Isolamento dei cardiomiociti atriali da un modello del ratto di metabolico sindrome-relativo infarto con la frazione conservata di espulsione

Qui, descriviamo una procedura basata su Langendorff, ottimizzata per l'isolamento di singole cellule cardiomiociti atriali da un modello del ratto di metabolico sindrome-relativo infarto con la frazione conservata di espulsione. Una regolazione manuale della pressione intraluminale delle cavità cardiache è implementata per rendere funzionalmente intatto miociti adatto per studi di accoppiamento eccitazione-contrazione.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della funzione individuale dei cardiomiociti e consente di studiare eccitazione-contrazione-accoppiamento. Il vantaggio principale di questa tecnica è che un'alta resa di cardiomiociti atriali vitali da cuori con cardiomiopatia atriale può essere isolata e utilizzata per esperimenti successivi. Inizia posizionando una cannula con la punta lunga e affilata rimossa sopra l'apparecchio di Langendorff e avvia il flusso.

Accendere il modulo di riscaldamento e regolare in modo che il tampone di perfusione sulla punta dell'ago mantenga la temperatura desiderata per la perfusione. Una volta completata la calibrazione della temperatura, trasferire la cannula in una siringa da 10 ml riempita con tampone di incannulamento ghiacciato. Posizionare due doppi nodi overhand già preparati sulla cannula per una rapida e successiva incannulamento dell'aorta.

Rimuovi il cuore dal ratto eutanasia ed eparinizzato pizzicando la base del cuore con una pinza e tirando delicatamente verso il basso verso la coda dell'animale. Taglia l'aorta mantenendo una trazione sul cuore, lasciando un segmento dell'aorta lungo 5 mm attaccato al cuore. Trasferire rapidamente il cuore in 50 ml di tampone di incannulamento ghiacciato in un becher da 50 ml.

Attendere circa 10 secondi affinché il cuore si raffreddi e cessi le contrazioni. Quindi, trasferire il cuore in una capsula di Petri, contenente 50 ml di tampone di incannulamento fresco e ghiacciato e rimuovere con cura i tessuti adiposi che circondano l'aorta utilizzando una pinza e delle forbici. Inserire la cannula modificata da 3 mm nell'aorta senza danneggiare la valvola aortica.

Fissare l'aorta sulla cannula legando uno dei due nodi di cannulamento in corrispondenza della rientranza prossimale alla punta della cannula. Legare il secondo nodo di incannulamento in corrispondenza della rientranza distale alla punta della cannula. Sciacquare delicatamente l'aorta con 5 ml di tampone per incannulamento ghiacciato utilizzando la siringa attaccata alla cannula fino a quando non è visibile sangue nelle arterie coronarie.

Quindi, utilizzare una pinza per massaggiare delicatamente l'atrio sinistro mentre si iniettano i restanti 5 ml di tampone di incannulamento per eliminare il sangue residuo. Smontare la cannula con il cuore attaccato dalla siringa. Montare la cannula con il cuore attaccato al Langendorff, utilizzando un adattatore appropriato.

Avviare la pompa peristaltica dell'apparato di Langendorff per avviare la perfusione del tessuto cardiaco. Lega rapidamente un doppio nodo a rovescio attorno alla base del cuore esclusa l'aorta. Quando l'atrio destro e sinistro e il seno coronarico si gonfiano, forare l'atrio con l'ago a farfalla del dispositivo di controllo della pressione e lasciare che l'atrio si sgonfi.

Manipolare la pressione intraluminale dell'atrio regolando l'elevazione del tubo collegato all'ago a farfalla. Mantieni l'atrio leggermente gonfio per tutto il resto della procedura. È fondamentale che il passaggio venga eseguito rapidamente, poiché un gonfiaggio prolungato dell'atrio provocherà la morte dei cardiomiociti.

Posizionare una sonda di temperatura tra l'atrio sinistro e il ventricolo sinistro per misurare la temperatura approssimativa dell'atrio sinistro. Regolare di conseguenza la temperatura del modulo di riscaldamento Langendorff, mirando a una temperatura approssimativa di 37 C dell'atrio sinistro. Dopo 3 minuti di perfusione con tampone di perfusione, passare al tampone di digestione e perfondere per circa 14-18 minuti.

Quando la struttura atriale sinistra collassa e il tessuto acquisisce una consistenza lattiginosa, pizzicare l'atrio usando una pinza e un atto di leggera trazione. Rimuovere l'atrio sinistro utilizzando delle forbici sottili e trasferire l'atrio in una grande navicella contenente 2 ml di tampone di arresto, immergendo completamente il tessuto. Usa le forbici sottili per tritare il tessuto atriale in piccoli pezzi di circa 2 mm quadrati.

Disperdere il tessuto triturando delicatamente il tessuto con una pipetta di trasferimento per circa 5 minuti fino a quando non si può osservare una dissociazione macroscopica del tessuto. Evitare di generare bolle d'aria, poiché l'esposizione delle cellule all'aria provocherà la morte dei cardiomiociti. Quindi, trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 ml.

Dopo aver lasciato riposare i pezzi di tessuto per 30 s, rimuovere il surnatante e trasferirlo in un'altra provetta conica da 15 ml. Quindi lasciare riposare le celle per 15 minuti. Dopo aver rimosso ed eliminato il surnatante, aggiungere 2 ml di tampone Step 1 e lasciare riposare i cardiomiociti per 10 minuti.

Dopo 10 minuti, rimuovere ed eliminare il surnatante finale. Aggiungere 250 microlitri di Tyrode normale, contenente 1 mM di calcio. Trasferire 50 microlitri di sospensione di cardiomiociti atriali su un piatto di vetro rivestito di laminina e lasciare riposare i cardiomiociti a temperatura ambiente per 10 minuti.

Dopo 10 minuti, aggiungere alle cellule 500 microlitri di Tyrode normale contenente 1 mM di cloruro di calcio. Valutare la morfologia e la vitalità cellulare al microscopio ottico. Selezionare casualmente circa 100 cellule e classificarle come vitali o non vitali per stimare la fattibilità della procedura di isolamento cellulare.

Le cellule vitali sono caratterizzate da una struttura sarcomera simmetrica, dall'assenza di bolle di membrana e dalla forma di un bastoncello. Aggiungere 10 micromolari di Fluo-4-AM a 500 microlitri di Tyrode normale e utilizzarlo per sostituire il Tyrode normale contenente 1 mM di cloruro di calcio nel piatto con fondo di vetro. Dopo 20 minuti, rimuovere la soluzione di Fluo-4-AM e lavare le cellule due volte con 500 microlitri di Tyrode normale.

Trasferire la capsula su un microscopio confocale e visualizzare l'eccitazione del calcio, utilizzando un ingrandimento di 40x. Quindi, perfondere le celle con il normale Tyrode riscaldato a 37 C utilizzando un dispositivo di superfusione appropriato. Stimolare i cardiomiociti in un campo elettrico con elettrodi stimolatori montati su microscopio disponibili in commercio a una frequenza di 1 Hz e una corrente elettrica di 24 Ampere.

Dopo aver atteso 1 minuto per consentire alle cellule di raggiungere uno stato stazionario di gestione degli ioni calcio, acquisire immagini a scansione lineare mediante scansione ripetitiva. Questa immagine mostra la scansione della linea trasversale di un singolo cardiomiocita. La variazione della concentrazione citosolica di calcio è dimostrata dall'eccitazione del colorante fluorescente sensibile al calcio, Fluo-4-AM.

Le frecce indicano la stimolazione elettrica condotta a 1 Hz.Questa immagine mostra i transitori trasversali di calcio derivati da questa singola cellula. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 3 ore. Durante il tentativo di questo protocollo, è importante ricordare la sensibilità temporale di alcuni passaggi della procedura di isolamento.

Dopo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi di imaging subcellulare per rispondere a ulteriori domande riguardanti il rimodellamento dei cardiomiociti atriali.