Name: Visualizar la interacción entre la proteína marcada Qdot y λ Site-specifically modificada de ADN en el nivel de molécula única (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Aprende a visualizar interacciones ADN-proteína a nivel de molécula única usando microscopía TIRFM con ADN λ modificado y proteínas marcadas con puntos cuánticos. Este protocolo facilita el estudio de replicación y reparación del ADN.

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Agradecemos al Dr. Hasan Yardimci y Dr.Sevim Yardimci del Instituto Francis Crick de tipo ayuda en los experimentos de una sola molécula, Dr. Daniel Duzdevich del laboratorio del Dr. Eric C. Greene de la Universidad de Columbia, Dr. Yujie Sun de la Universidad de Pekín y Dr. Chunlai Chen de La Universidad de Tsinghua de discusión útil. Este estudio fue apoyado por la nacional Ciencias naturales Fundación de China 31371264, 31401059, equipo de innovación interdisciplinar del CAS y la Newton avanzado beca (NA140085) de la Real Sociedad.

1. preparación del sustrato de ADN λ-ARS317
<ol><li>Embalaje y construcción del sustrato de ADN<ol>
<li>Digerir el ADN nativo λ mediante XhoI enzima; amplificar un cojinete de fragmento de ADN de bp 543 ARS317 de la DNA genomic de florecimiento levadura usando las cartillas que contienen 20 homóloga de la bp secuencias de aguas arriba y aguas abajo de XhoI sitio de la enzima en el ADN de lambda. Añadir 100 ng de Xhodigiere ADN λ y 10 ng de ADN fragmento a 10 μl de sistema de reacción de recombinación homóloga e incubar la reacción a 37 ° C durante 30 minutos.</li>
		<li>Para la recombinación λ DNA del paquete, añadir 25 μl de los extractos de empaquetado de lambda en el producto de la recombinación e incubar la reacción a 30 ° C durante 90 minutos. A continuación, agregar un adicional 25 μl de los extractos de empaquetado de lambda en el tubo de reacción. Seguir a incubar la reacción a 30 ° C durante 90 minutos.</li>
		<li>Añadir 500 μl de tampón de dilución estéril (10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2) en el sistema de reacción y mezclar suavemente girando el tubo boca abajo varias veces. Añada 25 μl de cloroformo, mezclar suavemente y guardar a 4 ° C.</li>
		<li>Añadir 100 μl de fagos empaquetados y 100 μl de las bacterias LE392MP (cultivadas en 0.8 - 1.0 con medio LB añadiendo con 10 mM MgSO4) en un tubo nuevo. Incubar a 37 ° C durante 15 minutos.</li>
		<li>Añadir 200 μL de mezcla de fago-bacteria en agar oftop de 4 mL (0,7% de agar, medio LB + 10 mM MgSO4, enfriado a 48 ° C). Mezclar inmediatamente girando el tubo boca abajo varias veces y verter en un plato precalentado (37 ° C) LB.</li>
		<li>Incubar la placa a 37 ° C durante la noche y la placa de ARS317 λ mediante PCR y secuenciación de la pantalla.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificación de sustrato de ADN de lisados líquido11,18<ol>
<li>Elegir una placa en 200 μL de ddH estéril2O de 10 mM de MgCl2 y 10 nM CaCl2. Mezclar con 200 μL de bacterias LE392MP (cultivada durante la noche en medio LB) e incubar a 37 ° C durante 15 minutos.</li>
		<li>Añadir la mezcla de fago-bacteria en 100 mL de NZCYM (10 g/L amina de Nueva Zelanda, 5 g/L levadura extracto, 5 g/L de NaCl, 1 g/L Casamino hidrolizado y MgSO4·7H2O de 2 g/L) medio y la cultura de 7 h a 37 ° C. Añadir 250 μl de cloroformo en la cultura y agite por otros 10 minutos.</li>
		<li>Transferencia de la cultura en un matraz de 200 mL. Agregar 5,8 g de NaCl (concentración final de 1 M), agitar para disolver con la mano e incubar en hielo durante 30 minutos.</li>
		<li>Centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° C para eliminar los restos celulares. Recoger el sobrenadante en un matraz de 200 mL y añadir 10% PEG8000 (m/V). Revolver para disolver por el aparato de agitación magnética e incubar en hielo durante 30 minutos o más.</li>
		<li>Centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° C para precipitar el bacteriófago. Eliminar el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspender el precipitado en 2 mL de tampón de dilución de fago. Transferir a un tubo de 15 mL y añadir 10 μl de ARNasa (concentración final es de 20 μg/mL) y 40 μl de DNasa (concentración final es de 5 μg/mL). Incubar a 37 ° C durante 30 minutos.</li>
		<li>Añadir 2 mL de 0,3 M Tris-HCl (pH 9.0), 100 mM EDTA + 1.25% SDS, proteinasa μl 15 K (concentración final es de 10 μg/mL). Incubar a 65 ° C durante 10 minutos.</li>
		<li>Añadir 2 mL de acetato de potasio previamente enfriado (3 M, pH 4.8) e incubar el tubo en hielo durante 10 minutos.</li>
		<li>Centrifugue a 8.000 x g por 10 min a 4 ° C para eliminar el material insoluble.</li>
		<li>Añadir un volumen de 0,7 x de isopropanol en el sobrenadante. Mezcla girando el tubo boca abajo varias veces e incubar durante 2 min a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Centrifugue a 8.000 x g por 10 min a temperatura ambiente para precipitar el ADN. Eliminar el sobrenadante.</li>
		<li>Lavar el ADN una vez con el 70% etanol por centrifugación a 8.000 x g durante 10 minutos retirar el sobrenadante.</li>
		<li>Eluir el ADN con 500 μl de tampón TE (10 mM de Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) con suavidad y transfiera el ADN en tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Extraer el ADN dos veces con fenol: cloroformo por centrifugación a 8.000 g durante 10 minutos.</li>
		<li>Precipitado con isopropanol de volumen x 0,7. Mezcle girando el tubo de arriba abajo suavemente y centrifugar a 8.000 x g durante 10 min.</li>
		<li>Una vez lavado con etanol al 70%, resuspender en 200 μL de TE. Medir la concentración de ADN y almacenar a-20 ° C en 12,5 μg alícuotas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ARS317 de λ DNA Biotinilación
<ol><li>Que fosforilan biotinilado oligonucleótidos (5'-AGGTCGCCGCC-TEG-biotina-3') complementarios para el extremo izquierdo del nativo λ DNA, añadir 1 μl (100 μm) de oligonucleótidos, 7.5 μl de ddH2O, 1 μl de 10 x buffer ligasa y 0,5 μl de T4 PNK. Incubar la reacción a 37 ° C durante 3 horas.</li>
	<li>Fosforilan λ ARS317, añadir 12,5 μg de ARS317 λ, 3 μl de 10 x buffer ligasa, 1 μl de T4 PNK y ddH2O volumen total de 30 μl. Incubar la reacción a 37 ° C durante 3 horas.</li>
	<li>Para Recueza oligonucleótidos con λ-ARS317, Añadir 0,5 μl de oligonucleótidos fosforiladas, 195 μl de ddH2O, 25 μl de tampón de ligasa × 10 en el tubo de la λ-ARS317 fosforilada. Mezclar suavemente girando hacia abajo del tubo e incubar a 65 ° C por 5 min vuelta apagado el calentador del bloque y dejar que el fresco muestra a debajo de 33 ° C en el bloque.</li>
	<li>Para ligan oligonucleótidos con λ-ARS317, añadir 1 μl de T4 ADN ligasa y 0.63 μl de ATP (200 mM). Mezclar suavemente girando el tubo boca abajo e incubar a temperatura ambiente durante 2 h o 4 ° C durante la noche. Almacenar a 4 ° C durante 1 mes. Nota: Para evitar romper el ADN, todos los pasos de los mezcla deben hacerse girando suavemente el tubo boca abajo, en lugar de mezcla utilizando pipetas.</li>
</ol>3. cubreobjetos limpieza y funcionalización
<ol><li>Cubreobjetos de limpieza<ol>
<li>Cubre-objetos 20 lugar en 4 recipientes de tinción (5 cubreobjetos/jar), someter a ultrasonidos durante 30 minutos en etanol y enjuagar el cubreobjetos con ultrapura H2O 3 veces.</li>
		<li>Someter a ultrasonidos durante 30 minutos con 1 M hidróxido de potasio (KOH) y enjuague el cubreobjetos con ultrapura H2O 3 veces. Repita el etanol y sonicación KOH una vez.</li>
		<li>Someter a ultrasonidos con acetona durante 30 minutos y luego enjuague con ultrapura de H2O bien (por lo menos 3 veces). Nota: Acetona debe eliminarse completamente mediante enjuague con ultrapura de H2O, ya que puede causar una explosión cuando el solvente orgánico (como acetona) mezclado con la solución Piraña por error14.</li>
		<li>Coloque el cubreobjetos solución Piraña (3:1 mezcla de H2SO4 y 30% H2O2) e incubar a 95 ° C durante 1 hora. Nota: Solución Piraña es altamente energético y erosiva, use con precaución. Preparar solución Piraña, añadir 50 mL de H2O2 primero en un vaso de vidrio de 500 mL y luego agregar 150 mL de H2hasta4 lentamente en el vaso.</li>
		<li>Enjuague el cubreobjetos con ultrapura de H2O 5 veces. Luego lave cada cubreobjetos con ultrapura de H2O con 3 vasos llenados de la poste-limpieza de H2O y seque el cubreobjetos papel desde el borde del cubreobjetos. Coloque el cubreobjetos en el recipiente de tinción y seque el cubreobjetos cuidadosamente en un horno de 110 ° C durante 30 minutos.<ol>
<li>Enjuague el cubreobjetos con metanol y coloque la jarra de tinción en el horno de 110 ° C para secar el cubreobjetos. Nota: Secado bien el cubreobjetos es muy importante, porque APTES tendrá un montón de posibles estructuras superficiales una vez que está en presencia de agua19.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Funcionalización de cubreobjetos<ol>
<li>Agregar 70 mL de solución de silano (93% de metanol, 5% acético y 2% APTES) en cada frasco, el tapón de rosca y deje el frasco a temperatura ambiente durante la noche.</li>
		<li>Lave y seque el cubreobjetos, como se describe en el paso 3.1.5, excepto seco el cubreobjetos con nitrógeno en lugar de colocar en el horno.</li>
		<li>Disolver 150 mg de mPEG (metoxi-polietilenglicol) y 6 mg de biotina-PEG (biotina-polietilenglicol) en 1 mL de 0.1 M hizo fresco NaHCO3 (pH 8.2) completamente. Luego centrifugar a 17, 000 x g durante 1 min quitar las clavijas insolubles. Nota: Recién hecho NaHCO3 está listo; no hay necesidad para ajustar su pH.</li>
		<li>Pon el cubreobjetos silanizada en cajas y dos cubreobjetos pequeño en la parte superior de dos extremos de los cubreobjetos silanizada. Pipetear 100 μl de solución de PEG en el centro del cubreobjetos silanizada y coloque otro cubreobjetos silanizada en la parte superior.</li>
		<li>Añadir algunos ultrapura de H2O en el cuadro para mantenerlo húmedo e incubar el cubreobjetos con solución de PEG durante al menos 3 h en la oscuridad. Una incubación durante la noche puede trabajar así.</li>
		<li>Separar los pares de cubreobjetos mantener la cara superficial funcionalizada, enjuague el cubreobjetos utilizando extensivamente ultrapura de H2O y séquelos con gas nitrógeno.</li>
		<li>Marca el lado funcionalizado de cubreobjetos en uno de los rincones con un rotulador, mantenga el lado funcionalizado boca arriba, coloque en cajas y almacena las cajas en el desecador de vacío durante 1 mes.</li>
		<li>Para almacenar el cubre-objetos durante más tiempo, coloque un cubreobjetos en un tubo de 50 mL con un agujero en la tapa, luego poner el tubo en una bolsa de plástico y selle la bolsa con un sellador del vacío. De esta manera, el cubreobjetos pueden almacenarse a-20 ° C aproximadamente 3 meses.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. unidad de celda de flujo de
<ol><li>Corte un canal 15 mm × 2 mm en el centro de un pedazo de cinta de doble cara (30 x 12 mm) con un golpeador.</li>
	<li>Desprenda el lado de papel de la cinta de doble cara y pegarlo en la diapositiva de cristal con dos agujeros. Presione para quitar burbujas de aire. Basándonos en nuestra experiencia, es más fácil eliminar las burbujas de aire desprendiendo la parte del papel que el lado plástico de la cinta de doble cara.</li>
	<li>Un cubreobjetos funcionalizado (60 x 24 mm) a cortar cuatro piezas (30 x 12 mm) utilizando un vidrio punta de diamante Escribano y eliminar los desechos usando nitrógeno gas. Recuerde que debe mantener el funcionalizados cara.</li>
	<li>Desprenda el lado plástico de la cinta de doble cara y pegue la diapositiva en el cubreobjetos funcionalizado. Presione suavemente para quitar burbujas de aire entre el cubreobjetos y la cinta. Eliminar completamente las burbujas de aire puede proteger la célula de flujo de fuga mientras que los tampones se bombea en él.</li>
	<li>Insertar entrada y la tubería de salida en agujeros grandes y pequeñas, respectivamente. Fijar el tubo con resina.</li>
	<li>Bomba de 20 μl de estreptavidina (0,2 mg/mL) en la celda de flujo usando una jeringa manual e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego bomba bloqueo buffer10 en la celda de flujo para reemplazar a estreptavidina y mantenerlo a temperatura ambiente.</li>
</ol>5. sola molécula visualización
<ol><li>Obtener la alineación focal rojo y far-red con el A5 en la diapositiva de prueba de microscopio de fluorescencia #1 excitación simultánea utilizando láser 532 nm y una 640 nm láser. Producir imágenes de longitud de onda dual con división óptica (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Coloque la celda de flujo en el microscopio y conecte la tubería de salida a un largo tubo conexión con un resorte de 10 mL instalado en una bomba de infusión retiro automatizado programable. Nota: Bombeo de buffers en la célula de flujo mencionada significa retirar topes del tubo de entrada de la célula de flujo para la jeringa.</li>
	<li>Bomba de solución amortiguadora de bloqueo en 500 μl/min en la célula de flujo para eliminar el aire rápidamente y asegurarse de que el búfer en la celda de flujo es desbloqueado. Entonces la solución amortiguadora de bloqueo de la bomba a 200 μL/min en la célula de flujo y tapa el tubo de salida para eliminar las burbujas de aire de la tubería de entrada y la celda de flujo completamente. Nota: Todos los búferes bombeados dentro de la célula de flujo deben ser desgasificados en un desecador de vacío durante al menos 15 minutos antes de usar.</li>
	<li>Añadir 0,5 μl de biotinilado λ-ARS317 ADN en 80 μl de solución amortiguadora de bloqueo y bomba dentro de la célula de flujo en 25 μl/min durante 2 minutos. Luego enjuague ARS317 λ DNA con 200 μL de solución amortiguadora de bloqueo a una tasa de 50 μl/min.</li>
	<li>200 μL de binding buffer10 a razón de 50 μl/min para quitar el amortiguador de bloqueo en la celda de flujo de la bomba.</li>
	<li>Añadir 0,2 μl de streptavidin recubierto Qdot705 (1 μm) y 0.2 μl de biotinilado ORC (1,2 μm) en un tubo e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos. A continuación añadir 20 μl de binding buffer en el tubo y coloque en hielo. La concentración final de ORC Qdot705 es alrededor de 10 nM.</li>
	<li>Añadir 2 μl de ORC Qdot705 (10 nM), 1 μl de la TDT (100 mM), 1 μl de la ATP (200 mM) en 96 μl de tampón de Unión. La concentración final de ORC Qdot705 es de 0.2 nM.</li>
	<li>Bomba de 20 μl de 0,2 nM ORC Qdot705 a razón de 10 μl/min en la célula de flujo. Lave de excesiva ORC Qdot705 con 200 μL de tampón de unión a razón de 100 μl/min. Luego el tampón de Unión bomba con 30 nM SYTOX naranja dentro de la célula de flujo para teñir sustratos de ADN a un ritmo de 100 μl/min.</li>
	<li>Excitar la señal de705 ORC Qdot y SYTOX naranja manchado señal de ADN usando un 405 nm láser y láser de 532 nm, respectivamente. Observar las señales simultáneamente con 100 μl/min del flujo usando un filtro pasabanda de banda cuádruple (FF01-446/510/581/703-25) y grabar las imágenes por el EM-CCD con 100 ms por fotograma. Recoger 20 pilas de imágenes de diferentes campos.</li>
</ol>6. Análisis de datos
<ol><li>Cultivo las imágenes utilizando el software de Fiji con un nuevo plugin, que es modificado por nosotros basadas en el plugin de imagen (OI_cut_RGBmerge) desarrollado por laboratorio el Dr. Ron Vale Universidad de California en San Francisco.<ol>
<li>Una pila de imágenes (512 × 512 píxeles) de los cultivos en dos pilas de imágenes (256 × 256 píxeles). Uno es un 532 nm láser resultado emocionante, y el otro es un 405 nm láser resultado emocionante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Proceso de 61 imágenes secuenciales mediante proyecto de la Fiji-imagen-pilas-Z (intensidad media).</li>
	<li>Mida la longitud de la DNA (ADNde L) y la distancia entre el sitio de ORC Qdot705 (LORC) enlace sobre el ADN y el ADN había atado final manualmente.</li>
	<li>Calcular el resultado de LORC/lADN usando excel, analizar los datos utilizando el método de bootstrap por R, entonces crear el histograma y ajuste de distribuciones Gaussian.</li>
</ol>

<ol><li>Fu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Bypass+of+a+Lagging+Strand+Roadblock+by+the+Eukaryotic+Replicative+DNA+Helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase.</a> Cell. 146 (6), 930-940 (2011).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, presentamos un protocolo para observar la interacción entre la proteína marcada Qdot y el ADN λ site-specifically modificado utilizando el TIRFM en una celda de flujo. Las medidas incluyen la modificación específica de sustrato de ADN, ADN biotinylation, cubreobjetos limpieza y funcionalización, celda de flujo la preparación y proyección de imagen de una sola molécula. Hay dos puntos clave que deben tenerse. En primer lugar, todos los pasos involucrados con λ DNA deben manipularse con cuidado para reducir posibles ...

Las interacciones entre proteínas y ADN son esenciales para muchos procesos biológicos complejos, como la replicación del DNA, la reparación del ADN y la transcripción. Aunque los enfoques convencionales han arrojado luz sobre las propiedades de estos procesos, muchos de los mecanismos claves aún no están claros. Recientemente, con el rápido desarrollo técnicas sola molécula, algunos de los mecanismos han sido accedido1,2,3.
La aplicación de la microscopia de la fluorescencia de una sola molécula en visualizar las interacciones DNA proteína en tiempo real sobre todo depende del desarrollo de la detección de fluorescencia y sondas fluorescentes. Para el estudio de una sola molécula, es importante identificar la proteína de interés con una sonda fluorescente adecuada desde sistemas de detección de fluorescencia sobre todo están disponibles comercialmente.
Proteínas fluorescentes se utilizan en biología molecular. Sin embargo, el bajo brillo fluorescente y estabilidad contra el fotoblanqueo restringen su aplicación en muchos análisis a la sola molécula. Puntos cuánticos (Qdots) son pequeños emisores de luz nanopartículas4. Debido a sus propiedades ópticas únicas, Qdots son 10 - 20 veces más brillantes y varios miles de veces más estable que el ampliamente utilizado orgánicos colorantes5. Por otra parte, Qdots tienen un gran Stokes shift (la diferencia entre la posición de los picos de excitación y emisión)5. Así, Qdots puede utilizarse para la observación desde hace mucho tiempo (minutos a horas) y adquisición de imágenes con altos cocientes signal-to-noise, mientras que no pueden ser utilizados en los ensayos cuantitativos.
Hasta la fecha, existen dos enfoques para identificar una proteína diana con Qdots site-specifically: etiquetado con la ayuda de anticuerpos primarios o secundarios conjugados Qdot6,7,8; o etiquetado la proteína diana con Qdots directamente, que se basa en la fuerte interacción entre biotina y estreptavidina9,10,11,12,13. Recubiertas de estreptavidina Qdots están comercialmente disponibles. En nuestro reciente estudio, site-specifically proteínas biotinilado en levadura de florecimiento con la eficacia alta se purificaron por co-sobreexpresión de BirA y proteínas etiquetadas Avi en vivo10. Siguiente y optimización de los ensayos de una sola molécula14,15,16,17, observamos las interacciones entre etiquetado Qdot proteínas y DNA en la sola molécula nivel utilizando TIRFM10.
Aquí, elegimos el florecimiento levadura origen reconocimiento complejo (ORC), que específicamente puede reconocer y unirse a la secuencia de replicación autónoma (ARS), como la proteína de interés. El siguiente protocolo presenta un procedimiento paso a paso de visualizar la interacción de ORC Qdot etiquetados con ARS usando TIRFM. Se describen la preparación del sustrato de ADN site-specifically modificado, la Biotinilación de ADN, la limpieza de cubreobjetos y funcionalización, el montaje de celda de flujo y la proyección de imagen de una sola molécula.

<table><tbody><tr><td>Lambda DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>N3011</td><td>Tienda 25 &mu; L alícuotas a -20 &ordm;C.</td></tr><tr><td>XhoI enzima</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0694</td><td></td></tr><tr><td>Kit de clonación de fusión rápida</td><td>Biotool</td><td>B22611</td><td></td></tr><tr><td>MaxPlax Lambda Packaging Extracts</td><td>Epicentre</td><td>MP5110</td><td>La cepa bacteriana LE392MP está incluida en este paquete.</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10013092</td><td>Cualquier marca es aceptable.</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Beijing Chemical works</td><td>N/A</td><td>Cualquier marca es aceptable.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10012818</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Beijing Chemical Works</td><td>N/A</td><td>Cualquier marca es aceptable.</td></tr><tr><td>NZ-amina</td><td>Amresco</td><td>J853-250G</td><td></td></tr><tr><td>Ácidos Casamino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22090-500G</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Beyotime</td><td>ST483</td><td></td></tr><tr><td>Aparato de agitación magnética</td><td>IKA</td><td>KMO2 basic</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubo Eppendorf Eppendorf</td><td>30122151</td><td></td><td>15 mL, estéril, a granel, 500 piezas</td></tr><tr><td>Rnase</td><td>SIGMA</td><td>R4875-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Dnase</td><td>SIGMA</td><td>D5319-500UG</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Amresco</td><td>0706-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Imprimaciones biotiniladas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa, T4 ADN ligasa, tampón de reacción (10x)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22266882</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10009259</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>306568-100G</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A949-4</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>80120891</td><td>ácido sulfúrico</td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10011218</td><td>30% Peróxido de hidrógeno</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322415-2L</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900798</td><td></td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>mPEG (metoxi-polietilenglicol)</td><td>Lysan</td><td>mPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>biotina-PEG (biotina-polietilenglicol)</td><td>Lysan</td><td>Biotin-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31437-500G</td><td></td></tr><tr><td>Desecador de vacío</td><td>Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd.</td><td>IPC250-1</td><td></td></tr><tr><td>Envasadora al vacío</td><td>MAGIC SEAL</td><td>WP300</td><td></td></tr><tr><td>Trazador de vidrio con punta de diamante</td><td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td><td>70036</td><td></td></tr><tr><td>Corredera de vidrio</td><td>Marca de vela</td><td>7101</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de entrada</td><td>SCI (Scientific Commodties INC.)</td><td>BB31695-PE/2</td><td>diámetro interior 0,38 mm; diámetro exterior 1,09 mm.</td></tr><tr><td>Tubo de salida</td><td>SCI (Scientific Commodties INC.)</td><td>BB31695-PE/4</td><td>diámetro interior 0,76 mm; diámetro exterior 1,22 mm.</td></tr><tr><td>Cinta adhesiva de doble cara</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GBL620001-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Epoxi</td><td>LEAFTOP</td><td>9005</td><td>cinco minutos epoxi</td></tr><tr><td>Estreptavidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4762</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Bomba programable de infusión/extracción </td><td>Aparato Harvard</td><td>70-4504</td><td></td></tr><tr><td>Láser de 532 nm</td><td>Láser coherente</td><td>Zafiro-532-50</td><td></td></tr><tr><td>nm Coherente</td><td></td><td>OBIS-640-100</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Cámara</td><td>Andor</td><td>DU-897E-CS0-BV</td><td></td></tr><tr><td>W-View Gemini Imaging óptica de división</td><td>Hamamatsu fotónica K.K.</td><td>A12801-01</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de iluminación TIRF</td><td>Olympus</td><td>IX2-RFAEVA2</td><td></td></tr><tr><td>60&times; Objetivo TIRF</td><td>Olympus</td><td>APON60XOTIRF</td><td></td></tr><tr><td>Divisor de haz dicroico láser de cuatro filos</td><td>Semrock</td><td>Di01-R405/488/ 532/635-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda cuádruple</td><td>Semrock</td><td>FF01-446/510/ 581/703-25</td><td></td></tr><tr><td>Divisor de haz dicroico</td><td>Semrock</td><td>FF649-Di01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de emisión</td><td>Tecnología Chroma Corp</td><td>ET585/65m</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de emisión</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>ET665lp</td><td></td></tr><tr><td>FocalCheck fluorescencia, portaobjetos de prueba de microscopio #1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F36909</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Naranja</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>Qdot705 Estreptavidina Conjugado</td><td>Thermo Fisher Scientific Q10163MP</td><td></td><td>Store a las 4 &ordm; C, no congelar.</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Amresco</td><td>0220-25G</td><td>Prepare una solución de ATP de 200 mM, utilizando ddH2O, ajuste el pH a 7.0 y almacene 10 &mu; L alícuotas a -20 &ordm;C.</td></tr><tr><td>TDT</td><td>Amresco</td><td>M109-5G</td><td>Prepare la solución 1 M utilizando ddH2O, y almacene 10 &mu; l alícuotas a -20 &ordm;C.</td></tr></tbody></table>

visualizar la interacción entre la proteína marcada qdot y λ site-specifically modificada de adn en el nivel de molécula única

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

La microscopía de fluorescencia ha hecho grandes contribuciones en la disección de los mecanismos de los procesos biológicos complejos en el plano de la molécula sola. En los ensayos de molécula única para el estudio de las interacciones DNA proteína, hay dos factores importantes para su consideración: el sustrato de ADN con suficiente longitud para la observación fácil y etiquetado una proteína con una sonda fluorescente adecuada. 48,5 kb λ DNA es un buen candidato para el sustrato de la ADN. Puntos cuánticos (Qdots), como una clase de sondas fluorescentes, permiten la observación de largo plazo (de minutos a horas) y adquisición de imágenes de alta calidad. En este trabajo, presentamos un protocolo de estudio de las interacciones DNA-proteína a nivel de una sola molécula, que incluye preparar un site-specifically modificado λ DNA y etiquetado una proteína diana con Qdots recubiertas de estreptavidina. Para una prueba de concepto, elegir ORC (reconocimiento de origen complejo) en levadura de florecimiento como una proteína de interés y visualizar su interacción con un ARS (secuencia de replicación Autónoma) usando TIRFM. En comparación con otras sondas fluorescentes, Qdots tienen ventajas obvias en los estudios de molécula única debido a su alta estabilidad contra el fotoblanqueo, pero cabe señalar que esta propiedad limita su aplicación en ensayos cuantitativos.

Para visualizar la interacción entre etiquetado Qdot ORC y la ARS, se construyó primero el sustrato de ADN λ ARS317. Un fragmento de ADN que contiene ARS317 fue integrado en Xhositio (33,5 kb) de nativos λ DNA por recombinación homóloga (figura 1A). El producto de la recombinación fue empaquetado usando los extractos y las partículas de fagos empaquetados fueron cultivadas en placas de LB (figura 1B). La placa de fagos p...

Aquí, presentamos un protocolo de estudio de las interacciones DNA-proteína por microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) utilizando un sustrato de ADN λ site-specifically modificado y un etiquetado proteína del punto cuántico.

Visualizar la interacción entre la proteína marcada Qdot y λ Site-specifically modificada de ADN en el nivel de molécula única

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...

Este método puede ayudar a responder a las preguntas clave en el campo de la obtención de imágenes de moléculas individuales de las interacciones entre las proteínas del ADN, como la replicación del ADN, la reparación de genes y el mantenimiento de la estructura de los cromosomas. La principal ventaja de esta técnica es que se puede obtener ADN lambda modificado con alto contenido de colágeno y luego curar rápidamente las proteínas marcadas. La demostración visual de este método es fundamental porque los pasos de ensamblaje de la celda de flujo son difíciles de aprender.Para limpiar los cubreobjetos, coloque 20 cubreobjetos en cuatro frascos de tinción, vierta etanol en ellos y sonique durante 30 minutos en etanol. A continuación, enjuague los cubreobjetos con agua ultrapura tres veces. A continuación, sonique los cubreobjetos con un molar de hidróxido de potasio durante 30 minutos y enjuague los cubreobjetos con agua ultrapura tres veces.A continuación, repita la sonicación con etanol e hidróxido de potasio una vez. Sonicar los cubreobjetos con acetona durante 30 minutos y luego enjuagar bien con agua ultrapura. Ahora coloque los cubreobjetos en la solución de piraña e incube a 95

visualizing-interaction-between-qdot-labeled-protein-site

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Se presenta un nuevo y poderoso de integración de la nanofotónica (QD-FRET) y microfluídica para investigar la formación de polyplexes polielectrolito, que se espera que proporcione un mejor control y síntesis de polyplexes uniforme y personalizable para a base de ácido nucleico futuras terapias.

La combinación de QD-FRET y microfluídica para monitorear Nanocomplex ADN auto-ensamblado en tiempo real

Este video describe un método para visualizar el ensamblaje de condensados de proteínas de fusión en moléculas de ADN en loci específicos utilizando imágenes de una sola molécula. Estos condensados se forman debido a las interacciones LCD-LCD y LCD-DBD, que permiten el reclutamiento de ARN polimerasa II y una mejor transcripción de genes.

Imágenes de una sola molécula para visualizar el ensamblaje de condensados de proteínas de fusión en cortinas de ADN

Microscopía de localización fotoactivado (PALM) combinada con el seguimiento de una sola molécula permite la observación directa y la cuantificación de la proteína-DNA en células de E. coli vivas de Escherichia.

Visualización de la proteína-DNA en células bacterianas en directo mediante fotoactivado Tracking Single-molécula

Aquí se describe la instrumentación y métodos para la detección de moléculas de proteína única etiquetados con fluorescencia que interaccionan con una sola molécula de ADN suspendido entre dos microesferas ópticamente atrapados.

Combinando Manipulación sola molécula y de imagen para el estudio de las interacciones proteína-ADN

Proporcionamos instrucciones detalladas para la preparación de puntos cuánticos dirigidos monovalentes (mQDs) a partir de ADN fosforotioato de longitud definida. El envoltorio de ADN se produce con un alto rendimiento y, por lo tanto, los productos no requieren purificación. Demostramos el uso de la etiqueta SNAP para dirigir mQDs a receptores de superficie celular para aplicaciones de imágenes de células vivas.

Producción y focalización de monovalente Quantum Dots

Las imágenes espectroscópicas electrónicas pueden obtener imágenes y distinguir el ácido nucleico de la proteína con una resolución nanométrica. Se puede combinar con el sistema miniSOG, que es capaz de etiquetar específicamente proteínas marcadas en muestras de microscopía electrónica de transmisión. Ilustramos el uso de estas tecnologías utilizando como ejemplo los focos de reparación de roturas de doble cadena.

Visualización de miniSOG Tagged proteínas de reparación de ADN en combinación con Electron espectroscópico Imaging (ESI)

Aquí se demuestra cómo se puede usar el Ensayo de Ligación de Proximidad in situ (PLA) para detectar y visualizar las interacciones directas proteína-proteína entre ATM y p53 en cultivos de células en suspensión expuestos al estrés genotóxico.

Detección y visualización de los complejos de proteínas inducidos por daño de ADN en cultivos de células en suspensión usando el ensayo de ligación de proximidad

Después del daño del ADN, las células humanas activan vías de reparación esenciales para restaurar la integridad de su genoma. Aquí, describimos el método de inmunofluorescencia indirecta como un medio para detectar proteínas de reparación del ADN, analizar su reclutamiento espacial y temporal, y ayudar a interrogar la interacción proteína-proteína en los sitios de daño del ADN.

Visualización de la interacción de proteínas de reparación del ADN por inmunofluorescencia

Utilizando ADN marcado con puntos cuánticos y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total, podemos investigar el mecanismo de reacción de las endonucleasas de restricción mientras usamos proteínas no marcadas. Esta técnica de una sola molécula permite la observación masiva y multiplexada de las interacciones individuales proteína-ADN, y los datos se pueden agrupar para generar distribuciones de tiempo de permanencia bien pobladas.

Análisis de tiempo de permanencia de una sola molécula de la escisión de ADN mediada por endonucleasas de restricción

El presente protocolo destaca un método modificado para detectar y cuantificar los enlaces cruzados ADN-proteína (DPCs) y sus modificaciones postraduccionales (PTMs), incluyendo la ubiquitilación, la SUMOilación y la ADP-ribosilación inducida por inhibidores de la topoisomerasa y por formaldehído, permitiendo así el estudio de la formación y reparación de DPCs y sus PTMs.

Detección cuantitativa de enlaces cruzados ADN-proteína y sus modificaciones postraduccionales

Este protocolo demuestra la realización de un ensayo de una sola molécula para la visualización en vivo del desenrollado del ADN por helicasa CMG. Describe (1) la preparación de un sustrato de ADN, (2) la purificación de la helicasa CMG de Drosophila melanogaster marcada con fluorescencia, (3) la preparación de una celda de flujo microfluídica para la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) y (4) el ensayo de desenrollado de ADN de una sola molécula.

Visualización en tiempo real de una sola molécula del desenrollado del ADN mediante CMG Helicase

Aprende a visualizar interacciones ADN-proteína a nivel de molécula única usando microscopía TIRFM con ADN λ modificado y proteínas marcadas con puntos cuánticos. Este protocolo facilita el estudio de replicación y reparación del ADN.

Visualizar la interacción entre la proteína marcada Qdot y λ Site-specifically modificada de ADN en el nivel de molécula única

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