Rilevamento di localizzazione sottocellulare della proteina di verde fluorescenza della proteina Tagging e 4', 6-Diamidino-2-phenylindole macchiatura in Caenorhabditis elegans
30 luglio 2018
Questo protocollo viene illustrato come monitorare una traslocazione nucleare della proteina sotto stress da calore utilizzando una proteina di fusione di fluorescenza verde protein (GFP) come indicatore e 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) colorazione. Il protocollo di colorazione DAPI è veloce e preserva i segnali di localizzazione sottocellulare della proteina e GFP.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo di C.elegans, come la biologia cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è veloce ed efficiente nell'ottenere contemporaneamente segnali di colorazione nucleare, GFP e cambiamenti di localizzazione subcellulare. Per iniziare, generare un array extracromosomico allineato con un costrutto traduzionale di geni bersaglio.
In alternativa, è possibile ottenere tali linee dal Caenorhabditis Genetic Center, che è una risorsa pubblica per la ricerca su C.elegans. Oppure, da un laboratorio di ricerca precedentemente pubblicato. Dopo aver esposto i vermi alle radiazioni gamma per integrare le linee extracromosomiche nel genoma, selezionare le linee espresse stabilmente in modo che ogni animale esprima una proteina marcatrice come una GFP o un rullo.
Per rimuovere le mutazioni generate durante la radiazione, oltrepassare le linee almeno due volte. Utilizzare la linea transgenica risultante per rilevare i cambiamenti del modello di espressione proteica sotto stress. Successivamente, dopo aver preparato le piastre per vermi NGM secondo il protocollo di testo, striare un clone OP50 e coltivare i batteri in brodo LB liquido per una notte.
Semina le piastre NGM con coltura OP50 liquida e incuba le piastre in un'incubatrice a 37 gradi Celsius durante la notte per far crescere il prato batterico come fonte di cibo per i vermi. Raffreddare le piastre a temperatura ambiente per almeno 30 minuti prima dell'uso. Far crescere la linea transgenica a 20 gradi Celsius senza morire di fame, per almeno due generazioni prima del test dello stress termico.
Raccogli da otto a dieci giovani adulti gravidi in una nuova placca per vermi. Quindi lasciali deporre le uova per circa tre-cinque ore e rimuovi tutti gli adulti dai piatti. Per sincronizzare i vermi, lasciare che le uova si schiudano e far crescere le larve per circa 48 ore fino al quarto stadio larvale, o L4.
Questo può essere identificato dalla vulva, che è una struttura a mezzaluna. Quindi stressare i vermi incubando le piastre con le larve L4 a 35 gradi Celsius per due o cinque ore. Includi un termometro in un'incubatrice per misurare con precisione la temperatura.
Pipettare 10 microlitri di M9 al centro di un vetrino. Quindi raccogli i vermi termostati e trasferiscili nella goccia di buffer. In alternativa, usa M9 per lavare via i vermi dalla piastra.
Quindi centrifugare il campione a 1000 volte la gravità a temperatura ambiente per un minuto. Scartare il surnatante, quindi aggiungere i vermi al vetrino. Sotto un microscopio da dissezione, utilizzare un tessuto molle per drenare il liquido in eccesso.
Quindi, mentre si è ancora al microscopio, aggiungere 10 microlitri di alcol al 95% sui vermi e continuare ad osservarli. Subito dopo che l'etanolo si è asciugato, ripetere l'aggiunta di etanolo altre due volte. È fondamentale per il processo di evaporazione dell'etanolo dagli animali al microscopio da dissezione.
Una volta che l'etanolo si è staccato dagli animali, procedere immediatamente al passaggio successivo. Aggiungere 10 microlitri di DAPI ai vermi. Applicare immediatamente un vetrino coprioggetti e sigillare il vetrino con gel smalto trasparente.
Dopo aver lasciato agire lo smalto per circa 10 minuti, osserva gli animali al microscopio a fluorescenza. Per fissare gli animali con acetone, utilizzare M9 per lavare via la piastra termoelettrica e centrifugare il campione a 1000 volte la gravità a temperatura ambiente per un minuto. Scartare il surnatante e utilizzare un millilitro di acqua distillata per lavare il pellet.
Dopo aver rimosso il surnatante, aggiungere 400 microlitri di acetone al 30% e incubare il campione per 15 minuti. Quindi centrifugare la provetta a 1000 volte la gravità a temperatura ambiente per un minuto. Dopo aver scartato il surnatante, utilizzare 500 microlitri di acqua distillata per lavare gli animali due volte.
Aggiungere 200 microlitri di DAPI al pellet, o quattro volte la quantità del volume totale dei vermi nella provetta, e incubare il campione per 15 minuti. Centrifugare il campione ed eliminare il surnatante. Quindi utilizzare 500 microlitri di acqua distillata per lavare il pellet due volte prima di montarlo e immaginarlo come prima.
Per eseguire l'imaging, accendere la sorgente di luce UV e il microscopio a fluorescenza. Quindi accendere il computer collegato al microscopio. Caricare il vetrino sul microscopio a fluorescenza.
Usa un obiettivo 10X per localizzare i vermi. Quindi aumentare la potenza di ingrandimento a 400X e concentrarsi sul campione. Quindi, apri il software fornito con il microscopio.
Fare clic su Acquisizione, quindi fare clic su Fotocamera e selezionare la fotocamera collegata al microscopio. Nella stessa Acquisizione, fare clic su Acquisizione multidimensionale. Viene visualizzata una nuova finestra di navigazione Acquisizione multidimensionale.
Fai clic sul pulsante multicanale e appariranno tutti i canali disponibili. Scegli il blu, il verde e il DIC per osservare il campione. Nella finestra di navigazione Acquisizione multidimensionale, lasciare attivi i canali DAPI blu, GFP verde e DIC grigio e fare clic con il pulsante destro del mouse su altri canali, come la rodamina rossa e il campo chiaro bianco, per chiuderli.
Per misurare il tempo di esposizione per ciascun canale, fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul canale DAPI blu per selezionarlo e fare clic su misura"per scattare un'immagine dal vivo con un tempo di esposizione automatizzato. Sul lato sinistro della finestra dell'immagine dal vivo, regolare manualmente il tempo di esposizione, se lo si desidera, quindi fare clic su OK. Impostare i tempi di esposizione per i canali GFP e DIC in modo simile. Nella finestra di navigazione Acquisizione Multidimensionale, cliccare su Avvia" per raccogliere automaticamente tre immagini sotto i tre diversi canali, in ordine, con i tempi di esposizione impostati.
Per salvare il file, nel menu principale, clicca su File, Salva con nome.Inserisci il nome del file e la cartella. Salvare il file come formato di file predefinito per conservare le informazioni dettagliate sull'imaging per riferimento futuro. Per esportare il file in altri formati, in File fare clic su Esporta.
Imposta il nome del file e la cartella. Seleziona Crea una cartella di progetto"per organizzare meglio i dati. Dopo aver scelto il tipo di file desiderato dal menu a discesa, fare clic su Avvia"per esportare.
Ci sono due omologhi proteici del canale intracellulare del cloruro in C.elegans, exl-1 ed exc-4. Uno studio recente ha dimostrato che l'exl-1 regola la gestione dello stress degli animali. Qui, un costrutto traslazionale di GFP exl-1 è stato integrato in un genoma animale e sono state create linee transgeniche, che esprimono stabilmente l'exl-1 fluorescente verde.
Sotto stress termico, exl-1 GFP si accumula nel nucleo nella regione intestinale quando un forte segnale GFP si sovrappone al nucleo. Per confermare la localizzazione subcellulare di exl-1, la colorazione DAPI è stata effettuata sia in animali fissati con etanolo che con acetone. Entrambi i metodi mostrano nuclei chiari nel corpo animale e i segnali GFP e DAPI sovrapposti confermano che exl-1 GFP si è effettivamente accumulato nei nuclei nella regione intestinale.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un'ora se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire una fissazione rapida per preservare il segnale GFP e la traslocazione nucleare della proteina sotto stress in C.elegans.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo protocollo illustra come tracciare la traslocazione nucleare di una proteina in condizioni di stress termico, utilizzando una proteina di fusione GFP come marcatore e la colorazione con DAPI. Il metodo è rapido ed efficiente, consentendo l'osservazione simultanea dei cambiamenti nella colorazione nucleare e nella localizzazione subcellulare.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia cellulare
- Neuroscienze
- Genetica
Sfondo
- Comprendere la localizzazione proteica è fondamentale nella biologia cellulare.
- Lo stress termico può influenzare la traslocazione e la localizzazione delle proteine.
- Le proteine di fusione GFP sono marcatori preziosi per il tracciamento delle proteine.
- La colorazione con DAPI fornisce un metodo per visualizzare i nuclei.
Scopo dello studio
- Monitorare la traslocazione nucleare delle proteine in condizioni di stress termico.
- Utilizzare la GFP come marcatore per la localizzazione proteica.
- Illustrare un protocollo rapido per la colorazione con DAPI.
Metodi Utilizzati
- Generazione di array extracromosomici con costrutti traduzionali.
- Esposizione di C.elegans a radiazioni gamma per l'integrazione.
- Selezione di linee con espressione stabile mediante proteine marcatrici.
- Osservazione simultanea della localizzazione nucleare e subcellulare.
Risultati principali
- Monitoraggio riuscito della traslocazione nucleare in condizioni di stress termico.
- Visualizzazione efficiente della colorazione GFP e DAPI.
- Dimostrata l'efficacia del protocollo in C.elegans.
- Forniti approfondimenti sulle dinamiche di localizzazione proteica.
Conclusioni
- Il protocollo è uno strumento prezioso per lo studio della dinamica delle proteine.
- Metodi rapidi ed efficienti migliorano la ricerca in biologia cellulare.
- Applicazioni future potrebbero estendersi ad altre condizioni di stress.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente un monitoraggio rapido e senza anticorpi dei cambiamenti nella localizzazione subcellulare delle proteine in risposta allo stress, supportando la validazione precoce di bersagli all'interno di flussi di lavoro di scoperta. Combinando la marcatura con GFP con la colorazione nucleare mediante DAPI, fornisce una conferma quantitativa e visiva di eventi di traslocazione—come l'accumulo nucleare in condizioni di stress termico—che possono contribuire a ridurre i rischi meccanicistici delle ipotesi terapeutiche. La compatibilità del metodo con microscopi a fluorescenza standard ne facilita l'uso nella preparazione di schermate ad alto rendimento e da parte di team multidisciplinari in contesti di ricerca e sviluppo biofarmaceutici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'osservazione diretta della traslocazione delle proteine indotta da stress, supportando la validazione funzionale delle proteine bersaglio e l'analisi dei percorsi biologici.
- Valore operativo: Elimina la necessità di anticorpi o marcatori radioattivi, riducendo i tempi e i costi di sviluppo del saggio.
- Valore predittivo: Conferma i cambiamenti nella localizzazione subcellulare che potrebbero indicare il meccanismo d'azione o la modulazione della risposta allo stress.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera linee transgeniche stabili che esprimono proteine marcate con GFP per piattaforme di screening costanti e riproducibili.
- Output quantitativo: Permette la misurazione simultanea del segnale GFP e della colorazione nucleare con DAPI per l'analisi di co-localizzazione.
- Scalabilità: Compatibile con la microscopia a fluorescenza standard, consentendo l'adattamento a formati multi-well per lo screening di composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Traccia la localizzazione di EXL-1, una proteina della famiglia CLIC con omologhi nei mammiferi (ad esempio, CLIC4), sostenendo la valutazione traslazionale del bersaglio.
- De-risking meccanicistico: Conferma la traslocazione nucleare in condizioni di stress termico ma non in caso di stress ossidativo, contribuendo a definire il comportamento specifico del bersaglio in base alle condizioni.
- Continuità preclinica: Fornisce un sistema riutilizzabile per valutare la dinamica proteica in diverse condizioni di stress prima della validazione in vivo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dal test dell'ipotesi sul bersaglio all'identificazione del composto promettente, in particolare per le proteine sensibili allo stress. Esso supporta decisioni precoci di prosecuzione o interruzione del progetto, validando l'interazione con il bersaglio e la dinamica subcellulare prima delle campagne di screening dei composti.
- Biologia della scoperta: Verifica ipotesi terapeutiche visualizzando i cambiamenti nella localizzazione proteica in condizioni di stress definite.
- Screening: Prepara sistemi cellulari validati per lo screening di librerie di composti, con letture di localizzazione incorporate.
- Analisi: Genera dati di co-localizzazione (sovrapposizione GFP/DAPI) come output quantitativo per valutare gli effetti dei composti sul traffico proteico.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti in C. elegans a quelli nei sistemi mammiferi attraverso le proteine CLIC conservate, supportando la validazione incrociata dei bersagli tra specie.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una pipeline modulare e riutilizzabile per monitorare la dinamica subcellulare di qualsiasi proteina marcata con GFP in condizioni di stress o esposizione a composti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica fornendo prove visive dirette della traslocazione proteica in contesti cellulari vivi.
- Valore operativo: Standardizza i protocolli di fissazione e di imaging tra diversi gruppi di lavoro, migliorando la riproducibilità e riducendo la variabilità.
- Valore strategico: Accelera i tempi di validazione degli obiettivi, consentendo una selezione più rapida del portafoglio e riducendo gli investimenti in bersagli falsi positivi.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce l'avanzamento basato sulla valutazione del rischio confermando il comportamento del bersaglio in modelli di stress rilevanti per la malattia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione di C. elegans, nella generazione di linee transgeniche e nella microscopia a fluorescenza.
- È subordinato all'accesso a un microscopio a fluorescenza dotato di filtri per FITC e DAPI e di ottiche Nomarski.
- Necessita della standardizzazione dei tempi di fissazione (etanolo/acetone) e di colorazione per preservare il segnale GFP e garantire un'etichettatura nucleare costante con DAPI.
- L'adattamento ad altri sistemi modello potrebbe richiedere l'ottimizzazione dell'intensità del promotore, dell'efficienza di marcatura e dei paradigmi di stress.
- Limite pratico: più adatto per proteine con traslocazione rilevabile; potrebbe non risolvere eventi di trasporto rapido o transitori senza imaging in tempo reale.
