere per 1 h a 60 ° C prima dell'uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. pretrattamento del campione
<ol><li>
Deparaffinizzare sezioni di tessuto. Eseguire questi passaggi in una cappa aspirante.
	<ol>
<li>Riempire due piatti di lavaggio (Figura 1A) con 250 mL di xilene fresco e due con 250 mL di etanolo al 100%. Inserire le diapositive del tessuto in un lavaggio rack (Figura 1A) e posto il lavaggio cremagliera a lavare i piatti dopo la data di ordine e incubazione indicata nella tabella 1.</li>
		<li>Durante ciascuna incubazione, sollevate il vassoio di lavaggio su e giù più di 3 volte nel piatto lavaggio. Dopo ciascuna incubazione, spostare rapidamente il rack di lavaggio nel piatto successivo lavaggio per evitare che le sezioni di tessuto dall'asciugarsi.</li>
		<li>Dopo aver completato le fasi di incubazione, togliere la rastrelliera di lavaggio con scivoli dal piatto di lavaggio. Mettere la griglia in un incubatore a 60 ° C per 5 minuti o fino a quando le diapositive siano completamente asciutte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Disegnare una 0,75 '' x 0.75 ' barriera che circonda la sezione di tessuto con una penna di barriera idrofoba. Aria secca la barriera per 3 minuti a TA.</li>
	<li>
Pretrattare fette
	<ol>
<li>Preparare i reagenti e le attrezzature<ol>
<li>Accendere il forno di ibridazione (Figura 1B) e impostare la temperatura a 40 ° C 30 min prima dell'uso.</li>
			<li>Bagnare completamente la carta umidificazione (Figura 1E) con acqua distillata e metterlo nel vassoio di controllo umidità (Figura 1, sinistra). Tenere il vassoio di controllo di umidità nel forno ibridazione.</li>
			<li>Preparare 700 mL di 1x fresca destinazione recupero reagenti aggiungendo 630 mL di dH2O a 70 mL di 10 x destinazione recupero dei reagenti.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Applicare il perossido di idrogeno.<ol>
<li>Mettere le diapositive Sparaffinatura in panchina. Aggiungere 5-8 gocce di perossido di idrogeno a una sezione da ricoprire completamente il tessuto. Incubare per 10 min a RT.</li>
			<li>Toccare le diapositive su un pezzo di carta assorbente per rimuovere la soluzione di perossido di idrogeno, una diapositiva alla volta. Immediatamente inserire la diapositiva in un rack di lavaggio e spostare il rack in un piatto di lavaggio riempito di dH2O.</li>
			<li>Lavare i vetrini spostando il rack su e giù in acqua distillata per 3 – 5 volte. Spostare il rack di lavaggio in un piatto di lavaggio riempito con acqua distillata e lavare una volta di più.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Eseguire il recupero di destinazione<ol>
<li>Posizionare un bicchiere di vetro di 1.000 mL su un piatto caldo. Aggiungere 700 mL di 1x fresca destinazione recupero reagenti nel becher e coprirlo con un foglio. Inserire un termometro nel becher attraverso la pellicola di copertura (Figura 1). Accendere la piastra e impostato su high per 10 – 15 min.</li>
			<li>Quando la temperatura dei reagenti di recupero raggiunge 98 ° C, è possibile passare il controllo della temperatura della piastra riscaldante da alta a bassa per mantenere un lieve bollore. Non bollire più di 15 min.</li>
			<li>Nel frattempo, attenzione aprire la pellicola e mettere la griglia di lavaggio con fette dentro il reggente di recupero. Coprire il becher nuovamente e incubare per 15 min.</li>
			<li>Uso forcipe per togliere la rastrelliera dal Becher per un piatto di lavaggio riempita con 200 mL di dH2O e risciacquare per 15 s.</li>
			<li>Spostare il rack in un piatto di lavaggio contenente etanolo al 100% e lasciate riposare per 3 minuti togliere i vetrini e farli asciugare in un incubatore a 60 ° C per 10 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Applicare proteasi III<ol>
<li>Porre i vetrini sul rack macchia (Figura 1, destra). Aggiungere 5 gocce di proteasi III per coprire il tessuto. Accuratamente messo il rack nella barra di controllo umidità (Figura 1, sinistra) e inserire il vassoio del forno di ibridazione di 40 ° C. Incubare per 30 min.</li>
			<li>Rimuovere il portavetrini e rimettere il vassoio nel forno. Toccare le diapositive per rimuovere il liquido in eccesso, una diapositiva alla volta. Inserire la diapositiva in un rack di lavaggio e posizionare la cremagliera in un piatto di lavaggio riempita di dH2O. spostare il rack su e giù per lavare i vetrini per 3 - 5 volte.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ISH Assay
<ol><li>
Preparare i materiali
	<ol>
<li>Pre-riscaldare 50 x tampone di lavaggio in un incubatore a 40 ° C per 20 min. Mix 2,94 L di dH2O e 60 mL di 50 x tampone di lavaggio per fare il tampone di lavaggio 1X.</li>
		<li>Preparare soluzione colorazione ematossilina al 50% con l'aggiunta di 100 mL di ematossilina di Gill I per 100 mL di dH2O. Prepare 0,02% (p/v) ammoniaca acqua aggiungendo 1,43 mL di idrossido di ammonio N 1 a 250 mL di dH2O. Mix bene in un contenitore.</li>
		<li>Mettere le sonde e AMP 0 – 6 reagenti a RT 30 min prima dell'uso. Tenere il vassoio di controllo di umidità nel forno di ibridazione di 40 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Procedura di ISH Nota: Per esaminare l'espressione di Nf1 isoforme di splicing e calcolare la percentuale impiombata in valore (PSI) per esone 23a, tre diverse sonde ISH destinati a esone 23a-incluso isoforma, esone 23a-escluso isoforma o entrambe le isoforme sono usati (Figura 2 ). Le sonde sono usate su sezioni di tessuto adiacenti taglio. Per garantire la precisione del calcolo, è fondamentale che le sezioni di tre tessuto sono trattate esattamente lo stesso nei passaggi di rilevamento segnale, amplificazione e ibridazione.<ol>
<li>Sonda di ibridazione.<ol>
<li>Rimuovere le diapositive dal rack lavaggio e toccare il liquido in eccesso dalle diapositive. Porre i vetrini in rack macchia.</li>
			<li>Utilizzare una matita per marcare i vetrini con il nome di sonda. Mettere le diapositive di tessuto di cervello adiacenti taglio tre per essere ibridate insieme con tre diverse sonde di Nf1 (Figura 2). Eseguire i passaggi successivi nello stesso ordine delle diapositive.</li>
			<li>Aggiungere 4 gocce di sonda per coprire il tessuto. Fare questa una diapositiva alla volta per evitare che le sezioni dall'asciugarsi. Mettere la griglia di macchia nella barra di controllo di umidità e inserirla nel forno a 40 ° C per 2 h.</li>
			<li>Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio. Per ogni lavaggio, riempire il piatto di colorazione con 200 mL di tampone di lavaggio 1X e un rack di lavaggio in esso. Toccare il liquido in eccesso in una diapositiva di un tovagliolo di carta alla volta e inserire rapidamente nel rack lavaggio. Muoversi su e giù il portavetrini nel piatto per 3 – 5 volte per 2 minuti a TA.</li>
			<li>Per il secondo lavaggio, utilizzare il tampone di lavaggio fresco.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Amplificazione del segnale.<ol>
<li>Toccare il tampone di lavaggio in eccesso dalle diapositive e metterli nel rack macchia. Aggiungere 4 gocce di AMP 0 per coprire il tessuto. Mettere la griglia di macchia nella barra di controllo di umidità e inserirlo nel forno per 30 min a 40 ° C.</li>
			<li>Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio, come descritto in precedenza.</li>
			<li>Ripetere questo passaggio con AMP 1 – 6 seguendo l'ordine e la condizione della tabella 2. Lavare i vetrini due volte dopo ogni passaggio di ibridazione.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Rilevamento del segnale<ol>
<li>Toccare il tampone di lavaggio in eccesso dalle diapositive e metterli nel rack di macchia. Aggiungere 2 µ l di Fast Red B a 120 µ l di Fast Red (diluizione 1: 60) in un tubo del microcentrifuge. Mescolare bene e aggiungere per coprire completamente la sezione del tessuto. Nota: Il volume totale del rosso A / B mix si basa sul numero e le dimensioni delle sezioni del tessuto. Per una 0,75 '' x 0.75 ' zona, 120 µ l è sufficiente per una sezione. Utilizzare l'impasto entro 5 min ed evitare l'esposizione del mix alla luce diretta del sole o alla luce UV.</li>
			<li>Chiudere il vassoio e incubare per 10 min a RT. Remove la soluzione a un contenitore per rifiuti e immediatamente inserire le diapositive in un rack di lavaggio e mettere la griglia in un piatto di lavaggio riempito con acqua di rubinetto. Risciacquare con acqua fresca di rubinetto.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Colorazione di contrasto delle diapositive
	<ol>
<li>Estrarre il cestello di lavaggio da acqua di rubinetto e toccare rapidamente su carta assorbente per togliere l'acqua in eccesso. Inserite la griglia in un 50% ematossilina soluzione di colorazione e immediatamente spostare il rack su e giù più volte. Incubare per 2 minuti a TA.</li>
		<li>Trasferire il portavetrini nuovamente dentro il piatto di acqua del rubinetto. Lavare 3 – 5 volte spostando su e giù il rack e cambiando l'acqua fresca del rubinetto fino a quando le diapositive diventano chiare, mentre i tessuti di cervello rimangono viola.</li>
		<li>Spostare il rack in un recipiente contenente acqua ammoniaca 0,02%. Spostare il rack su e giù 2 – 3 volte fino a quando i tessuti diventano blu. Lavare i vetrini 3 – 5 volte con acqua fresca di rubinetto in un piatto di colorazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montaggio dei campioni
	<ol>
<li>Spostare il portavetrini dal piatto di colorazione in un incubatore a 60 ° C ed incubare per almeno 15 min fino a quando le diapositive sono completamente asciutte.</li>
		<li>Posto 40 µ l di soluzione di montaggio sulla diapositiva e attentamente porre un coprivetrino 24 x 50 mm sopra la sezione del tessuto. Aria secche diapositive per 30 minuti a TA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. analisi e raccolta dati
Nota: Utilizzare un scanner per diapositive per la scansione delle immagini a 40 ingrandimenti.
<ol><li>
Controlli positivi e negativi
	<ol>
<li>Per ogni esperimento, includono controlli positivi e negativi (Figura 3). Come un buon controllo positivo, il segnale dovrebbe essere visibile come punctate punti 20-40 ingrandimenti.</li>
		<li>Uso del Mouse (Mm) 1ZZ - PPIB - come controllo positivo. Questa sonda è destinato un comune gene housekeeping PPIB. Per il controllo negativo, un punto per ogni 20 celle visualizzazione sfondo colorazione al campo di 20 X microscopio è accettabile.</li>
		<li>Utilizzare la sonda DapB-1ZZ come controllo negativo. Questa sonda è destinato il gene batterico dapB. Queste sonde di controllo sono state utilizzate in molti ISH saggi19.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rilevamento del segnale e l'analisi di come i modelli di espressione di Nf1 esone 23a
	<ol>
<li>Come i segnali di ibridazione sono indicati come puntini punctate, contare i puntini manualmente. Il numero di punti è correlato con il livello delle trascrizioni che viene rilevato da una sonda specifica. Si noti che il numero di punti possa anche essere analizzato dal software di ImageJ o SpotStudio.</li>
		<li>Utilizzare tre sonde per ibridare ad esone 23a-contenenti, esone 23a-carente isoforme o trascrizioni di Nf1 totale (Figura 2). Le tre sonde non possono essere utilizzati contemporaneamente, è possibile utilizzare tre sezioni di tessuto cerebrale adiacente per ibridare ad ogni sonda.<ol>
<li>Per calcolare la percentuale impiombato in (PSI) per esone 23a, contare il numero di cellule e puntini in parecchie regioni del cervello. Per ogni area di interesse, contano più di 400 celle da diverse sub-regioni come indicato nella Figura 4.</li>
			<li>Raccogliere dati dalla stesse sub-regioni per ognuna delle tre sonde. Calcolare PSI come numero di punti per cella con la sonda di inclusione dell'esone 23a / (numero di punti per cella con la sonda l'inclusione dell'esone 23a + numero del puntino per cella con la exon23a saltando sonda) x 100%.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li>
<li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).</li>
<li>Cieply, B., Carstens, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+alternative+splicing+factors+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Functional roles of alternative splicing factors in human disease.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 6, 311-326 (2015).</li>
<li>Xiong, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+splicing.+The+human+splicing+code+reveals+new+insights+into+the+genetic+determinants+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA splicing. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease.</a> Science. 347, 1254806(2015).</li>
<li>Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+splice+variants+in+the+5%27UTR+of+Gtf2i+expressed+in+the+rat+brain%3A+alternative+5%27UTRs+and+differential+expression+in+the+neuronal+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Novel splice variants in the 5'UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5'UTRs and differential expression in the neuronal dendrites.</a> Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).</li>
<li>Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+quantification%3A+in+situ+analysis+of+transcriptome+and+pre-mRNA+alternative+splicing+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Nanomedicine+and+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).</li>
<li>Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamic+acid+decarboxylase+1+alternative+splicing+isoforms%3A+characterization%2C+expression+and+quantification+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain.</a> BMC Neuroscience. 15, 114(2014).</li>
<li>Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. R., Ast, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Are+Short+Exons+Flanked+by+Long+Introns+Defined+and+Committed+to+Splicing%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">How Are Short Exons Flanked by Long Introns Defined and Committed to Splicing?</a> Trends in Genetics. 32, 596-606 (2016).</li>
<li>Cassidy, A., Jones, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+in+situ+hybridisation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Developments in in situ hybridisation.</a> Methods. 70, 39-45 (2014).</li>
<li>Meshorer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+and+neuritic+mRNA+translocation+under+long-term+neuronal+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing and neuritic mRNA translocation under long-term neuronal hypersensitivity.</a> Science. 295, 508-512 (2002).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope+for+in+situ+detection+of+transcriptionally+active+human+papillomavirus+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li>
<li>Zhu, H., Hinman, M. N., Hasman, R. A., Mehta, P., Lou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neuron-specific+alternative+splicing+of+neurofibromatosis+type+1+pre-mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of neuron-specific alternative splicing of neurofibromatosis type 1 pre-mRNA.</a> Molecular and Cellular Biology. 28, 1240-1251 (2008).</li>
<li>Hinman, M. N., Sharma, A., Luo, G., Lou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibromatosis+type+1+alternative+splicing+is+a+key+regulator+of+Ras+signaling+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras signaling in neurons.</a> Molecular and Cellular Biology. 34, 2188-2197 (2014).</li>
<li>Nguyen, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibromatosis+type+1+alternative+splicing+is+a+key+regulator+of+Ras%2FERK+signaling+and+learning+behaviors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras/ERK signaling and learning behaviors in mice.</a> Human Molecular Genetics. 26, 3797-3807 (2017).</li>
<li>Zhou, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hu+proteins+regulate+alternative+splicing+by+inducing+localized+histone+hyperacetylation+in+an+RNA-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Hu proteins regulate alternative splicing by inducing localized histone hyperacetylation in an RNA-dependent manner.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, E627-E635 (2011).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-mediated+histone+modifications+regulate+alternative+splicing+in+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Calcium-mediated histone modifications regulate alternative splicing in cardiomyocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, E4920-E4928 (2014).</li>
<li>Adzemovic, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+Analysis+in+the+Rat+Central+Nervous+System+and+Peripheral+Lymph+Node+Tissue+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2016).</li>
<li>Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+In+Situ+Hybridization+using+Oligonucleotide+Probes+on+Paraformaldehyde-prefixed+Brain+of+Rats+with+Serotonin+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li>
<li>Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Ultrasensitive+In+Situ+Hybridization+Approach+to+Detect+Short+Sequences+and+Splice+Variants+with+Cellular+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution.</a> Molecular Neurobiology. , (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La presente comunicazione illustra l'uso di BaseScope RNA ISH per esaminare come i modelli di espressione nelle sezioni di cervello di topo. È dimostrato che giunzione esone-esone anti-senso sonde inferiore 50 nucleotidi possono indirizzare l'inclusione dell'esone e saltando le isoforme robustamente e specificamente. Inoltre, i segnali risultanti possono essere utilizzati per calcolare PSI di un esone alternativo.
Alcune variazioni sono state testate nella procedura. Ad esempio, sezioni di tes...

Splicing alternativo (AS) è un processo comune che si verifica durante la maturazione del pre-mRNA. In questo processo, un esone possa essere incluse differenzialmente nel mRNA maturo. Così, attraverso AS, un gene può generare molti mRNA che codificano per prodotti proteici differenti. Si stima che 92 – 94% dei geni umani sottoposti a1,d'impionbatura alternativa2. Modelli di splicing alternativo che anormale è derivato da mutazioni genetiche sono state collegate a un gran numero di malattie, tra cui la sclerosi laterale amiotrofica, la distrofia miotonica e cancro3,4. È dunque fondamentale per studiare e comprendere meglio i meccanismi regolatori d'impionbatura alternative nel tentativo di trovare nuovi trattamenti delle malattie umane.
COME spesso è regolata in modo specifico del tipo di cella. È importante determinare il pattern di espressione AS di un gene specifico in un determinato sistema biologico. Tuttavia, questo diventa complicato quando un organo complesso che contiene molti tipi diversi di cellule, come il cervello o del cuore, è studiato. In questo caso, la scelta ideale del sistema di dosaggio è RNA in situ ibridazione (ISH usando il tessuto) sezioni così il modello di espressione AS di un gene specifico può essere rilevato in molti tipi cellulari contemporaneamente. Infatti, sonde essone-specific sono stati utilizzati per valutare i livelli di espressione di un'alternativa dell'essone5,6,7. Tuttavia, questo approccio non è adatto come analisi di modelli per i seguenti motivi. Primi, ISH i metodi convenzionali di solito uso sonde più di 300 bp, mentre la dimensione media degli esoni interni dei vertebrati (non primo o l'ultimo esone) è di 170 nucleotidi8,9. In secondo luogo, quando una sonda essone-specific è utilizzata per esaminare il pattern d'impionbatura di un esone alternativo interno, la sola isoforma di mRNA rilevata dalla sonda è quello che contiene l'esone, mentre l'isoforma di mRNA senza l'esone non può essere rilevato. Così, il calcolo della percentuale impiombata nel rapporto (PSI) dell'esone alternativo è complicato. Inoltre, ISH fluorescenti convenzionali spesso combina ISH con immunostaining, che riduce l'efficienza di rivelazione e la robustezza. Ad esempio, in uno studio che ha analizzato l'indotta da stress splicing isoforma di commutazione dell'acetilcolinesterasi (AChE) mRNA, digossigenina fu incorporata la sonda ISH e rilevato usando l'anticorpo anti-digossigenina. In alternativa, la sonda marcata con biotina è stato rilevato da un coniugato di fosfatasi alcalina/streptavidina e un substrato per la fosfatasi alcalina10. Nessun metodo utilizza qualsiasi strategia di amplificazione per aumentare la sensibilità di rilevazione. Di conseguenza, è difficile da rilevare trascritti di mRNA che sono espressi a livelli bassi. Così, un sistema di dosaggio più semplice e più affidabile di ISH è necessario analizzare come espressione modelli in situ.
BaseScope recentemente è stato sviluppato sulla base della piattaforma di RNAscope, una consolidata e ampiamente usato sistema di dosaggio ISH. Entrambi i sistemi di analisi utilizzano una tecnologia di amplificazione specifica della destinazione che aumenta la sensibilità di rilevazione11,12. Ciò che distingue uno da altro è la lunghezza della sequenza di destinazione, che è più breve 50 nucleotidi per BaseScope e 300 – 1.000 nucleotidi per RNAscope. Così, è possibile per le sonde di progettazione destinati a giunzioni esone-esone per rilevare specifiche isoforme di mRNA alternativi. Nello studio corrente, è stata predisposta una procedura per esaminare come modelli di espressione di neurofibromatosi tipo 1 (Nf1) esone 23a, un esone alternativo ampiamente studiato nel laboratorio stesso13,14,15 , 16 , 17, nelle sezioni del cervello del mouse. I risultati dimostrano che BaseScope è un sistema ideale per studiare i modelli di espressione di Nf1 esone 23a in situ. Come questo sistema di dosaggio può essere adattato per analizzare come i modelli di espressione degli esoni alternativi molti, rappresenta un nuovo e potente strumento negli studi di As.

<table><tbody><tr><td>EquipmentForno di</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ibridazione</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>241000ACD</td><td></td></tr><tr><td>Vassoio per il controllo dell'umidità (con coperchio)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310012</td><td></td></tr><tr><td>Portamacchie</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310017</td><td></td></tr><tr><td>Piastra riscaldante</td><td>Fisher Scientific</td><td>1160049SH</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore per uso generico Imperial III</td><td>Scanner per vetrini Lab-Line</td><td>302</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>SCN400</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit di pretrattamento</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>322381</td><td></td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2000899</td><td></td></tr><tr><td>Protease III*</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2000901</td><td></td></tr><tr><td>10x Target Retrieval</td> Advanced <td>Cell Diagnostics</td><td>2002555</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Detection Reagent Kit</td> Advanced <td>Cell Diagnostics</td><td>332910</td><td></td></tr><tr><td>Diagnostica avanzata delle celle</td><td>AMP 0</td><td>2001814</td><td></td></tr><tr><td>Diagnostica avanzata delle celle</td><td>AMP 1</td><td>2001815</td><td></td></tr><tr><td>Diagnostica avanzata delle celle</td><td>AMP 2</td><td>2001816</td> Diagnostica avanzata delle celle AMP 3 2001817 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diagnostica avanzata delle celle</td><td>AMP 4</td><td>16229B</td><td></td></tr><tr><td>AMP 5-RED</td><td>Diagnostica avanzata delle celle</td><td>16229C</td><td></td></tr><tr><td>AMP 6-RED</td><td>Diagnostica avanzata delle celle</td><td>2001820</td><td></td></tr><tr><td>Fast RED-A</td><td>Diagnostica avanzata delle celle</td><td>2001821</td><td></td></tr><tr><td>Fast RED-B</td><td>Diagnostica avanzata delle celle</td><td>16230F</td><td></td></tr><tr><td>50x Wash Buffer</td><td>Diagnostica avanzata delle celle</td><td>310091</td><td></td></tr><tr><td>Sonda di controllo negativo - Mouse DapB-1ZZ</td><td>Diagnostica cellulare avanzata</td><td>701021</td><td></td></tr><tr><td>Sonda di controllo positivo - Mouse (mm)-PPIB-1ZZ</td><td>Diagnostica cellulare avanzata</td><td>701081</td><td></td></tr><tr><td>Pellet di cellule 3T3 Slide-mouse 3T3</td><td>Diagnostica cellulare avanzata</td><td>310045</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</ strong</td></tr><tr><td>>Altre forniture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carta umidificante</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310015</td><td></td></tr><tr><td>Washing Rack</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>9837976</td><td></td></tr><tr><td>Lavare i piatti</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>LWS20WH</td><td></td></tr><tr><td>Penna barriera idrofobica</td><td>Vector Laboratory</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini Fisher</td><td>Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Coperchio in vetro, 24 mm x 50 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12--545-F</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di ammonio</td><td>Fisher Scientific</td><td>002689</td><td></td></tr><tr><td>100% etanolo (EtOH)</td><td>Decon Labs</td><td>2805</td><td></td></tr><tr><td>soluzione di formalde</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF94-4</td><td></td></tr><tr><td>Ematossilina I</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>17012359</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio</td><td>Vector Labs</td><td>H-5000</td><td></td></tr><tr><td>Xilene</td><td>Fisher Scientific</td><td>173942</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi quantitativa di impionbatura alternativo pre-mrna nelle sezioni del cervello del mouse usando analisi di rna in situ di ibridazione

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Splicing alternativo (AS) si verifica in oltre il 90% dei geni umani. Il pattern di espressione di un esone alternativamente impiombato spesso è regolato in modo specifico del tipo di cella. COME espressione di modelli in genere vengono analizzati mediante RT-PCR e RNA-seq utilizzando campioni di RNA isolato da una popolazione di cellule. In situ esame di come modelli di espressione per una particolare struttura biologica può essere effettuato da RNA in situ di ibridazione (ISH) usando le sonde essone-specific. Tuttavia, questo uso particolare di ISH è stato limitato poiché esoni alternativi sono generalmente troppo brevi per la progettazione di sonde essone-specific. In questo rapporto, l'uso di BaseScope, una tecnologia sviluppata di recente che si avvale di corti oligonucleotidi antisenso in RNA ISH, è descritto per analizzare come i modelli di espressione nelle sezioni di cervello di topo. Esone 23a di neurofibromatosi di tipo 1 (Nf1) viene utilizzato come esempio per illustrare che sonde di giunzione esone-esone breve mostrano segnali di ibridazione robusto con elevata specificità nell'analisi di RNA ISH su sezioni di cervello di topo. Ancora più importante, i segnali rilevati con sonde specifiche inclusione e saltando essone utilizzabile per calcolare in modo affidabile la percentuale impiombata in valori di Nf1 esone 23a espressione in diverse aree anatomiche di un cervello di topo. Il protocollo sperimentale e metodo di calcolo per analisi sono presentati. I risultati indicano che BaseScope fornisce un nuovo e potente strumento per valutare come espressione modelli in situ.

BaseScope ISH è stata effettuata utilizzando tre diversi ceppi di topi: topi wild type CD1, topi wild type C57BL/6J e Nf123aIN/23aIN topi mutanti in background C57BL/6J, nel quale esone 23a è incluso in tutti i tipi di cellule come conseguenza di engineered della giuntura le mutazioni14,15.
Come primo passo, il sistema di analisi ISH è stato testato ...

È descritto un in situ (ISH) protocollo di ibridazione che utilizza brevi oligonucleotidi antisenso per rilevare modelli d'impionbatura alternativa pre-mRNA nelle sezioni del cervello del mouse.

Analisi quantitativa di impionbatura alternativo Pre-mRNA nelle sezioni del cervello del Mouse usando analisi di RNA In Situ di ibridazione

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello splicing alternativo del pre-mRNA. In particolare, fornisce un sistema di analisi robusto e sensibile per esaminare modelli di splicing alternativi in situ in fette di tessuto. Con questo metodo, lo splicing alternativo può essere analizzato simultaneamente in molti sottotipi contenuti in strutture biologiche complesse come il cervello di un topo.Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza sonde antistatiche a giunzione esone in urto nell'ibridazione in situ dell'mRNA per produrre segnali di ibridazione isoforma specifici. La tecnologia di amplificazione del segnale Building aumenta la sensibilità del rilevamento per fornire robusti segnali di ibridazione. I segnali rilevati erano l'inclusione dell'esone che sfugge a sonde specifiche che vengono utilizzate per calcolare la percentuale di splicing nei parametri vitali in diverse aree anatomiche del cervello di un topo.In questo studio l'esone 23a di NF1 viene utilizzato come esempio per illustrare l'uso del sistema di analisi. Tuttavia, il sistema può essere adattato per analizzare i modelli di espressione di molti esoni alternativi. Per iniziare la paraffinazione della sezione D del cervello di topo, riempire due piatti con 250 millilitri di xilene.E altri due con 250 millilitri di etanolo al 100% all'interno di una cappa aspirante. Inserire i vetrini in tessuto in un cestello per il lavaggio. Quindi, posizionare il cestello in un piatto contenente xilene e incubare per cinque minuti muovendo il cestello su e giù almeno tre volte e ripetere con il secondo piatto di xilene.Quindi posizionare la griglia in una capsula contenente etanolo e incubare per due minuti con gli stessi movimenti su e giù, quindi ripetere con la seconda capsula a etanolo. Per asciugare i vetrini, spostare la griglia dal secondo piatto di etanolo e posizionarlo all'interno di un'incubatrice a 60 gradi Celsius per cinque minuti. Usa una penna barriera idrofobica per disegnare una barriera di 0,75 pollici per 0,75 pollici attorno alla sezione del tessuto e asciuga all'aria per tre minuti a temperatura ambiente.Accendi il forno di ibridazione e imposta la temperatura a 40 gradi Celsius. Dopo aver bagnato completamente la carta umidificante con acqua distillata, metterla in una vaschetta per il controllo dell'umidità. Quindi inserire la vaschetta di controllo dell'umidità nel forno di ibridazione.Dopo aver posizionato i vetrini essiccati su un banco, coprire completamente le sezioni di tessuto su ciascun vetrino con cinque-otto gocce di soluzione di perossido di idrogeno. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Picchiettare i vetrini su una carta assorbente, uno alla volta per rimuovere la soluzione di perossido di idrogeno e inserire i vetrini in un cestello di lavaggio.Immergere il cestello in una bacinella contenente acqua mentre lo si muove su e giù da tre a cinque volte per lavare i vetrini. Riempire un bicchiere di vetro da un litro posto su una piastra calda con 700 millilitri di trattamento di rimozione del bersaglio 1X e coprirlo con un foglio. Inserire un termometro attraverso il coperchio di alluminio e accendere la piastra riscaldante, impostata su alta temperatura per 10-15 minuti.Una volta che la temperatura del reagente di recupero raggiunge i 98 gradi Celsius, impostare la piastra riscaldante a bassa temperatura per mantenere una condizione di ebollizione lieve. Quindi, rimuovere con cautela la pellicola e posizionare la griglia all'interno del bicchiere. Coprire il becher con un foglio di alluminio e incubare per 15 minuti.Utilizzare una pinza per trasferire il rack dal becher a una piastra di lavaggio contenente 200 millilitri di acqua distillata e incubare per 15 secondi. Dopo 15 secondi, mettere il rack in una piastra contenente etanolo al 100% e incubare per tre minuti. Togliere la griglia dalla pirofila e asciugare a 60 gradi Celsius per 10 minuti.Dopo aver posizionato i vetrini su una rastrelliera per macchie, coprire le sezioni di tessuto con cinque gocce di proteasi 3 per vetrino. Posizionare con cautela la griglia nella teglia per il controllo dell'umidità e inserire la teglia nel forno di ibridazione e incubare a 40 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo aver rimosso la griglia dal vassoio, picchiettare i vetrini per rimuovere il liquido in eccesso e inserirli in un cestello per il lavaggio.Posizionare la griglia in una teglia contenente acqua distillata e spostare la griglia su e giù da tre a cinque volte per lavare i vetrini. Per prepararsi all'ibridazione in situ, incubare le sonde e i reagenti AMP a temperatura ambiente per 30 minuti. Inserire la vaschetta di controllo dell'umidità nel forno di ibridazione e impostare a 40 gradi Celsius.Per l'ibridazione della sonda, rimuovere i vetrini dal cestello di lavaggio e picchiettarli per rimuovere il liquido in eccesso. Posizionare i vetrini su una rastrelliera per macchie. Utilizzare una matita per etichettare le diapositive con il nome della sonda.Posizionare tre vetrini di tessuto cerebrale tagliati adiacenti da ibridare con tre diverse sonde di mitosi neurale di tipo uno. Poiché esistono sonde specifiche per isoforme molto diverse, utilizzo sezioni di tessuto tagliate adiacenti. È fondamentale che queste sezioni siano trattate esattamente allo stesso modo nelle fasi di ibridazione, amplificazione e rilevamento del segnale per garantire l'accuratezza della giunzione percentuale nel calcolo.Coprire le sezioni di tessuto con quattro gocce di sonda per sezione, un vetrino alla volta per evitare che le sezioni si secchino. Quindi posizionare la griglia antimacchia nella vaschetta per il controllo dell'umidità e inserirla nel forno a 40 gradi Celsius per due ore. Quindi, posizionare uno stendibiancheria in una pirofila riempita con 200 millilitri di tampone di lavaggio 1X.Quindi picchiettare ogni vetrino, uno alla volta su un tovagliolo di carta per rimuovere il liquido in eccesso. E inserire immediatamente ogni vetrino nel cestello di lavaggio. Incubare a temperatura ambiente per due minuti in una pirofila riempita con un tampone di lavaggio fresco mentre si sposta il cestello su e giù da tre a cinque volte, quindi ripetere il lavaggio in un nuovo piatto.Per l'amplificazione del segnale, picchiettare ogni vetrino per rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso e posizionarli su uno scolamacchie. Coprire la sezione di tessuto su ciascun vetrino con quattro gocce di reagente AMP zero. Quindi, posizionare la griglia nella teglia per il controllo dell'umidità, inserire la teglia nel forno e incubare a 40 gradi Celsius per 30 minuti.Lavare il vetrino due volte con un tampone di lavaggio come precedentemente fatto in questo esperimento. Ripetere la fase di amplificazione del segnale con i reagenti AMP da uno a sei, come descritto nel protocollo di testo, e lavare i vetrini dopo ogni passaggio. Per il rilevamento del segnale, rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso dai vetrini picchiettandoli e posizionarli su una griglia antimacchia.Quindi, mescolare due microlitri di rosso B veloce con 120 microlitri di rosso A veloce in una provetta da microcentrifuga. Aggiungere la soluzione alle sezioni di tessuto su ogni vetrino per coprirle completamente. Posizionare la griglia antimacchia nella vaschetta per il controllo dell'umidità, coprire la teglia e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.Quindi rimuovere la soluzione e inserire i vetrini in un cestello per il lavaggio. Posizionare la griglia in una bacinella contenente acqua di rubinetto per lavare i vetrini e ripetere il lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, picchiettare su carta assorbente per rimuovere l'acqua in eccesso.Quindi, posizionare la griglia in un piatto contenente il 50% di soluzione colorante con ematossilina. Spostare il rack su e giù più volte. E incubare per due minuti a temperatura ambiente.Trasferire la griglia in una leccarda contenente acqua di rubinetto. Spostare il cestello su e giù cinque volte e ripetere il lavaggio fino a quando i vetrini diventano chiari, mentre le sezioni di tessuto rimangono viola. Quindi trasferire la griglia in un piatto contenente lo 0,02% di acqua di ammoniaca.Spostare il rack su e giù da due a quattro volte finché le sezioni non diventano blu. Lavare i vetrini con acqua di rubinetto da tre a cinque volte nella vaschetta per la colorazione. Quindi, posizionare il rack all'interno di un'incubatrice e incubare per 15 minuti a 60 gradi Celsius per asciugare i vetrini.Quando è completamente asciutto, aggiungere una goccia di mezzo di montaggio su ogni vetrino per coprire la fetta. Quindi, posizionare con cura un vetrino coprioggetti di 24 x 50 millimetri sulle sezioni di tessuto su ciascun vetrino. Dopo aver asciugato i vetrini all'aria per 30 minuti a temperatura ambiente, procedere con la raccolta dei dati.Per calcolare la percentuale di splicing in o valore PSI per l'esone 23a, vengono contati il numero di cellule e punti in tre sottoregioni della corteccia e l'ippocampo CA3. Il saggio di ibridazione dell'RNA in situ viene eseguito in sezioni cerebrali di topi CD1 wild type utilizzando tre diverse sonde specifiche per NF1. I punti puntati rossi osservati nelle sezioni della corteccia e dell'ippocampo, indicano segnali positivi per NF1 totale, specifiche per l'inclusione e sonde specifiche per il salto.I segnali ISH provenienti dalle tre sonde vengono quindi contati e utilizzati per calcolare il PSI. Il saggio di ibridazione dell'RNA in situ viene eseguito nella corteccia di topi C57 neri 6J wild type e di topi neri C57 6J mutanti in cui l'esone 23a è incluso in tutti i tipi di cellule. I punti puntati rossi osservati nella corteccia dei topi C57 neri 6J wild type, indicano segnali positivi da parte di NF1 totale, specifiche per l'inclusione e sonde specifiche per il salto.Nei topi neri 6J mutanti C57, segnali simili sono ottenuti da sonde totali e specifiche per inclusione NF1. Tuttavia, non viene rilevato alcun segnale quando si utilizza il salto di una sonda specifica, indicando che due sonde che mirano all'inclusione o al salto dell'esone sono altamente specifiche. Poiché per questa procedura non è ancora disponibile l'etichettatura multicolore sugli stessi vetrini di tessuto, vengono utilizzate sonde diverse sui diversi vetrini di tessuto.Per ottenere i valori di giunzione percentuali accurati, è importante utilizzare vetrini tagliati adiacenti e trattare i vetrini esattamente allo stesso modo durante questa procedura. A complemento di questa procedura ci sono misure come l'immunoistochimica, che possono essere eseguite per rispondere a ulteriori domande riguardanti la localizzazione e la funzione delle isoforme di splicing differenzialmente espresse.

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A causa della natura transitoria del pre-mRNA, può essere difficile da isolare e...

Un rapido ad alta velocità Metodo per ribonucleoproteine ​​Mapping (RNP) su Human pre-mRNA

Questo video mostra il rilevamento della sintesi dell'RNA del recettore della serotonina utilizzando sonde oligonucleotidiche nel tessuto cerebrale di ratto affetto da sindrome serotoninergica. Il protocollo include il pretrattamento tissutale, l'ibridazione della sonda e il rilevamento enzimatico per visualizzare e quantificare l'espressione dell'RNA del recettore della serotonina al microscopio.

Ibridazione in situ mediante sonde oligonucleotidiche per studiare l'espressione dell'RNA in sezioni cerebrali di ratto

Fonte: Jolly, S., et.al. Combinazione di ibridazione a doppia fluorescenza  in situ con immunomarcatura per il rilevamento dell'espressione di tre geni in sezioni cerebrali di topo. J. Vis. Exp. (2016). Questo video dimostra l'uso dell'ibridazione in situ a doppia fluorescenza per visualizzare l'espressione di due bersagli di RNA in sezioni cerebrali di topo. Il protocollo prevede il rilevamento sequenziale dell'RNA utilizzando sonde marcate con isotiocianato di fluoresceina e digossigenina,...

 Esecuzione dell'ibridazione in situ a doppia fluorescenza per rilevare l'espressione genica nelle sezioni cerebrali di topo

È stato dimostrato che la regolazione alternativa dello splicing contribuisce alla transizione epitelio-mesenchimale (EMT), un programma cellulare essenziale in vari processi fisiologici e patologici. Qui descriviamo un metodo che utilizza un modello EMT inducibile per il rilevamento di splicing alternativo durante l'EMT.

Rilevamento di splicing alternativo Durante epiteliale-mesenchimale transizione

L'ibridazione in situ dell'RNA (ISH) consente la visualizzazione degli RNA nelle cellule e nei tessuti. Qui mostriamo come la combinazione di RNAscope ISH con immunoistochimica o coloranti istologici possa essere utilizzata con successo per rilevare mRNA localizzati negli assoni in sezioni di cervelli di topo e umani.

Rilevazione di assoni localizzato mRNA nelle sezioni del cervello Utilizzando ad alta risoluzione<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione

Localizzare l'espressione genica in specifici tipi di cellule può essere difficile a causa della mancanza di anticorpi specifici. Qui descriviamo un protocollo per la tripla rilevazione simultanea dell'espressione genica combinando l'ibridazione in situ a doppia fluorescenza con l'immunocolorazione.

La combinazione di doppio Fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione con Immunolabelling per il rilevamento della Manifestazione di tre geni nel cervello di topo Sezioni

Qui si descrive un protocollo volto ad indagare l'impatto di aberrant splicing sulla resistenza ai farmaci nei tumori solidi e le neoplasie ematologiche. A questo scopo, abbiamo analizzato i profili trascrittomica dei modelli genitoriali e resistenti in vitro attraverso RNA-Seq e stabilito un metodo basato qRT-PCR per convalidare geni candidati.

Utilizzando RNA-sequenziamento per rilevare Novel Splice varianti correlati alla resistenza ai farmaci in<em&gt; In Vitro</em&gt; modelli di cancro

Qui abbiamo presentato un metodo di sequenziamento dell'mRNA a singola cellula multiplexed per profilare l'espressione genica nei tessuti embrionali del topo. Il metodo di sequenziamento dell'mRNA a singola cellula (scRNA-Seq) basato su droplet in combinazione con strategie di multiplexing può profilare singole cellule da più campioni contemporaneamente, riducendo significativamente i costi del reagente e riducendo al minimo gli effetti batch sperimentali.

Analisi del sequenziamento dell'mRNA a cella singola multiplexed delle cellule embrionali del topo

Lo splicing alternativo (AS) e la poliadenilazione alternativa (APA) espandono la diversità delle isoforme di trascrizione e dei loro prodotti. Qui, descriviamo i protocolli bioinformatici per analizzare i saggi di sequenziamento di massa dell'RNA-seq e 3' per rilevare e visualizzare AS e APA che variano in base alle condizioni sperimentali.

Identificazione di splicing alternativo e poliadenilazione in dati di RNA-seq

Abbiamo messo a punto un saggio di ibridazione in situ Duplex per mappare le isoforme del recettore dell'insulina IR-A e IR-B nel plesso coroideo murino, superando i limiti dei metodi tradizionali. Questo approccio ad alta risoluzione rivela l'espressione specifica dell'isoforma, offrendo nuove intuizioni sulla segnalazione dell'insulina cerebrale e sulle potenziali terapie mirate all'isoforma per i disturbi neurologici.

Visualizzazione precisa dei recettori dell'insulina A e B nel cervello murino con un test di ibridazione in situ dell'RNA

Questo protocollo fornisce una pipeline computazionale semplificata per quantificare le trascrizioni dei potenziatori nascenti. Integrando l'accessibilità della cromatina, le caratteristiche della cromatina e i dati trascrizionali, consente un rilevamento accurato e un'analisi specifica del filamento dell'attività dell'enhancer in regioni intrageniche complesse, pur rimanendo accessibile ai ricercatori senza un'ampia formazione in bioinformatica.

Una pipeline computazionale per la quantificazione dell'RNA dell'enhancer intergenico/intragenico nelle cellule staminali embrionali di topo

Impara l'analisi quantitativa dello splicing alternativo del pre-mRNA nel cervello del topo mediante ibridazione in situ con sonde antisenso. Questo metodo consente di rilevare pattern di splicing in diverse regioni cerebrali con elevata sensibilità.

Analisi quantitativa di impionbatura alternativo Pre-mRNA nelle sezioni del cervello del Mouse usando analisi di RNA In Situ di ibridazione (Video) | JoVE Journal

Analisi quantitativa di impionbatura alternativo Pre-mRNA nelle sezioni del cervello del Mouse usando analisi di RNA In Situ di ibridazione

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