Name: Una piattaforma di Microphysiologic per grasso umano: Sandwich tessuto adiposo bianco (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Impara a mantenere il tessuto adiposo bianco umano in coltura per otto settimane con questo sistema microfisiologico sandwich. Questa piattaforma avanzata consente studi metabolici e ricerca farmacologica su adipociti primari.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori si desidera ringraziare il supporto istituzionale fornito da LSU Health Sciences Center, che ha finanziato il progetto.

Tutte le attività sono state effettuate in aderenza ai protocolli 8759 # e #9189, approvato dall'ufficio di LSUHSC-NO. IRB Tutto il lavoro animale è stato eseguito in aderenza al protocollo #3285 approvato dall'ufficio IACUC LSUHSC n.
1. semina di interposizione di strati delle cellule
Nota: Vedere la Figura 1.
<ol><li>CSTA seme al circa il 80% confluency in piastre di coltura tissutale (6cm o piastre da 6 pozzetti). Per ogni pozzetto di SWAT desiderato, seme 1 coltura convenzionale ben e 1 Pozzo di dimensione corrispondente sulla piastra di plastica rivestita con poly(N-isopropylacrylamide (pNIPAAm) di coltura del tessuto. Nota: Di conseguenza, una piastra a 6 pozzetti di SWAT richiederà semina di cellule su una piastra di coltura di tessuti standard da 6 pozzetti (strato di base) e una piastra 6 pozzetti rivestite di pNIPAAm coltura tissutale (strato superiore). piastre rivestite con pNIPAAm possono essere acquistati in commercio o prodotti in laboratorio12,13,14.</li>
	<li>Mantenere CSTA a 37 ° C e 5% CO2 in di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) completati con 10% FBS e 1 x penicillina/streptomicina. Cambiare supporto ogni 2 giorni.</li>
	<li>Permettono che le cellule a fondersi fino a quando non diventano 100% confluenti e prendere su un reticolo striato (circa 6 – 8 giorni). Nota: Queste cellule dovrà funzionare come un foglio di singola cellula intatta al fine di stabilizzare il tessuto adiposo capace di galleggiare. Al momento di semina con WAT saranno frammento cellule insufficientemente confluenti.</li>
</ol>2. preparazione della SWAT forniture
<ol><li>Preparare diverse aliquote di 10 mL di 1 x matassa equilibrato sale soluzione (HBSS); preparare abbastanza per il numero di piastre con volume di ricambio desiderato.</li>
	<li>
Preparare l'apparato di stantuffo per la semina di SWAT. Costruire lo stantuffo con semplice plastica acrilica composta da uno stelo collegato a un disco rotondo. Assicurarsi che si inserisce all'interno della circonferenza dei pozzi di coltura del tessuto (diametro: < 6 cm per piatto di 6cm, < 3,5 cm per piastra a 6 pozzetti; massa approssimativa: 6,7 g per un piatto di 6 cm, 5,1 g su una piastra a 6 pozzetti).
	<ol>
<li>Preparare i tuffatori supplementare per garantire che la procedura verrà eseguito senza problemi in caso che c'è un problema con qualsiasi stantuffo individuo.</li>
		<li>Avvolgere nastro di laboratorio intorno al bordo del disco lo stantuffo, almeno 2 x, per impedire la fuoriuscita della soluzione di gelatina.</li>
		<li>Spruzzare un armadio di sicurezza biologica (BSC) con 70% EtOH. Spray giù un rack di tubo conico da 15 mL all'interno il BSC con provette coniche da vuoto, scoperchiata 15ml; tubi per proteggere il posizionamento dei tuffatori gelatina.</li>
		<li>Spruzzare ogni stantuffo nastro avvolto accuratamente con 70% EtOH e posto in una provetta conica da 15mL sulla cremagliera. Spruzzare le rondelle di metallo (massa approssimativa 6,3 g) e metterli sul rack insieme ad un paio di pinze uncinate; le rondelle aggiungerà peso per i tuffatori durante la semina di SWAT.</li>
		<li>Chiudere il battente BSC e accendere il UV luce per facilitare l'asciugatura e sterilizzazione. Nota: Idealmente, condurre questo passaggio 24 h prima della semina di SWAT. In alternativa, eseguire il processo il giorno di tessuto collezione/SWAT semina; in questo caso, tuttavia, consentire 15 – 45 min per asciugatura e sterilizzazione UV.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparazione della gelatina tuffatori — applicazione per fogli di cellula superiore
<ol><li>Riscaldare un bagno di acqua a 75 ° C.</li>
	<li>
Preparare la soluzione di gelatina aggiungendo 0,75 g di gelatina in polvere per 10 mL di brodo di 1 x HBSS. Sotto cappa aspirante aggiungere 100 µ l di 1 M NaOH per equilibrare il pH della soluzione.
	<ol>
<li>Aggiungere le scorte di 10 mL per il bagno di acqua e agitare vigorosamente ogni 5 min fino a quando la polvere si scioglie in soluzione. Mirano a sciogliere la gelatina in polvere presto dopo l'aggiunta al bagno d'acqua riscaldata.</li>
		<li>Accendere il ventilatore BSC, spegnere la luce UV e sollevare il telaio. Spruzzare la superficie BSC e preparare il filtro forniture (siringhe luer-lock 5ml e filtri per siringa 0,2 µm). Preparare più filtri per la tensione in modo efficiente sufficienti volumi di gelatina per applicare a stantuffi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quando la soluzione di gelatina non raggiunge una consistenza omogenea, filtrare la soluzione e applicarlo per i tuffatori. Caricare la siringa con gelatina. Applicare la gelatina per i tuffatori di plastica attraverso il filtro della siringa (~2.5 mL per una piastra a 6 pozzetti, ~4.5 mL per un piatto di 6 cm) e lasciare per solidificare (~ 20 min).</li>
	<li>Una volta che la gelatina è solida, scartare il nastro dal bordo dei tuffatori. Con il forcipe uncinato, rimuovere la gelatina dal bordo esterno del pistone (cioè, i bordi sollevati del menisco). Assicurarsi che la gelatina restante nel centro dello stantuffo sia completamente a livello per massimizzare il contatto con lo strato ADSC.</li>
	<li>Una volta che la gelatina in eccesso viene rimosso, applicare delicatamente i tuffatori di gelatina alle piastre rivestite con pNIPAAm ADSC. Utilizzare le rondelle di metallo per pesare giù lungo lo stantuffo. Non tosare strati delle cellule durante l'applicazione i tuffatori.</li>
	<li>
Lasciare i tuffatori sui fogli delle cellule per 1,5 h a temperatura ambiente. Incubare le piastre/stantuffi in un bagno di acqua ghiacciata per 1,5 h per completare la dissociazione dello strato di cellule dalla superficie della placca pNIPAAm-rivestito.
	<ol>
<li>Prestare attenzione durante l'incubazione in bagno di ghiaccio; non lasciare che il bagno di ghiaccio contaminare il media delle cellule durante l'incubazione.</li>
		<li>Al termine dell'incubazione, pulire il fondo delle piastre rivestite con pNIPAAm per rimuovere l'acqua non sterile.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. elaborazione del tessuto adiposo bianco
<ol><li>Quando si raccolgono tessuto adiposo umano dalla sala operatoria, è possibile mantenere tutti i campioni in un contenitore sterile che è il ghiaccio fino a SWAT è quello di essere seminato. Aggiungere mezzi di manutenzione sterile, ad esempio tampone fosfato salino (PBS), contenitore di tessuto adiposo per la stabilità dei tessuti.</li>
	<li>Aggiungere cella fredda di coltura per provette per microcentrifuga da 1,5 mL per ogni pozzo/piatto di essere seminato (100 µ l per una piastra a 6 pozzetti, 200 µ l per un piatto di 6 cm).</li>
	<li>
Tritare il tessuto adiposo.
	<ol>
<li>Per segmenti di tessuto adiposo solido, procedere come segue.<ol>
<li>Lavare grandi segmenti del tessuto adiposo 3 x in PBS sterile e rimuovere quanto più PBS come possibile.</li>
			<li>Grossolanamente tritate tessuto con forcipe e rasoio sterile e rimuovere quanto più sistema vascolare e la fascia come possibile (vedi discussione per maggiori dettagli).</li>
			<li>Tritare finemente il grasso con il rasoio fino a quando macinata tessuto assume consistenza liquida. Nota: Idealmente tessuto apparirà omogeneo con nessun visibili singoli segmenti di WAT anche se questo non è sempre possibile.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Processo eseguito come segue.<ol>
<li>Sotto il BSC, nastro di garza sterile sulla cima di un becher e porre questo Becher in un bicchiere più grande per raccogliere il liquido in eccesso.</li>
			<li>Utilizzando una pipetta sierologica di 25 mL, disegnare tanto lipoaspirato come necessario e applicarlo alla superficie della garza sterile. Applicare PBS direttamente a questa superficie per lavare lipoaspirated grasso e rimuovere il sangue in eccesso e dei residui del lipido.</li>
			<li>Utilizzare pinze per recuperare dei tessuti drenati, trasferirlo in una superficie di macinazione sterile e tritare il lipoaspirato.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzare un rasoio sterile per tagliare l'estremità distale del p1000 puntali per trasferire macinato tessuto; Questo ridurrà la sollecitazione di taglio che può portare a lisi degli adipociti. Una volta raggiunta una consistenza adeguata del tessuto è possibile trasferire il volume desiderato del tessuto macinato per ogni provetta da 1,5 mL (300 – 400 µ l per piastra a 6 pozzetti, 500 – 600 µ l per piatto 6 cm). Mix tritato WAT e media brevemente nei tubi.</li>
	<li>
Prendere le piastre di base ADSC e decantare/aspirare i media. Sostituire il supporto con la miscela di WAT/media da ogni provetta da 1,5 mL.
	<ol>
<li>Rimuovere i tuffatori di gelatina dalle piastre rivestite con pNIPAAm delicatamente e applicarli alla miscela WAT sulle piastre ADSC base. Esaminare il monostrato delle piastre rivestite con pNIPAAm sotto un microscopio per confermare la separazione cellulare.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Impostare un blocco di calore a circa 37-40 ° C sotto il BSC. Con i tuffatori ancora al suo posto, è possibile spostare le piastre alla superficie del blocco termico. Aggiungere 2 – 3 mL di terreni di coltura riscaldato per incubare le cellule e facilitare la fusione della gelatina.</li>
	<li>Dopo circa 30 min, rimuovere delicatamente i tuffatori dalla superficie della placca. Sostituire i coperchi delle piastre di coltura del tessuto base e spostare in un'incubatrice di coltura cellulare. Una volta che la gelatina ha completamente liquefatto a 37 ° C, aspirare e sostituire mezzi di coltura delle cellule.</li>
	<li>Mantenere la SWAT a 37 ° C e 5% di CO2 nel medium M199 rosso fenolo-senza con insulina di 7 µM, 30 µM desametasone, 1x penicillina/streptomicina. Mantenere circa media di 2 mL per piastre da 6 pozzetti e 3 mL per piatti di 6 cm. Cambiare supporto ogni 2 giorni.</li>
</ol>5. SWAT Harvest
<ol><li>Preparare la collagenosi (0,5 mg/mL collagenosi, 500 adenosina nM, in PBS) aliquote in provette coniche da 15 mL (volume approssimativo di 10 mL). I tubi di congelare e conservare a-20 ° C.</li>
	<li>Qualsiasi terreno di coltura dalle cellule di aspirare, lavare 1x con PBS e quindi aspirare PBS. Preparare le aliquote di collagenasi di loro scongelamento in bagnomaria a 37 ° C. Nota: Idealmente, la soluzione di collagenasi raggiungerà 37 ° C; subito dopo, aggiungere del tessuto.</li>
	<li>
Aggiungere tutto il tessuto dalla piastra SWAT le aliquote individuali. SWAT utilizzando una scrapper sterile cella di raccolta e trasferirlo alle aliquote della collagenosi con una punta di pipetta p1000 di cut-off. Aggiungere tessuto direttamente le provette coniche da 15 mL contenente soluzione della collagenosi.
	<ol>
<li>In alternativa, incubare la miscela di tessuto/collagenasi in una provetta conica da 50 mL; alla superficie maggiore faciliterà ulteriormente la digestione enzimatica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inserire le provette campione in un agitatore orbitale incubato in un angolo di 45°. Incubare a 200 giri/min, a 37 ° C per 30 – 60 min.</li>
	<li>Posto a 250 µm filtro a rete in una nuova provetta conica 15 mL per raccolta. Versare la soluzione del adipocyte digerito attraverso il filtro. Nota: Questo permetterà tutte le celle di passare attraverso mentre filtrando il tessuto fibroso.</li>
	<li>Consentire il flusso-attraverso a riposare per 5 min a temperatura ambiente per consentire per separazione di fase. Nota: Gli adipociti galleggerà verso l'alto della soluzione, mentre le cellule stromale adipose (ASCs) si depositerà nelle fasi più bassa. Centrifugazione per 5 min a 500 x g può anche massimizzare la separazione cellulare o raccolto che circondano CSTA nel pellet.</li>
	<li>
Utilizzando un puntale di cut-off p1000, trasferire gli adipociti (il livello fluttuante nella superiore della soluzione della collagenosi) in una provetta di raccolta microcentrifuga da 1,5 mL. Prendere ~ 250 µ l in un momento, pipettare lentamente lungo il bordo della provetta per raccogliere gli adipociti.
	<ol>
<li>Ruotare lentamente il tubo mentre raccoglieva gli adipociti per massimizzare il recupero delle cellule aderenti all'interno. Tenere disegno più cellule fino a quando il tubo per microcentrifuga da 1,5 mL è completo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimuovere il liquido in eccesso da adipociti isolati utilizzando una siringa collegata ad un ago (~ 21). Immergere l'ago sotto il livello del adipocyte fluttuante. Agitare l'ago brevemente per rimuovere eventuali cellule aderenti all'albero dell'ago e quindi attendere che gli adipociti sloggiati a galleggiare verso l'alto.</li>
	<li>Disegnare lentamente il liquido in eccesso, facendo attenzione ad evitare la rimozione involontaria degli adipociti. Utilizzare graduazioni di tubo del microcentrifuge per isolare costantemente i volumi di campione (ad esempio,. 0,1 mL per ogni campione).</li>
	<li>Utilizzare le cellule isolate per estrazione DNA/RNA, analisi di assorbimento del glucosio, dosaggio di lipolisi, ecc.
</li>
</ol>

<ol><li>Cawley, J., Meyerhoefer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+medical+costs+of+obesity%3A+An+instrumental+variables+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Health+Economics%22%5BJournal%5D)">The medical costs of obesity: An instrumental variables approach.</a> Journal of Health Economics. 31 (1), 219-230 (2012).</li>
<li>Pi-Sunyer, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Medical+Risks+of+Obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Postgraduate+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Medical Risks of Obesity.</a> Postgraduate Medicine. 121 (6), 21-33 (2009).</li>
<li>Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+studies+of+human+subcutaneous+adipose+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Morphologic studies of human subcutaneous adipose tissue in vitro.</a> Anatomical Record. 169 (1), 97-104 (1971).</li>
<li>Sugihara, H., Yonemitsu, N., Miyabara, S., Yun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cultures+of+unilocular+fat+cells%3A+characteristics+of+growth+in+vitro+and+changes+in+differentiation+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Primary cultures of unilocular fat cells: characteristics of growth in vitro and changes in differentiation properties.</a> Differentiation. 31 (1), 42-49 (1986).</li>
<li>Sugihara, H., Yonemitsu, N., Toda, S., Miyabara, S., Funatsumaru, S., Matsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unilocular+fat+cells+in+three-dimensional+collagen+gel+matrix+culture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Unilocular fat cells in three-dimensional collagen gel matrix culture.</a> The Journal of Lipid Research. 29, 691-697 (1988).</li>
<li>Hazen, S. A., Rowe, W. A., Lynch, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+cell+culture+of+freshly+isolated+adipocytes+using+extracellular+basement+membrane+components%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Monolayer cell culture of freshly isolated adipocytes using extracellular basement membrane components.</a> The Journal of Lipid Research. 36, 868-875 (1995).</li>
<li>Fried, S. K., Kral, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+regional+distribution+of+fat+cell+size+and+lipoprotein+lipase+activity+in+morbidly+obese+patients%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Obesity%22%5BJournal%5D)">Sex differences in regional distribution of fat cell size and lipoprotein lipase activity in morbidly obese patients.</a> International Journal of Obesity. 11 (2), 129-140 (1987).</li>
<li>Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+National+Institutes+of+Health.+Microphysiological+Systems+Program+focuses+on+a+critical+challenge+in+the+drug+discovery+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">The National Institutes of Health. Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline.</a> Stem Cell Research and Therapy. 4, (2013).</li>
<li>Wikswo, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+and+potential+roles+of+microphysiological+systems+in+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">The relevance and potential roles of microphysiological systems in biology and medicine.</a> Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1061-1072 (2014).</li>
<li>National Institutes of Health. NIH-CASIS Coordinated Microphysiological Systems Program for Translational Research in Space (#RFA-TR-18-001). , Available from:
 <a target="_blank" href="https://grants.nih.gov/grants/guide/rfa-files/RFA-TR-18-001.html">https://grants.nih.gov/grants/guide/rfa-files/RFA-TR-18-001.html</a> (2017).</li>
<li>Lau, F. H., Vogel, K., Luckett, J. P., Hunt, M., Meyer, A., Rogers, C. L., Tessler, O., Dupin, C. L., St Hilaire, H., Islam, K. N., Frazier, T., Gimble, J. M., Scahill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sandwiched+White+Adipose+Tissue%3A+A+Microphysiological+System+of+Primary+Human+Adipose+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Sandwiched White Adipose Tissue: A Microphysiological System of Primary Human Adipose Tissue.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (3), (2018).</li>
<li>Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0969806X07000795">Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and 'smart' polymers.</a> Radiation Physics and Chemistry. 76, 1409-1413 (2007).</li>
<li>Lin, J. B., Isenberg, B. C., Shen, Y., Schorsch, K., Sazonova, O. V., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermo-responsive+poly%28N-isopropylacrylamide%29+grafted+onto+microtextured+poly%28dimethylsiloxane%29+for+aligned+cell+sheet+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).</li>
<li>Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Engineering%3A+Construction+of+a+Multicellular+3D+Scaffold+for+the+Delivery+of+Layered+Cell+Sheets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e51044(2014).</li>
<li>Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells%3A+Isolation%2C+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation.</a> Methods. 45 (2), 115-120 (2008).</li>
<li>Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrathin+poly%28N-isopropylacrylamide%29+grafted+layer+on+polystyrene+surfaces+for+cell+adhesion%2Fdetachment+control%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control.</a> Langmuir. 20 (13), 5506-5511 (2004).</li>
<li>Fried, S. K., Russell, C. D., Grauso, N. L., Brolin, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoprotein+lipase+regulation+by+insulin+and+glucocorticoid+in+subcutaneous+and+omental+adipose+tissues+of+obese+women+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Lipoprotein lipase regulation by insulin and glucocorticoid in subcutaneous and omental adipose tissues of obese women and men.</a> Journal of Clinical Investigation. 92 (5), 2191-2198 (1993).</li>
<li>Keipert, S., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brite%2Fbeige+fat+and+UCP1+-+is+it+thermogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Brite/beige fat and UCP1 - is it thermogenesis?</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (7), 1075-1082 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo dettaglia l'uso di CSTA panino la maggior parte del tessuto adiposo umano bianco; linee cellulari umane di ADSC possono essere isolate tramite protocolli ben stabiliti15. Tuttavia, il sistema può essere adattato per esigenze di ricerca individualizzata (ad esempio utilizzando cellule di 3T3L-1 al mouse panino WAT). Questo processo comporta la manipolazione del tessuto umano primario. Precauzioni di sicurezza standard dovrebbero essere impiegati; gestire tessuti umani come agenti ...

Il tessuto adiposo è l'organo primario dell'obesità, che trasporta annuali costi medici diretti tra $ 147 miliardi e $ 210 miliardi a US1. L'accumulo di tessuto adiposo contribuisce anche ad altre cause conducenti della morte come malattie cardiache, diabete di tipo II e alcuni tipi di cancro2. Modelli di coltura in vitro sono essenziali per gli studi metabolici e lo sviluppo di farmaci, ma i modelli attuali di ricerca di tessuto adiposo hanno carenze principali. Adipociti sono fragile, capace di galleggiare e cellule che non aderiranno alla plastica di coltura delle cellule e pertanto non possono essere coltivate utilizzando metodi di coltura cellulare convenzionale terminalmente differenziano. Dal 1970, diversi metodi sono stati utilizzati nei tentativi di superare queste barriere, compreso l'uso di vetrini coprioggetti, soffitto cultura, coltura di sospensione e matrici extracellulari3,4,5, 6 , 7. Tuttavia, questi metodi sono stati segnati da cellule morte e dedifferenziazione e vengono in genere utilizzati per non più di un periodo di studio di due settimane. Inoltre, questi modelli non tentare ricapitolare il microambiente adiposo nativo come non mantengono intatto ECM, le interazioni tra adipociti e stromal cellule di supporto, né le cellule contrattili forze esercitano sulla vicenda in in vivo WAT.
In assenza di un metodo di cultura adiposa primaria oro-standard, ricerca adiposa si affida principalmente differenziati pre-adipociti (diffAds). DiffAds sono multilocular, aderente e metabolicamente attivo. Al contrario, primari adipociti bianchi sono unilocular, nonadherent e dimostrano relativamente basso metabolismo. Il fallimento degli attuali modelli di cultura adiposa di ricapitolare la fisiologia del tessuto adiposo maturo sano è probabilmente un fattore importante in assenza di farmaci approvati dalla FDA che incidono direttamente adipocytes. Infatti, la mancanza di modelli di organo fisiologico in vitro è un grave problema in tutta la maggior parte dei organi e malattia.
Nel suo documento di posizione che annuncia la creazione del suo programma di Microphysiological Systems (MPS), il National Institutes of Health (NIH) ha riferito che il tasso di successo 2013 attraverso tutti gli studi clinici farmaceutici umani era solo 18% per la fase II e 50% per la fase III studi clinici8. Il programma MPS è progettato per affrontare direttamente l'incapacità di monocoltura in vitro di fisiologia umana modello. Il NIH definisce MPSs come sistemi di coltura composto umano primario o cellule staminali in costrutti 3D multicellulari che ricapitolano il funzionamento dell'organo. A differenza dei modelli riduzionisti di colture cellulari immortalizzate, omogenea, MPSs dovrebbe modellano accuratamente cellula-cellula, cellula farmaco, farmaco-farmaco e organo-droga interazioni9. A differenza dei metodi di coltura primaria a breve termine, NIH standard impongono sostenibilità MPS per 4 settimane in cultura8. Ulteriori dettagli del programma MPS possono essere trovati alla RFAs (#RFA-TR-18-001)10 di NIH.
Abbiamo sviluppato un semplice, romanzo, adattabile, e poco costoso MPS adiposo definito "Sandwich tessuto adiposo bianco" (SWAT)11. Superiamo la galleggiabilità naturale degli adipociti di "sandwiching" macinato primario del tessuto adiposo tra fogli di adiposo-ha derivato le cellule stromale (CSTA) (Figura 1). Il costrutto 3D risultante ricapitola il contatto cellula-cellula e il microambiente adiposo nativo circondando adipocytes maturi con una popolazione di cellule di supporto del adipocyte naturale. SWAT è stato convalidato da dimostrare 8-settimana sostenibilità, risposta alla segnalazione esogeno, secrezione di adipokine e attecchimento in un modello animale.

<table><tbody><tr><td>10x HBSS</td><td>Thermofisher</td><td>14185052</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A9251</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermofisher</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>M199 Media</td><td>Thermofisher</td><td>11043023</td><td>Fenolo senza rosso&nbsp;</td></tr><tr><td>250 &micro; m Filtro a rete</td><td>Pierce</td><td>87791</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &micro; m Siringa Filtro</td><td>Celltreat</td><td>229747</td><td></td></tr><tr><td>siringhe Luer-Lok da 5 ml&nbsp;</td><td>Rondelle</td><td></td> metalliche BD 309646 <td></td></tr><tr><td></td> Si tratta di semplici rondelle metalliche e possono essere acquistate in qualsiasi negozio di ferramenta.<td></td><td></td><td> Aggiungono semplicemente un peso ridotto alla parte posteriore dei tappi per garantire un contatto uniforme tra le cellule e la gelatina, pur essendo facili da conservare e sterilizzare. Massa approssimativa: 6,3 g</td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Attrezzatura riscaldata</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitatore orbitale incubato</td><td>VWR</td><td>10020-988</td><td>I campioni devono essere inclinati con un angolo di 45 gradi per facilitare la digestione della collagenasi</td></tr><tr><td>Blocco termico</td><td></td><td></td><td>Impostato su 37-40 &deg; C e posizionato sotto il</td></tr><tr><td>bagno</td><td></td><td></td><td>d'acqua della cabina di biosicurezza impostato a ~75 &deg; C</td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Specialized Plastics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Upcell Piatti 6cm di Nunc a 6 pozzetti</td><td></td><td>174902&nbsp; o 174901</td><td>Si tratta di piastre rivestite di pNIPAAm disponibili in commercio che possono essere utilizzate per far crescere il foglio superiore degli ADSC. In alternativa, le piastre rivestite di pNIPAAm possono essere prodotte in laboratorio. diametro: < 6 cm per piatto da 6 cm, < 3,5 cm per piastra a 6 pozzetti; Massa approssimativa: 6,7 g per piastre da 6 cm, 5,1 g per piastre a 6 pozzetti</td></tr><tr>Apparato <td></td><td></td> a<td>stantuffo in plastica</td><td>Questi possono essere modellati per adattarsi alle plastiche rivestite di pNIPAAm desiderate (piastre multipozzetto, piastre di Petri). Sono costituiti da un semplice stelo attaccato a un disco circolare. Possono essere prodotti in laboratorio o da qualsiasi struttura in grado di modellare plastiche acriliche</td></tr></tbody></table>

una piattaforma di microphysiologic per grasso umano: sandwich tessuto adiposo bianco

A Microphysiologic Platform for Human Fat: Sandwiched White Adipose Tissue

Tessuto adiposo bianco (WAT) svolge un ruolo cruciale nella regolazione della salute peso e tutti i giorni. Ancora, esistono limitazioni significative ai modelli disponibili colture primarie, i quali hanno fallito fedelmente ricapitolare il microambiente adiposo o estendere la vitalità WAT oltre due settimane. La mancanza di un modello affidabile coltura primaria ostacola gravemente ricerca nel WAT metabolismo e lo sviluppo di farmaci. A tal fine abbiamo utilizzato gli standard di NIH di un sistema di microphysiologic per sviluppare una nuova piattaforma per coltura primaria WAT chiamato 'SWAT' (Sandwich tessuto adiposo bianco). Superiamo la galleggiabilità naturale degli adipociti di interposizione macinate WAT cluster tra fogli di adiposo-ha derivato le cellule stromal. In questo costrutto, campioni WAT sono vitali oltre otto settimane nella cultura. SWAT mantiene l'ECM intatto, contatti cellula-cellula e pressioni fisiche delle condizioni in vivo WAT; Inoltre, SWAT mantiene un robusto profilo trascrizionale, sensibilità ai segnali chimici esogeni e funzione del tessuto intero. SWAT rappresenta un metodo semplice, riproducibile ed efficace della cultura adiposo primario. Potenzialmente, è una piattaforma ampiamente applicabile per la ricerca in fisiologia, fisiopatologia, metabolismo e sviluppo farmaceutico WAT.

Attuabilità della SWAT inizialmente è stata valutata da formazione immagine seriale campo chiaro di singoli WAT cluster (n = 12) circa 7,6 settimane. Cluster è rimasto protetti in posto su monostrato in tutto questo tempo. Lievi cambiamenti morfologici sono stati osservati con singoli adipociti orditura leggermente o posizioni di spostamento. Tuttavia, adipociti né diventano multilocular nel corso del tempo, che indica una mancanza di dedifferentiation, né fatto essi presentano segni visi...

Tessuto adiposo bianco (WAT) ha gravi lacune nei suoi modelli di cultura primaria corrente, ostacolando lo sviluppo farmacologico e gli studi metabolici. Qui, presentiamo un protocollo per produrre un sistema adiposo microphysiological di WAT sandwiching tra fogli di cellule stromali. Questo costrutto fornisce una piattaforma stabile e adattabile per colture primarie di WAT.

Una piattaforma di Microphysiologic per grasso umano: Sandwich tessuto adiposo bianco

White adipose tissue (WAT) plays a crucial role in regulating weight and everyday health.  Still, there are significant limitations to available primary ...

Questo metodo rivoluzionario ci permette, per la prima volta, di mantenere il grasso vivo e sano ex vivo per diverse settimane consecutive per lo studio della biologia adiposa. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il tessuto rimane stabile per otto settimane nella coltura, ricapitolando il microambiente adiposo, comprese le cellule di supporto stromale adipose native circostanti. Iniziare seminando l'ASC con una confluenza di circa l'80% nelle piastre di coltura tissutale.Per ogni pozzetto di SWAT desiderato, seminare un pozzetto di coltura tissutale convenzionale e un pozzetto di dimensioni corrispondenti su una piastra di plastica per coltura tissutale rivestita PNIPAAm. Mantenere l'ASC in un terreno di coltura completo a 37 gradi Celsius e al 5% di CO2 per sei-otto giorni, cambiando il terreno ogni due giorni. Ventiquattro ore prima della semina SWAT, avvolgere il bordo del disco dello stantuffo di ciascun pistone per l'apparato di semina SWAT almeno due volte con nastro adesivo da laboratorio per evitare perdite della soluzione di gelatina.In una cappa di biosicurezza disinfettata con etanolo, spruzzare un rack per provette coniche da 15 millilitri contenente provett

a-microphysiologic-platform-for-human-fat-sandwiched-white-adipose

Research

Ricerca

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

Grazie al collegamento drastica e negativa tra obesità e altre patologie concomitanti, la ricerca sul adiposo giochi di ruolo nella malattia e la salute generale è garantito. Presentiamo un protocollo per l'isolamento e l'escissione di depositi adiposi consentano lo studio della adiposo usare in situ e metodi in vitro.

Localizzazione, identificazione, e l&#39;escissione dei Depositi Murine adipose

Il metodo qui presentata utilizza 18 F-Fluorodeoxyglucose (18 F-FDG) tomografia ad emissione di positroni / tomografia computerizzata (PET-CT) e grasso-acqua separata risonanza magnetica (MRI), ciascuna scansione dopo 2 ore di esposizione a thermoneutral (24 ° C ) e freddo (17 ° C), al fine di mappare tessuto adiposo bruno (BAT) in soggetti umani adulti.

Umano Brown adipose Depositi tessuti segmentato automaticamente da Positron Emission Tomography / tomografia computerizzata e registrati Risonanza Magnetica Images

A causa del contenuto elevato del lipido, tessuto adiposo è stato impegnativo per visualizzare usando i metodi istologici tradizionali. Adipo-Clear è un tessuto tecnica che permette di etichettatura robusto e imaging fluorescente volumetrica ad alta risoluzione del tessuto adiposo di compensazione. Qui, descriviamo i metodi per la preparazione del campione, pretrattamento, colorazione, compensazione e montaggio per l'imaging.

Adipo-Clear: Un tessuto metodo di compensazione per l'Imaging tridimensionale del tessuto adiposo

Qui, presentiamo micro-frammentazione senza enzimi adiposi umani utilizzando un dispositivo di sistema chiuso. Questo nuovo metodo consente l'ottenimento di ammassi sub-millimetrici di tessuto adiposo adatto per il trapianto in vivo, la coltura in vitro e l'ulteriore isolamento e caratterizzazione delle cellule.

Tessuto Adiposo Umano Microframmentazione per la Fenotipizzazione Cellulare e la Caratterizzazione del Secretome

Questo protocollo descrive l'approccio tecnico per isolare sottopopolazioni di cellule stromali adipogeniche e fibro-infiammatorie da depositi di tessuto adiposo bianco (WAT) murino intra-addominale mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza o separazione di microsfere immunomagnetiche.

Isolamento di sottopopolazioni di cellule stromali adipogeniche e fibro-infiammatorie da depositi adiposi intra-addominali murini

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato che delinea l'uso di frammenti microvascolari isolati da roditori o tessuto adiposo umano come approccio diretto per progettare tessuto adiposo beige funzionale e vascolarizzato.

Coltura tridimensionale di tessuto adiposo termogenico vascolarizzato da frammenti microvascolari

Questo protocollo descrive l'isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale (SVF) dal tessuto adiposo murino per ottenere preadipociti e ottenere la differenziazione degli adipociti in vitro. L'uso di un dissociatore tissutale per la digestione della collagenasi riduce la variazione sperimentale e aumenta la riproducibilità.

Isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo bianco murino mediante un dissociatore tissutale

Qui, descriviamo un protocollo per isolare, coltivare e fenotipizzare le cellule endoteliali microvascolari dal tessuto adiposo sottocutaneo umano (hSATMVECs). Inoltre, descriviamo un modello sperimentale di cross-talk hSATMVEC-adipociti.

Studio del cross-talk tra cellule endoteliali adipose e adipociti nel tessuto adiposo sottocutaneo umano

Qui, presentiamo un protocollo in grado di trasformare il tessuto adiposo autologo in varie sostanze componenti adipose con diverse proprietà e funzioni fisico-chimiche.

Innovativo frazionamento del tessuto adiposo per trasformare il grasso in componenti specializzati

Utilizzando un modello ex vivo di espianti, piccoli pezzi della porzione rostrale del tessuto adiposo bianco viscerale di topi magri vengono coltivati per 7–10 giorni, permettendo l'induzione e lo studio dell'infiammazione del tessuto adiposo durante l'alimentazione ricca di grassi.

Un modello topino ex vivo per l'infiammazione del tessuto adiposo ad alto contenuto di grassi

Impara a mantenere il tessuto adiposo bianco umano in coltura per otto settimane con questo sistema microfisiologico sandwich. Questa piattaforma avanzata consente studi metabolici e ricerca farmacologica su adipociti primari.

Una piattaforma di Microphysiologic per grasso umano: Sandwich tessuto adiposo bianco

Esplora altri video