Una piattaforma di Microphysiologic per grasso umano: Sandwich tessuto adiposo bianco

Questo metodo rivoluzionario ci permette, per la prima volta, di mantenere il grasso vivo e sano ex vivo per diverse settimane consecutive per lo studio della biologia adiposa. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il tessuto rimane stabile per otto settimane nella coltura, ricapitolando il microambiente adiposo, comprese le cellule di supporto stromale adipose native circostanti. Iniziare seminando l'ASC con una confluenza di circa l'80% nelle piastre di coltura tissutale.

Per ogni pozzetto di SWAT desiderato, seminare un pozzetto di coltura tissutale convenzionale e un pozzetto di dimensioni corrispondenti su una piastra di plastica per coltura tissutale rivestita PNIPAAm. Mantenere l'ASC in un terreno di coltura completo a 37 gradi Celsius e al 5% di CO2 per sei-otto giorni, cambiando il terreno ogni due giorni. Ventiquattro ore prima della semina SWAT, avvolgere il bordo del disco dello stantuffo di ciascun pistone per l'apparato di semina SWAT almeno due volte con nastro adesivo da laboratorio per evitare perdite della soluzione di gelatina.

In una cappa di biosicurezza disinfettata con etanolo, spruzzare un rack per provette coniche da 15 millilitri contenente provette coniche da 15 millilitri vuote e senza tappo, nonché ogni stantuffo avvolto con nastro adesivo con etanolo al 70%, posizionando ogni stantuffo in una provetta vuota man mano che viene disinfettato. Spruzzare rondelle metalliche da circa 6,3 grammi e posizionarle sulla rastrelliera insieme a un paio di pinze uncinate. Quindi chiudere l'anta dell'armadio e accendere la luce UV per facilitare l'asciugatura notturna e la sterilizzazione dei materiali dell'apparato di semina.

Quando le cellule raggiungono il 100% di confluenza e dimostrano un pattern striato, aggiungere 0,75 grammi di gelatina in polvere a 10 millilitri di HBSS. E bilancia il pH della soluzione con 100 microlitri di idrossido di sodio. Aggiungere la gelatina a bagnomaria a 75 gradi Celsius e agitare energicamente il tubo ogni cinque minuti fino a quando la polvere non si scioglie in soluzione.

Filtrare la soluzione di gelatina omogenea attraverso un filtro per siringa e applicare la gelatina sugli stantuffi. I bordi nastrati degli stantuffi serviranno da stampo mentre la gelatina si solidifica. Quando la gelatina si è solidificata, srotolare il nastro e utilizzare la pinza uncinata per rimuovere la gelatina dal bordo esterno dello stantuffo, facendo attenzione che la gelatina rimanente al centro dello stantuffo sia completamente livellata, per massimizzare il contatto con il foglio ASC.

Una volta che la gelatina è stata rimossa da tutti gli stantuffi, applicare delicatamente ogni stantuffo su una piastra ASC rivestita in PNIPAAm utilizzando le rondelle metalliche per appesantire gli stantuffi. Dopo un'incubazione di 1,5 ore a temperatura ambiente, trasferire le piastre in un bagno di acqua ghiacciata per altre 1,5 ore per completare la dissociazione del foglio cellulare dalla superficie della piastra rivestita in PNIPAAm. Quindi, pulire il fondo delle piastre rivestite PNIPAAm per rimuovere l'acqua non sterile.

Al ricevimento del tessuto adiposo umano, aggiungere il terreno di coltura cellulare fredda a una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri per coltura da seminare. E lavare tre volte ampi segmenti del tessuto adiposo in PBS sterile, rimuovendo quanto più PBS possibile tra un lavaggio e l'altro. Dopo l'ultimo lavaggio, utilizzare una pinza e un rasoio sterile per tritare grossolanamente il tessuto, rimuovendo il più possibile la vascolarizzazione e la fascia fino a quando la soluzione assume una consistenza liquida densa con il minor numero possibile di singoli segmenti visibili di tessuto adiposo bianco.

Una volta raggiunta la corretta consistenza del tessuto, utilizzare un puntale per micropipetta P1000 modificato per trasferire il volume appropriato di tessuto macinato in ciascuna provetta da 1,5 millilitri precedentemente preparata e mescolare brevemente il tessuto macinato con il terreno all'interno delle provette. Quindi, sostituire il terreno in ciascuna coltura ASC con un volume di soluzione di tessuto adiposo bianco e trasferire delicatamente gli stantuffi di gelatina nella miscela di tessuto adiposo bianco sulle piastre ASC di base. Esaminare i monostrati nelle piastre rivestite di PNIPAAm al microscopio per confermare il distacco cellulare e spostare le piastre sulla superficie di un blocco termico da 37 a 40 gradi Celsius nella cabina di biosicurezza.

Quindi aggiungere due o tre millilitri di terreno di coltura riscaldato per incubare le cellule e facilitare lo scioglimento della gelatina. Dopo 30 minuti rimuovere delicatamente gli stantuffi dalla superficie della piastra, coprire le colture con gli appositi coperchi delle piastre e posizionare le piastre nell'incubatore per colture cellulari. Quando la gelatina si è completamente liquefatta, aspirare e sostituire il terreno di coltura cellulare con il volume appropriato di terreno M199 privo di rosso fenolo integrato con insulina, desametasone e antibiotici.

Nell'arco di 7,5 settimane di coltura, i cluster SWAT rimangono fissati in posizione sul monostrato con solo lievi cambiamenti morfologici osservati nei singoli adipociti. La colorazione chiara con rosso Nilo dei cluster di adipociti uniloculare a due settimane di coltura dimostra che le cellule sono effettivamente adipociti con membrane intatte, piuttosto che artefatti, cisti o adipociti morti. La colorazione con ioduro di propidio di SWAT di 53 giorni e la colorazione Oil Red O di colture SWAT di 51 giorni confermano che gli adipociti mantengono la vitalità anche in momenti avanzati.

L'immunocitochimica dimostra l'appropriata espressione proteica attesa e la localizzazione dei marcatori degli adipociti maturi all'interno della SWAT e la PCR quantitativa indica l'espressione di geni chiave degli adipociti a livello trascrizionale. La valutazione della funzione endocrina del basilico indica che la secrezione di leptina di basilico dalle colture SWAT è stata rilevata da ELISA, e il rilascio di glicerolo può anche essere indotto in risposta alla stimolazione chimica. Lo xenotrapianto di adipociti coltivati con SWAT rivela depositi di grasso chiaramente visibili e prontamente recuperati 10 giorni dopo il trapianto che colorano i marcatori adipocitari umani ma non di topo.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in circa cinque ore se eseguita correttamente. È importante ricordare di elaborare rapidamente il tessuto primario per ridurre al minimo la morte cellulare. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la PCR quantitativa in tempo reale, l'immunocolorazione o i saggi funzionali per rispondere a ulteriori domande su come gli adipociti rispondono a vari farmaci o tossine.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la cultura SWAT come piattaforma stabile e affidabile per la tua ricerca sul tessuto adiposo. Non dimenticare che lavorare con il tessuto umano primario può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare i DPI adeguati e maneggiare il tessuto sotto le cappe di biosicurezza.