Name: Live Cell Imaging del TGF-β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro e In Vivo utilizzando un sistema di Reporter dellAdenovirus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Scopri l'imaging di cellule vive della via di segnalazione TGF-β/Smad3 utilizzando un sistema reporter adenovirale. Questo metodo consente il monitoraggio in tempo reale in modelli in vitro e in vivo per la ricerca sul cancro.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Health and Medical Research Consiglio (NHMRC) per H-JZ. TMBW è un destinatario di un premio post-laurea in Australia dal governo australiano e la borsa di studio Top-Up di Henderson Ann da Australian Rotary Health in partner con Rotary di Templestowe e Dine per una cura.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Università di Melbourne animale comitato etico.
Nota: Il protocollo di sequenza, di costruzione e di generazione per il adenoviral file vettoriale pAnnuncio-CMV-Td-Tom, pAnnuncio-CMV-GFP e pAnnuncio-CAGA12- Luc/Td-Tom sono stati descritti in precedenza11,12, 13. Tutti i vettori sono disponibili in commercio.
1. virus titolo determinazione utilizzando 50% coltura tissulare Dose infettiva (TCID50)
<ol><li>Preparare 1 x 106 cellule HEK293A in 10 mL di DMEM + 10% FBS media.</li>
	<li>Semi di 100 µ l di sospensione cellulare in tutti i pozzetti di una piastra di coltura cellulare di 96 pozzetti a fondo piatto.</li>
	<li>Preparare 1 mL di una diluizione di 1: 100 di stock di virus in terreno completo. Aggiungere 11 µ l di virus diluito in ciascun pozzetto della colonna 1.</li>
	<li>Effettuare diluizioni seriali 10 volte direttamente nella piastra ben 96 mescolando 11 µ l di virus diluito con 100 µ l di sospensione cellulare fino ad una diluizione finale di 1 x1012 è raggiunto. Anche se le cellule sono non aderente in questa fase, il numero delle cellule trasferite tra pozzi rimane costante.</li>
	<li>11 µ l di ciascuna diluizione in ogni colonna a partire con la più alta diluizione di 104. Sostituire i puntali per pipette con ogni diluizione per limitare l'incrocio delle particelle virali.</li>
	<li>Aggiungere 11 µ l di antivirus completa per i media alla colonna 12 come controllo negativo.</li>
	<li>Incubare la piastra per 7-10 giorni a 37 ° C con 10% CO2.</li>
	<li>Utilizzando un microscopio, segnare il numero di pozzi in ogni colonna presenta i sintomi di effetti citopatici o citotossici. Si consideri un bene positivo se è presente alcun segno di infezione.</li>
	<li>Calcolare la frazione di pozzetti positivi per ogni diluizione utilizzando il Reed e Muench metodo statistico (1938)14.</li>
	<li>Calcola la distanza proporzionale (PD): (A-50)/(A-B), dove A è la risposta di percentuale superiore o uguale al 50% e B è la risposta di percentuale inferiore al 50%.</li>
	<li>Calcolare TCID50 utilizzando: 10X-PD, dove X è la diluizione dando una risposta supera al 50%.</li>
	<li>Calcolare il titolo virale da utilizzando il seguente: 0.69 / (0.011 x TCID50) PFU/mL</li>
</ol>2. adenovirus MOI determinazione
<ol><li>Seme 1.0-1.5 x 105 MDA-MB-231 cellule con 500 μL di DMEM terreni di coltura contenente 5% FBS in ciascun pozzetto di un 12 ben piatto (confluency di 35% delle cellule, 6 pozzi in totale).</li>
	<li>Calcolare i volumi di Annuncio-CMV-Td-Tom stock richiesto per 0, 250, 500 e 2500 e 5000 MOI utilizzando il seguente formula: MOI = (volume [µ l] x PFU/μL) / numero di cellule. Per Annuncio-CMV-Td-Tom con un titolo di 1 x 1010 (PFU/mL), i volumi dell'infezione del virus MOIs richiesti sono rispettivamente 0, 3,75, 7.5, 37.5 e 75 μL.</li>
	<li>Infettare le cellule con i volumi calcolati di Annuncio-CMV-Td-Tom nella sezione 2.2 pipettando direttamente stock virali nei pozzetti con accurata miscelazione.</li>
	<li>Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 ° C con 10% CO2 per 24 h.</li>
	<li>Rimuovere il supporto dai pozzetti e correggere immediatamente le celle con 500 μL di formalina al 10% per 5 min.</li>
	<li>La formalina da pozzi di aspirare e lavare i pozzetti con 500 μL di PBS una volta.</li>
	<li>Macchia di nucleo della cellula con 500 μL di soluzione di Hoechst per 5 min.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di Hoechst e lavare i pozzetti con 500 μL di PBS 3 volte.</li>
	<li>Immagine la proteina Td-pomodoro e nucleo cellulare segnale con 200 ingrandimenti su un microscopio a fluorescenza. Eccitare la proteina Td-pomodoro a 554 nm e il colorante Hoechst a 352 nm.</li>
	<li>Analizzare le immagini usando ImageJ per determinare il funzionamento che Moi necessaria per l'infezione di Td-pomodoro15100%.</li>
</ol>3. dual-adenovirus trasduzione in streaming in singole cellule
<ol><li>Seme 1.0-1.5 x 105 MDA-MB-231 cellule con 500 μL di DMEM terreni di coltura contenente 5% FBS in ciascun pozzetto di un 12 ben piatto (confluency di 35% delle cellule, 2 pozzi in totale).</li>
	<li>Infettare le cellule con 75 μL di Annuncio-CMV-GFP (titolo = 5 x 109 PFU/mL) e 7,5 μL di Annuncio-CAGA12-Td-Tom (titolo = 5 x 1010 PFU/mL) per ottenere un 2.500 MOI, che può raggiungere 100% positività di infezione.</li>
	<li>Curare le cellule con o senza 0.25 μL di TGF-β per pozzetto (10 mg/mL in magazzino, 5 ng/μL come la concentrazione finale) immediatamente dopo l'infezione dell'adenovirus.</li>
	<li>Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 ° C con 10% CO2 per 24 h.</li>
	<li>Cellule vive di immagine con il microscopio di fluorescenza di contrasto di fase. Eccitare GFP a 470 nm e proteina di Td-pomodoro a 554 nm.</li>
	<li>Difficoltà cellule e macchia nucleo cellulare come descritto nella procedura 1.6 - 1.9.</li>
	<li>Immagine la proteina Td-pomodoro e Hoechst macchia usando un microscopio a fluorescenza. Eccitare il colorante Hoechst a 352 nm.</li>
	<li>Usando ImageJ, calcolare che la percentuale di GFP e Td-pomodoro positivo cellule15.</li>
</ol>4. vivo cellula singola segnalazione in cicatrizzazione Assay
<ol><li>Semi di 4-5 x 105 MDA-MB-231 cellule con 1 mL di terreni di coltura DMEM contenente 5% FBS in ciascun pozzetto di un 6 piastra ben (confluency di 50% delle cellule, 2 pozzi in totale).</li>
	<li>Infettare le cellule con 22,5 μL di Annuncio-CAGA12-Td-Tom (titolo = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2.500).</li>
	<li>Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 ° C con 10% CO2 per 24 h.</li>
	<li>Gratta e Vinci due linee incrociate sul livello delle cellule di ciascun pozzetto usando una pipetta P200.</li>
	<li>Rimuovere i vecchi media da pozzi e sostituire con 2 mL di fresco 5% FBS media con o senza 0,5 μL di TGF-β per pozzetto (10 mg/mL in magazzino, 5 ng/μL come concentrazione finale).</li>
	<li>Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 ° C con 10% CO2 per 5 min e prendere le immagini delle aree selezionate ferita usando 100 X ingrandimento su un microscopio a contrasto di fase.</li>
	<li>Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 ° C con 10% CO2 per 24 h.</li>
	<li>Prendere immagini della chiusura della ferita allo stesso zone come prima.</li>
	<li>Fissare le cellule, macchia nucleo cellulare come descritto nella procedura 1.6 - 1.9 e visualizzare il segnale del Td-pomodoro nella zona ferita e non ferita usando 200 X ingrandimento su un microscopio a fluorescenza.</li>
	<li>Quantificare la percentuale di cellule positive Td-pomodoro nell'area non-ferita usando ImageJ software15e ferita.</li>
</ol>5. in Vitro Luciferase Assay
<ol><li>Preparare una sospensione di cellule di 3-5 x 104 MDA-MB-231 cellule in 1 mL di terreno DMEM contenente il 5% di FBS.</li>
	<li>Infettare sospensione cellulare con 2,5 µ l di annuncio-CAGA12- Luc (titolo = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2.500).</li>
	<li>Seme le cellule infette in un 96 piastra bene alle 3.000 cellule/100 µ l/pozzetto.</li>
	<li>Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 ° C con 10% CO2 per 24 h.</li>
	<li>Rimuovere vecchi media da pozzi e sostituire con 100 µ l di fresco media 5% FBS con o senza 0.1 μL di TGF-β per pozzetto (1 mg/mL in magazzino, 1 ng/μL come la concentrazione finale) e in presenza o assenza di 0,17 μL di inibitore di TGF-β per pozzetto (7 mg/mL in magazzino 12 ng/μL come concentrazione finale) (una nuova proteina legante di trappola di TGF-β, Chen et al., inedito lavoro).</li>
	<li>Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 ° C con 10% CO2 per 24 h.</li>
	<li>Scongelare il substrato di sistema luciferase assay e preparazione del 1 x cella cultura reagente di lisi in doppia acqua distillata (DDW).</li>
	<li>Rimuovere il supporto da 96 pozzetti e lisare pozzi con 50 μL 1 x cella cultura di tampone di lisi sul ghiaccio con un agitatore orbitale con agitazione delicata per 30 min.</li>
	<li>Trasferire 30 μL di lisato da ogni pozzetto in una piastra di luciferasi opaco e consentire la piastra a temperatura ambiente.</li>
	<li>Il luminometro, creare un nuovo protocollo. Selezionare per 1 iniettore con misurazioni prima e dopo l'iniezione. Impostare misure prima dell'iniezione a 1 s per ritardo nella misura e Tempo d'integrazione. Per impostare il Volume di iniezione dopo la misurazione di iniezione, 40 µ l con un ritardo nella misura di 1 s dopo l'iniezione e 5 s Tempo di integrazione. Confermare le impostazioni premendo il pulsante OK.</li>
	<li>Inserire il tubo iniettore DDW e fare clic sul pulsante iniettore 1 sotto le Prime impostazioni per pulire il tubo iniettore prima dell'uso. Successivamente rimuovere il tubo iniettore dal DDW e posto in aria seguita da ulteriori due numeri primi di iniettore 1 per svuotare tutta la soluzione dal tubo. Inserire il tubo iniettore in substrato di Firefly e ancora Prime due volte per preparare il substrato.</li>
	<li>Posizionare la piastra di luciferasi opaco con i campioni nel luminometro e selezionare le Opzioni del software. Evidenziare i pozzi di interesse e fare clic su applica. Premere il tasto Start per misurare il segnale luciferasi.</li>
	<li>Una volta completate misure, rimuovere e sciacquare la piastra con acqua. Recuperare qualsiasi substrato rimanente nel tubo iniettore inserendo il tubo in aria e primo iniettore 1 indietro nel tubo di substrato di firefly. Inserire il tubo iniettore DDW ed eseguire ulteriori due numeri primi per pulire il tubo iniettore di qualsiasi substrato rimanente.</li>
</ol>6. cella preparazione per Live segnalazione Imaging In Vivo
<ol><li>48 ore prima dell'impianto del tumore, semi 2-3 x 106 MDA-MB-231 cellule in boccette di 175 cm2 (10 boccette in totale). Coltura di cellule in 20 mL di terreno DMEM contenente 5% FBS a 37 ° C, 10% CO2.</li>
	<li>24 h dopo, aggiungere 300 μL di annuncio-CAGA12- Luc (titolo = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2.500) in ciascuna beuta. Mantenere le cellule in coltura per altre 24 ore.</li>
	<li>Il giorno dell'impianto, è necessario rimuovere i vecchi media e lavare le cellule dell'adenovirus infettato una volta con 20 mL di PBS, pH 7.4. Aggiungere 2 mL di tripsina-EDTA 0,05% nella beuta e agitare il matraccio leggermente per consentire tripsina coprire tutta la superficie del pallone. Posizionare il pallone nell'incubatore 37 ° C, 10% CO2 per 3 min.</li>
	<li>Placare la tripsina aggiungendo 8 mL di terreno DMEM FBS-contenenti in palloni. Trasferire tutte le sospensioni di cellule in una bottiglia di vetro del reagente.</li>
	<li>Contare il numero di cellulare utilizzando un emocitometro e trasferire 4.8 x 107 cellule in due provette da centrifuga 50 ml.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 400 x g per 5 min a RT per rimuovere tripsina e risospendere le cellule in 720 di media FBS-DMEM fresco.</li>
	<li>Trasferire le sospensioni delle cellule in una provetta sterile 5 mL e aggiungere 160 μL Matrigel (10% totale matrigel sospensione).</li>
	<li>Mantenere le cellule su ghiaccio fino all'impianto.</li>
</ol>7. l'impianto ortotopico
<ol><li>Pesare 12 topi SCID e allocare in modo casuale i topi nei gruppi di controllo e trattamento (6 topi/gruppo).</li>
	<li>Eseguire l'impianto in un sterile bio-armadietto per mantenere un ambiente sterile. Anestetizzare il mouse usando isoflurano 2,5-4,5% con un tasso di flusso di ossigeno di 1 L/min. Posizionare il mouse su una piastra di calore e versare una goccia di lubrificante unguento oculare su entrambi gli occhi per evitare danni alla cornea. Difficoltà il mouse per il termoforo in posizione supina, mentre mantenere l'anestesia inserendo il muso in un cono di naso collegato per l'isoflurano.</li>
	<li>Confermano il successo dell'anestesia dalla mancanza di reazione alla punta pizzico. Ridurre isoflurano a una dose di mantenimento di 1,5-2,5% con 1 L/min di ossigeno per il promemoria dell'impianto.</li>
	<li>Pulire la pelle dal capezzolo quarto su entrambi i lati alla linea mediana utilizzando il tampone di cotone immerso in 80% di etanolo.</li>
	<li>Trovare i 4th cuscinetto grasso mammario mediante palpazione e spremere il cuscinetto di grasso per esporre ulteriormente il tessuto.</li>
	<li>Miscelare la sospensione cellulare ben pipettando su e giù. Delicatamente aspirare 50 µ l di miscela delle cellule in una siringa da insulina 27g e iniettare nel cuscinetto grasso mammario su entrambi i lati del mouse.</li>
	<li>Confermare un'iniezione di successo di sensazione per il gonfiamento del rilievo grasso. Rilasciare delicatamente il cuscinetto di grasso e posizionare il mouse indietro nella gabbia.</li>
	<li>Lasciare le gabbie sul termoforo per almeno 30 min consentire i topi acquisire coscienza e quindi posizionare le gabbie torna in camera della holding per 3 giorni.</li>
</ol>8. IVIS Imaging
<ol><li>Aprire il software di Immagine vivente .</li>
	<li>Inizializzare il sistema IVIS facendo clic sul pulsante Inizializzare IVIS sistema sul pannello di controllo. Attendere fino a quando il segno di temperatura diventa verde.</li>
	<li>Selezionare la modalità di Imaging di luminescenti sul pannello di controllo.</li>
	<li>Accendere isoflurano anestesia al sistema IVIS e camera.</li>
	<li>Anestetizzare i topi utilizzando isoflurano 2.5-4.5% con 1 L/min di ossigeno. Una volta anestetizzati, impostare isoflurano 1,5-2,5% per la manutenzione. Iniettare 150 mg/kg di peso corporeo di D-luciferina in topi tramite l'iniezione intraperitoneale (i.p.).</li>
	<li>Trasferire immediatamente i topi nel sistema IVIS, metterli sulla piattaforma di imaging temperatura controllata e posto loro naso nel cono di naso.</li>
	<li>Fare clic sul pulsante Sequenza installazione su pannello di controllo e selezionare Medio Binning.</li>
	<li>Impostare il tempo di esposizione imaging come segue: 10 s, 20 s, 30 s, 60 s e 120 s. Start imaging circa 3 min dopo l'iniezione di luciferina e continuano a immagine fino a quando il segnale inizia a calare (normalmente questo richiederà circa 20 min).</li>
	<li>Rimuovere i topi IVIS mantenendo isoflurano anestetico attraverso un cono di naso e curare i topi con 50 µ l PBS o inibitore segnalazione di TGF-β 50 µ l (50 μg/tumore) via l'iniezione intra-tumorale.</li>
	<li>Rimettere i topi in gabbia e li lasci sul termoforo per almeno 30 min. Quindi posizionare la gabbia torna in camera della holding.</li>
	<li>Ripetere IVIS procedura di imaging, come descritto in precedenza il giorno dopo il trattamento.</li>
</ol>9. analisi dei dati
<ol><li>Aprire file salvati nel Living immagine software.</li>
	<li>Trovare le informazioni di immagine utilizzando vista | Informazioni sull'immagine.</li>
	<li>Selezionare foto scattate in un momento simile con lo stesso tempo di esposizione. Caricare le foto come un gruppo.</li>
	<li>Deselezionare la casella individuale nella Regolazione di immagine per normalizzare l'intensità.</li>
	<li>Selezionare la modalità di Photon per analizzare l'intensità. Quantificare l'intensità del segnale selezionando il pulsante Area di interesse (ROI) in Strumenti di ROI.</li>
	<li>Trascinate il cerchio ROI per la regione che contiene il segnale bioluminescente e fare clic sul pulsante di misura per acquisire l'intensità del segnale.</li>
</ol>

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<li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+receptor+NR4A1+promotes+breast+cancer+invasion+and+metastasis+by+activating+TGF-beta+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Nuclear receptor NR4A1 promotes breast cancer invasion and metastasis by activating TGF-beta signalling.</a> Nature communications. 5, 3388(2014).</li>
</ol>

Gli autori non segnalano conflitti di interesse.

Abbiamo sviluppato una tecnica per consentire per l'imaging in tempo reale di segnalazione di TGF-β/Smad3 in singole cellule vive. Utilizzando questo metodo novello, precedentemente abbiamo identificato una sottopopolazione di cellule con attività trascrizionale TGF-β/Smad3 dinamica che è stata associata con una maggiore invasione e migrazione8. Questo metodo migliora le analisi tradizionali per la segnalazione di TGF-β, quali macchie occidentali di fosforilazione Smad3 e TGF-β mirati di espressio...

Fattore di crescita trasformante β (TGF-β) è una citochina essenziale implicata nello sviluppo umano che segnala attraverso un heterodimeric complesso composto di tipo II e tipo I recettori1. Associazione al tipo di recettore II risultati nel reclutamento e fosforilazione di tipo ricevitore, che a sua volta fosforila a valle Smad2/3 proteine2,3. Questi attivati Smad2/3 proteine legano al Smad4, formando un complesso che trasloca nel nucleo e regola gene trascrizione4. Condizioni omeostatiche TGF-β/Smad signaling è strettamente regolato; Tuttavia, in molte malattie, la via di segnalazione è liberalizzata e spesso sovraespresso leader alla progressione di malattia5,6,7. Studi recenti hanno dimostrato che la risposta cellulare a TGF-β è eterogenea e sottopopolazioni di cellule attive di TGF-β/Smad sono responsabili di funzione biologica in un modo dipendente dal tempo8,9. Analisi cellulare comune di segnalazione di TGF-β/Smad prevede l'utilizzo di analisi di endpoint fisso che offrono solo una panoramica dell'attività cellulare e spesso quantificare il medio di effetto di TGF-β/Smad10. Questi metodi, tuttavia, non possono rappresentare con precisione i comportamenti molecolari di segnalazione di TGF-β/Smad nello stato fisiologico durante la progressione di malattia. Analisi basata su immagine di cellule vive, che cattura la dinamica dei processi biologici e cellulari con entrambi una comprensione spaziale e temporale.
Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un metodo di alto-rendimento sensibile per l'imaging di cellule vive di TGF-β/Smad segnalazione utilizzando reagenti a base dell'adenovirus. Qui, abbiamo infettato la linea cellulare di cancro al seno umane MDA-MB-231 con un adenovirus che esprimono la sequenza di binding motif Smad3 CAGA e luciferasi (Luc) o gene reporter Td-pomodoro (Td-Tom). Sistemi reporter adenoviral forniscono un metodo rapido ed economico per introduzione di plasmide che può provocare un tasso di infezione del 100% in linee cellulari del cancro. Sistemi reporter adenoviral sono inoltre stati applicati con successo a linee cellulari che sono difficili a transfect con convenzionale plasmide11. In questo protocollo descriveremo un processo riproducibile e non invadente per ottenere immagini di cellule vive del pathway di segnalazione del TGFβ/Smad sia in vivo che in vitro.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>1881024</td><td>caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Siero Bovino Fetale</td><td>Scientifix Life</td><td>FBS500-S</td><td>Calore inattivato prima dell'uso</td></tr><tr><td>TGF Umano Ricombinante-&beta; 1</td><td>PEPROTECH</td><td>100-21</td><td>Aliquot in DDW per ottenere la concentrazione finale a 10 mg/mL</td></tr><tr><td>Hoechst-33258</td><td>Tocris Bioscience</td><td>5117</td><td>Diluire in PBS per ottenere la concentrazione finale a 1 &mu; Kit di analisi L/mL</td></tr><tr><td>Luciferase Reporter</td><td>Promega</td><td>197897</td><td>Diluire 5 volte in PBS prima dell'uso</td></tr><tr><td>Luminometro</td><td>Promega</td><td>9100-002</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia a fluorescenza a contrasto di fase</td><td>OLYMPUS</td><td>IX50</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>VivoGl Luciferin</td><td>Promega</td><td>P1041</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina III In vivo Sistema di imaging</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>0,5% di tripsina-EDTA (10x)</td><td>ThermoFisher</td><td>15400-054</td><td>Diltue allo 0,05% (1x) in</td></tr><tr><td>lisi di colture cellulari PBS 5x Reagente</td><td>Promega</td><td>E153A</td><td>Diluire a 1x in DDW</td></tr><tr><td>10% Formalina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5554-4L</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293A</td><td>ThermoFisher</td><td>R70507</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>CRM-HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>PRKDC-SCID</td><td>Centro risorse animali</td><td>SCIDF6</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Zoetis</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Chem-supply</td><td>EA043-10L-P</td><td></td></tr><tr><td>Refresh Night Time</td><td>Allergan</td><td>1750D</td><td>Unguento oculare lubrificante</td></tr><tr><td><forte>Soluzione</forte></td><td></td><td></td><td><forte>Composizione</soluzione salina tamponata >con</td></tr> <tr><td>fosfato forte (PBS)</td><td></td><td></td><td>NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0,12 milioni)</td></tr><tr><td>FBS-DMEM&nbsp;</td><td></td><td></td><td>5% FBS inattivato a caldo; 10 &mu; g/mL di penicillina; 100 &mu; g/mL di streptomicina</td></tr></tbody></table>

live cell imaging del tgf-β/smad3 signaling pathway in vitro e in vivo utilizzando un sistema di reporter dell'adenovirus

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Trasformando la segnalazione di fattore di crescita β (TGF-β) regola molte funzioni importanti richieste per l'omeostasi cellulare e si trova comunemente sovraespresso in molte malattie, compreso il cancro. TGF-β è fortemente implicata nella metastasi durante la progressione di cancro fase tarda, attivando un sottoinsieme delle cellule del tumore di migratori e invasivo. Attuali metodi per l'analisi dei percorsi di segnalazione concentrano su modelli di endpoint, che spesso tentano di misurare segnalazione post-hoc dell'evento biologico e non riflettono la natura progressiva della malattia. Qui, dimostriamo un romanzo dell'adenovirus reporter sistema specifico per la via di segnalazione di TGF-β/Smad3 che può rilevare l'attivazione trascrizionale in cellule vive. Utilizzando un reporter di Annuncio-CAGA12-Td-Tom , possiamo ottenere un tasso di infezione del 100% delle cellule MDA-MB-231 entro 24 h in vitro. L'uso di un reporter fluorescente permette per l'imaging delle cellule vive sola in tempo reale con identificazione diretta delle cellule trascrizionalmente attive. Stimolazione delle cellule infettate con TGF-β Visualizza solo un sottoinsieme delle cellule che sono trascrizionalmente attivi e coinvolti in funzioni biologiche specifiche. Questo approccio permette elevata specificità e sensibilità a livello di singola cellula per migliorare la comprensione delle funzioni biologiche legate alla TGF-β segnalazione in vitro. Smad3 attività trascrizionale può anche essere segnalato in vivo in tempo reale attraverso l'applicazione di un annuncio-CAGA12- Luc reporter. Annuncio-CAGA12- Luc può essere misurata nello stesso modo come linee cellulari tradizionali stabilmente trasfettate luciferasi. Smad3 attività trascrizionale di cellule impiantate in vivo può essere analizzata attraverso l'imaging convenzionale IVIS e monitorati dal vivo durante la progressione tumorale, fornendo una visione unica delle dinamiche del pathway di segnalazione di TGF-β. Il nostro protocollo descrive un sistema di consegna reporter vantaggioso permettendo per rapido ad alta produttività imaging delle vie di segnalazione delle cellule dal vivo sia in vitro che in vivo. Questo metodo può essere espansa a una gamma di analisi di immagine basata e presenta come un approccio sensibile e riproducibile per biologia di base e sviluppo terapeutico.

Vivere la singola cella imaging in vitro
Per valutare con precisione l'attivazione di segnalazione di TGF-β/Smad in singole cellule utilizzando reagenti dell'adenovirus basato, è importante determinare innanzitutto la molteplicità ottimale di infezione (MOI) per ogni linea cellulare. Il MOI ottimo è determinato quando il 100% delle cellule sono positivi per l'infezione adenoviral con gli effetti citopatici o citotossici no...

Qui, presentiamo un protocollo per l'imaging di cellule vive di attività di segnalazione di TGF-β/Smad3 utilizzando un sistema di reporter dell'adenovirus. Questo sistema tiene traccia di attività trascrizionale in tempo reale e può essere applicato a entrambi singole cellule in vitro e nell'animale vivomodelli.

Live Cell Imaging del TGF-β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro e In Vivo utilizzando un sistema di Reporter dell'Adenovirus

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

Questo metodo è in grado di rispondere a domande chiave nel campo della segnalazione cellulare tracciando in modo non invasivo la segnalazione cellulare in tempo reale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i sistemi adenovirus forniscono un metodo rapido e semplice per il rilevamento della segnalazione cellulare in grado di raggiungere un tasso di infezione del 100% nelle linee cellulari tumorali. Le implicazioni di questa tecnica si estendono allo sviluppo terapeutico per i tumori e possono essere estese ad altre vie di segnalazione.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui modelli di cancro al seno, può essere applicato anche ad altri tipi di cancro, come cervello, ossa e polmoni. Il giorno dell'infezione da adenovirus, seminare i pozzetti di una piastra a 12 pozzetti con circa 1,25 volte 10 alla quinta MDA-MB-231 cellule in 500 microlitri di terreno per una confluenza del 35%Infettare le cellule in tutti i pozzetti con 75 microlitri di adenovirus-CMV-GFP e 7,5 microlitri di adenovirus CAGA12-Td-Tomato per ottenere un 2.500 MOI che può raggiungere il 100% di positività all'infezione. Quindi aggiungere il TGF-beta al pozzetto del trattamento subito dopo l'infezione da adenovirus.Incubare a 37 gradi Celsius con il 10% di anidride carbonica per 24 ore. Il giorno successivo, eseguire l'imaging di cellule vive con un microscopio a fluorescenza a contrasto di fase. Quindi, dopo aver fissato le cellule e colorato i nuclei con il colorante Hoechst, visualizzare la proteina TD-Tomato e la colorazione Hoechst utilizzando un microscopio a fluorescenza.Dopo aver eseguito l'imaging di tutti i pozzetti, calcolare la percentuale di cellule positive per GFP e Td-Tomato utilizzando ImageJ. Per il test di guarigione delle ferite, iniziare seminando i pozzetti di una piastra a sei pozzetti con circa 4,5 volte 10 fino alla quinta cellula MDA-MB-231 in un millilitro di terreno per una confluenza del 50% il giorno dell'infezione. Infettare le cellule con 22,5 microlitri di adenovirus CAGA12-Td-Tomato, quindi posizionare la piastra nell'incubatore a 37 gradi Celsius con il 10% di anidride carbonica per 24 ore.Dopo 24 ore, utilizzare un puntale per pipetta P200 per graffiare due linee incrociate sullo strato cellulare di ciascun pozzetto. Rimuovere il terreno dai pozzetti e trattare con TGF-beta come mostrato in precedenza, quindi posizionare la piastra nell'incubatore a 37 gradi Celsius con il 10% di anidride carbonica per cinque minuti. Dopo cinque minuti di incubazione, scattare immagini di aree selezionate della ferita utilizzando un ingrandimento 100X su un microscopio a contrasto di fase prima di rimettere la piastra nell'incubatore.24 ore dopo, acquisire immagini a contrasto di fase delle stesse aree per valutare la chiusura della ferita. Dopo aver fissato le cellule e colorato i nuclei, visualizzare il segnale Td-Tomato nell'area della ferita e nell'area non della ferita utilizzando un ingrandimento 200X su un microscopio a fluorescenza. 48 ore prima dell'impianto del tumore, seminare circa 2,5 volte 10 alla sesta cellula MDA-MB-231 in 10 fiasche da 175 centimetri quadrati.Dopo 24 ore in coltura, aggiungere 300 microlitri di adenovirus CAGA12-luciferasi in ogni fiaschetta prima di rimettere le cellule nell'incubatore per altre 24 ore. Il giorno dell'impianto, rimuovere il vecchio terreno di coltura e lavare una volta le cellule infette da adenovirus con 20 millilitri di PBS. Aggiungere due millilitri di tripsina-EDTA allo 0,05% nel pallone e agitare leggermente il pallone per consentire alla tripsina di coprire tutta la superficie del pallone.Incubare a 37 gradi Celsius per tre minuti, quindi spegnere la tripsina aggiungendo otto millilitri di terreno DMEM contenente FBS nei flaconi. Trasferire tutte le sospensioni cellulari in un flacone di reagenti di vetro. Contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro.Successivamente, trasferire 4,8 volte 10 nelle sette celle in provette da centrifuga da 250 millilitri e centrifugare le celle a 400 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, risospendere le cellule in 720 microlitri di terreno fresco e trasferire la sospensione in una provetta da cinque millilitri. Quindi aggiungere un terreno contenente il 10% di Matrigel per diluire la sospensione cellulare a tre volte da 10 a una sesta cellula per 50 microlitri.Trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile da cinque millilitri e tenerla in ghiaccio fino all'impianto. Pesare 12 topi SCID e allocare in modo casuale i topi in modo equo tra i gruppi di controllo e di trattamento. Dopo aver anestetizzato il topo, erogare una goccia di unguento lubrificante su entrambi gli occhi per evitare danni alla cornea, quindi fissare il mouse a un cuscinetto termico in un bio-armadio sterile e mantenere l'anestesia posizionando il muso in un cono nasale collegato all'isoflurano.Confermare il successo dell'anestesia con la mancanza di reazione a un pizzicamento del dito del piede. Ridurre l'isoflurano a una dose di mantenimento per il resto dell'impianto. Quindi, usa un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo all'80% per pulire la pelle da ogni quarto capezzolo alla linea mediana.Trova il quarto cuscinetto adiposo mammario attraverso la palpazione e spremi il cuscinetto adiposo per esporre ulteriormente il tessuto, quindi mescola la sospensione cellulare pipettando su e giù. Aspirare delicatamente 50 microlitri di miscela cellulare in una siringa da insulina calibro 27 e iniettare nel cuscinetto adiposo mammario. Confermare l'avvenuta iniezione e rilasciare delicatamente il cuscinetto adiposo.Rimetti il mouse nella gabbia di casa. Dopo che i topi hanno ripreso conoscenza, riportare la gabbia nella stanza di detenzione per tre giorni prima di procedere all'imaging IVIS. Le cellule vive MDA-MB-231 presentavano vari livelli di espressione di Td-Tomato nonostante l'infezione al 100%, come dimostrato dall'espressione di GFP, che indica un'attivazione eterogenea della trascrizione di Smad3 TGF-beta-dipendente tra le cellule.L'analisi delle cellule fissate ha mostrato ancora una volta un'espressione di GFP del 100%, mentre solo circa il 26% delle cellule ha mostrato un'attività trascrizionale rilevabile di TGF-beta/Smad3 24 ore dopo la stimolazione con TGF-beta senza TGF-beta rispetto al trattamento con positività allo 0%. Nel test di guarigione delle ferite, le cellule MDA-MB-231 infettate con l'adenovirus CAGA12-Td-Tomato hanno mostrato un comportamento di migrazione normale e le cellule trattate con TGF-beta hanno mostrato una maggiore chiusura della ferita. In particolare, circa il 62% delle cellule nell'area della ferita presentava un'attività trascrizionale positiva di Smad3 TGF-beta-dipendente, che è significativamente più alta di quella osservata nell'area non ferita dopo il trattamento con TGF-beta.Il reagente adenovirus CAGA12-luciferasi è stato testato in un modello animale di impianto ortotopico di tumore al seno. Sia il gruppo di controllo che il gruppo trattato con inibitore del TGF-beta hanno dimostrato un'attività reporter simile della CAGA12-luciferasi prima del trattamento. Tuttavia, per il gruppo di controllo, il segnale della luciferasi non è cambiato dopo il trattamento con PBS, mentre i topi trattati con l'inibitore del TGF-beta hanno mostrato una riduzione del segnale di circa tre volte.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di un'ora se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che volumi eccessivamente elevati di adenovirus possono avere effetti citotossici e citopatici che possono influire sull'accuratezza dei risultati. Seguendo questa procedura, questo sistema può essere ampliato per analizzare più vie di segnalazione contemporaneamente al fine di rispondere a ulteriori domande relative al crosstalk di segnalazione cellulare.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della segnalazione delle cellule tumorali per esplorare il comportamento di progressione del tumore nei modelli di cancro al seno.

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Source: Chen, H. et. al. Live Cell Imaging of the TGF-β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the preparation of luciferase-expressing breast cancer cells using recombinant adenoviruses for in vivo imaging.

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Qui, descriviamo lo sviluppo e l'applicazione di un test di contrazione del gel per valutare la funzione contrattile nelle cellule mesenchimali che hanno subito una transizione epitelio-mesenchimale.

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Descriviamo un metodo per esperimenti di salvataggio della deplezione che preserva l'integrità cellulare e l'omeostasi delle proteine. L'adenofemazione consente analisi funzionali delle proteine all'interno di processi biologici che si basano su dinamiche basate sull'actina finemente sintonizzate, come la divisione cellulare mitotica e la miogenesi, a livello di singola cellula.

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Un protocollo per l'induzione in vitro di transizione endoteliali mesenchimali (EndMT), che è utile per investigare le vie di segnalazione cellulare coinvolti nella EndMT, è descritto. In questo modello sperimentale, EndMT è indotta dal trattamento con TGF-β in cellule endoteliali MS-1.

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