Name: Campionamento e pretrattamento dello smalto dei denti carbonato per carbonio stabile e analisi di isotopi di ossigeno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Scopri il campionamento sequenziale dello smalto dentale per l'analisi degli isotopi stabili di carbonio e ossigeno. Questo metodo non distruttivo ricostruisce dieta e ambiente in archeologia e paleontologia.

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Vorremmo ringraziare la società Max Planck per finanziare questa ricerca così come l'impostazione di recente di un laboratorio di isotopo stabile presso il dipartimento di archeologia, Max Planck Institute per la scienza della storia umana.

Il seguente protocollo segue le linee guida del laboratorio di spettrometria di massa isotopo luce presso il Max Planck Institute per la scienza della storia umana. Autorizzazioni appropriate etica dai comitati nazionali e internazionali dovrebbero essere cercate per le analisi che coinvolgono in pericolo esemplari faunistici moderni o storici e per l'uso di materiale archeologico e faunistico di interesse agli stakeholder contemporaneo . In questa carta, i campioni utilizzati sono stati esemplari fossili e archeologici. Nessun essere umano vivente sono stato utilizzato in questo studio e autorizzazioni completo etiche, istituzionali e governative sono state acquisite per qualsiasi analisi distruttive.
1. campionamento di massa
Nota: Per gli esseri umani e gli animali, il metodo di base di massa lo smalto dei denti il campionamento è l'applicazione di un trapano al bordo vestibolare del dente.
<ol><li>Pulire la superficie esterna del dente (~0.1 mm) con un colpo di blaster di alluminio o di abrasione delicata utilizzando il trapano set-up. Utilizzare un trapano a mano con un trapano pulito punta di diamante (Vedi sotto), un po' di forma anche, attaccata tramite un mandrino trapano set-up. Garantire che all'abrasione delicata e perfino viene eseguita come una scanalatura parallela all'asse di crescita intero (Figura 1 e Figura 2).</li>
	<li>Cercare, ove possibile, di applicare il metodo per la stessa porzione di dente per ogni essere umano o animale sottoposto a campionamento. Nota: Nella ricerca umana paleodietary, terzi molari sono generalmente favoriti come rappresentante del tardo giovanile/adulta dieta mentre primi molari sono evitati a causa di effetti23di svezzamento. Il dente preferito per ogni taxon e il periodo di vita rappresentato, varierà con i campioni disponibili e la domanda in fase di studio.</li>
	<li>Trapano in una stanza ben ventilata mentre indossa una mascherina per evitare l'inalazione di polvere di smalto del dente. Indossare occhiali per proteggere gli occhi. Essere consapevoli del fatto che la quantità di polvere di campione forata variano a seconda l'attrezzatura utilizzata per l'analisi, protocollo di pretrattamento e dimensioni del dente. Trapano a bassa velocità per evitare il riscaldamento del campione. Nota: Approssimativamente, 4-8 mg di polvere di campione è un obiettivo adatto per analisi multiple utilizzando un sistema di preparazione e introduzione di gas online per spettrometria di massa di rapporto isotopico e diagenetici test. Essere consapevoli del fatto che la velocità del trapano selezionate dipenderà la fragilità del campione e richiederà un certo livello di tentativi ed errori. In generale, su un trapano a mano, due delle cinque barre di forza sono sufficienti. Perforare la polvere di dente sopra un pezzo di carta stagnola pulita o carta di pesatura.</li>
	<li>Raccogliere la polvere risultante di smalto e trasferirlo in una provetta da 1,5 mL micro-centrifuga che è stata tarata su un bilanciamento accurato in modo appropriato prima della foratura. Etichettare ogni provetta con l'indicazione di esempio (Figura 3). Registrare il peso di numeri e lo smalto di campione in un quaderno di laboratorio, nonché una banca dati elettronica.</li>
	<li>Prima di forare ogni dente nuovo, pulire le punte utilizzate prima usando 0,5 M HCl su un tessuto robusto. Poi lavare la punta del trapano con un solvente organico (ad esempio acetone, metanolo o etanolo) utilizzando un tessuto robusto.</li>
	<li>Dopo una foratura seduto, pulire l'area di lavoro accuratamente utilizzando un apposito aspiratore, o una scopa e paletta. Pulire lo spazio di campionamento con metanolo. Vuoto o leggermente spruzzare il trapano ad aria compressa per rimuovere la polvere polvere e campione tra i campioni.</li>
</ol>2. sequenza campionamento
Nota: Campionamento sequenza può essere affrontato in una varietà di forme e dipenderà il taxon campionato, la dimensione del dente, come pure la risoluzione temporale desiderata.
<ol><li>Pulire la superficie del dente campionata rimuovendo un molto sottile (~0.1 mm) strato di smalto esterno.</li>
	<li>Forare i campioni lungo la superficie buccale perpendicolare all'asse di crescita del dente, che dallo svincolo di radice di smalto alla sommità della corona. Trapano fasce orizzontali perpendicolari all'asse di crescita, con ciascun campione risultante in una scanalatura larga 1-2 mm tra lo strato di smalto (Figura 1 e Figura 4). Prestare attenzione per evitare la perforazione attraverso lo smalto in dentina come esso potrebbe contaminare il campione e la misura risultante. Nota: Il numero di campioni prelevati varierà a seconda della risoluzione desiderata ma c. 10 rappresenta un obiettivo adatto per studiare i cambiamenti stagionali in δ13C e i valori δ18O per una hypsodont la dimensione di bovini domestici.</li>
	<li>Scegliere la punta del trapano appropriato per ciascun campione, come la larghezza della linea di campionamento è determinata dal diametro della fresa.</li>
	<li>Utilizzare un set-up impianto di perforazione per i denti più delicati che richiedono un maggior numero di campioni elementari (Figura 2) (ad es., denti umani), come pure per foratura più stabile. Impostare il supporto di rig che tiene saldamente, il trapano con la punta rivolta verso il basso. Nota: Mentre quattro campioni possono essere facilmente ottenuti da un molare umano permanente utilizzando un approccio manuale24, più raffinata di campionamento richiede un rig o CO2 laser ablazione approccio che non sarà discusso qui14. Un altro approccio comune è quello di utilizzare un semi-automatico Microcampionamento25.</li>
	<li>Tenere il dente o collegare ad un morsetto. Premere lo smalto dei denti contro la punta del trapano e applicare una pressione. I campioni sono forati in modo incrementale lungo la superficie buccale dall'apice (superficie occlusale) alla base della corona nella posizione della giunzione smalto-radice (ERJ). Replicare lo stesso campione di strategia più volte ogni consecutivi linea parallela alla linea precedente campione di perforazione di perforazione. Usare una punta di piccolo diamante cilindrica per denti delicati, come ad esempio molari di pecora, con un diametro di 1 mm (Figura 1).</li>
	<li>Misurare la distanza di ogni linea di campionamento da ERJ utilizzando pinze e registrare questa distanza per il confronto.</li>
	<li>Seguire i passaggi 1.3-1.6 sopra. Nota: Se piccoli denti delicati vengono analizzati e non vengono applicati metodi di pretrattamento e diagenetici check, campioni piccoli come 1-4 mg produrrà risultati affidabili su un assetto di preparazione e introduzione di gas on-line per l'analisi di carbonato. Sistemi automatizzati-peripheral modificati possono facilitare l'utilizzo di pesi campione ancora più bassi, ma inevitabilmente sono limitate dalla proporzione di carbonato nel studiato smalto (4-5% in peso)26,27. I ricercatori dovrebbero consultarsi con il laboratorio dove campioni stanno per essere misurate per determinare la quantità di campione richiesto.</li>
</ol>3. Metodo Fourier Transform Infrared spettrometria/attenuata riflettanza totale
<ol><li>Per il metodo di riflettanza totale attenuata, stabilire una priorità bassa camera campione, o sotto vuoto o in condizioni atmosferiche normali.</li>
	<li>Posto a circa 1 mg di smalto dei denti sopra il cristallo di diamante nel pozzetto di misurazione utilizzando una spatola. Abbassare e fissare il perno di campione fino a quando c'è un collegamento costante tra il post, il campione e la piastra di diamante. Chiudere la camera del campione, con o senza vuoto viene stabilita, a seconda del set-up o la disponibilità.</li>
	<li>Misurare gli spettri FTIR del campione 64 volte per il numero d'onda comprese tra 400 e 4.000 cm-1. Il numero desiderato di ripetizioni variano in base agli obiettivi dello studio, anche se l'analisi di tre repliche, idealmente con diverse aliquote essere preso e poi siamo tornati al tubo del microcentrifuge alloggiamento il campione, assicura risultati di robuste.</li>
	<li>Pulire la spatola con metanolo tra ciascuna aliquota e tra ogni campione.</li>
	<li>Eseguire una correzione della linea di base utilizzando il software disponibile. Il software sottrae automaticamente lo sfondo di camera campione dal profilo FTIR risultante. Per garantire la migliore riproducibilità, solo smalto spettri con un assorbimento minimo di 0,06 per la band più alta di fosfato in ~1035 cm-1 dovrebbero essere presi in considerazione.</li>
	<li>Monitorare la presenza di calcite carbonato inquinante secondario comune in tutti i campioni di controllo per un picco a 711 cm-1.</li>
	<li>In seguito all'analisi, attentamente tornare i campioni alla loro microcentrifuga utilizzando una spatola o aspirazione periferica e girare in fase di pretrattamento o analisi successiva.</li>
	<li>Esportare i dati grezzi di lunghezza d'onda e intensità come file CSV (o simili) e utilizzare per calcolare gli indici di interesse (indici comunemente utilizzati includono A-sito fosfato indice, B-sito fosfato Index, indice cristallinità di fosfato, acqua-ammide sull'indice di fosfato, e CO3/PO4 indice17,18,19) (tabella 1).</li>
	<li>Confronta il FTIR risultati da campioni di fossili o archeologici a crescente DataSet dello smalto dei denti faunistica moderno ora disponibili nella letteratura19,20 per determinare la natura e l'entità dell'alterazione diagenetica alla smalto a campionamento.</li>
</ol>4. semplice acido acetico (0.1 M) pretrattamento
<ol><li>Pesare la polvere di smalto per ogni campione in una provetta da microcentrifuga utilizzando un equilibrio come appropriato. Etichetta del tubo di conseguenza. Smalto in polvere deve essere macinato nella stessa misura, con particelle di dimensioni simili. Nota: Molti ricercatori utilizzano un agente ossidante, come candeggina diluita (NaClO) o 30% perossido di idrogeno (H2O2) per rimuovere sostanze organiche da un campione e questo deve essere aggiunto a questo punto. Tuttavia, non solo possono alterano questi reagenti il carbonio stabile e i valori dell'isotopo dell'ossigeno di un campione, ma spettri dei campioni del collagene dell'osso in un sistema di preparazione e introduzione di gas on-line dimostrano che l'acido fosforico di 100% utilizzato in carbonato misura non reagisce con campioni biologici (Figura 5), suggerendo che questo passaggio non è necessario.</li>
	<li>Aggiungere 0,1 mL di acido acetico 0,1 M (per 1 mg di smalto) per ogni campione con una pipetta. Evitare di toccare i campioni con la pipetta. Se il campione e la pipetta di entrare in contatto, è possibile utilizzare una pipetta per il campione successivo per evitare la contaminazione incrociata.</li>
	<li>Agitare, mediante agitazione o un agitatore elettronico (Figura 3) e poi lasciare i campioni a sedere per 10 min. polvere di smalto non deve essere lasciato in acido acetico per un periodo di tempo prolungato (> 4 h).</li>
	<li>Posizionare i campioni in una microcentrifuga per 2 min a 13.700 x g. Nota: Un'alternativa di basso costo è l'uso di una mini-centrifuga per 4 min a 3.500 x g, che detiene meno campioni, ma è molto meno tempo quando si tratta di insiemi di grandi campioni.</li>
	<li>Quando si interrompe il programma microcentrifuga, sostituire l'acido acetico con 2 mL di acqua ultrapura usando una pipetta pulita, quindi microcentrifuga i campioni per 2 min a 13.700 x g.</li>
	<li>Cambiare l'acqua ultrapura altre due volte, come prima e test per la neutralità. Rimuovere il liquido rimanente utilizzando una pipetta (senza disturbare il surnatante). Nota: Un totale di tre lavaggi con acqua ultrapura è la procedura standard per raggiungere la neutralità. Il campione deve essere lavato fino al raggiungimento della neutralità.</li>
	<li>Tagliare i fogli di Parafilm (1 × 1 cm) e mettere sopra ogni tubo del microcentrifuge. Fare un piccolo foro al centro con un oggetto appuntito, in modo che il campione si asciuga in modo appropriato.</li>
	<li>Disporre le provette in un congelamento essiccatore per rimuovere il liquido residuo. Nota: Se un congelamento essiccatore non è disponibile, dolce forno asciugatura (40 ° C) è anche una possibilità e non dovrebbe avere effetti negativi sul carbonio stabile e dati dell'isotopo dell'ossigeno.</li>
	<li>Una volta asciutto, rimuovere il Parafilm e chiudere i coperchi microcentrifuga. Assicurarsi che il tubo di etichettatura sia corretto e ri-scrivere se necessario. Nota: Questa è la fase finale prima del deposito per la pesatura di fuori, che nei laboratori con fondi limitati può essere la fase finale prima della distribuzione dei campioni per analisi altrove.</li>
</ol>5. pesatura e la misurazione di campioni e Standards
<ol><li>Con una spatola, pesare circa 2 mg di polvere di smalto su un disco stagno su un equilibrio sensibile a 0,001 mg (Figura 6). Quindi trasferire con cautela il campione in una fiala di vetro borosilicato resistente all'acido fosforico. Questa quantità di smalto è necessario per produrre risultati affidabili a causa della percentuale relativamente modesta di carbonato nello smalto dei denti.</li>
	<li>Pulire la spatola tra campioni usando il metanolo e utilizzare un disco fresco, pulito o pesata nave per ciascun campione.</li>
	<li>Pesare 0,2 mg di livello internazionale quali AIEA NBS18, AIEA 603, AIEA CO8 o Merck CaCO3. Un House standard effettuato in smalto omogeneizzato di un grande dente può essere utilizzato come pozzo20. Per un'esecuzione completa di 76 campioni e, standard uso 61 campioni e 15, che deve essere ripartito uniformemente su tutta la corsa. Parecchi studi hanno riferito il numero appropriato di norme e dettagli nella ricerca archeologica20,28. Nota: Il pretrattamento ripetuto e analisi di uno smalto in standard della casa, attraverso un numero di esecuzioni di campioni archeologici, è anche probabile che forniscono una misura appropriata di precisione per i campioni in fase di Studio20.</li>
	<li>Serrare i coperchi appositamente progettato, accessibili per l'ago fino a quando il setto è stretto ma non risucchiato nel flaconcino. Non stringere eccessivamente il coperchio come la pressione sul setto otterrà troppo forte e in ultima analisi, può provocare un ago rotto durante l'analisi. Posizionare le fiale in un ordine elencato all'interno di un blocco di riscaldamento a 70 ° C. L'ordine e i pesi dei campioni devono essere registrati in modo affidabile per l'ingresso nel software del computer.</li>
	<li>Misurare i campioni seguendo tre passi: 1) a filo riempire i campioni con elio puro, 2) aggiungere acido fosforico, 3) misurare il campione.<ol>
<li>Lavare i campioni con elio puro (grado 5.0) con un flusso di 100 mL/min per 5 min scovare aria ambiente.</li>
		<li>Aggiungere 4-5 gocce di acido fosforico (99%, densità 1,85 g/mL) al campione contenenti carbonato. Reazione tra il campione e la H3PO4 comincia. Durante la reazione di CO2 è uscito che trasporta il valore isotopico dello ione carbonato CO32 - del campione.</li>
		<li>Attendere 1 h per campione per l'equilibratura di CO2 è raggiunto. Dopo 1 h, i campioni dovrebbero essere misurati per ottenere risultati affidabili. Durante l'acquisizione, una miscela di gas campione e passare al dispositivo. Una fase di asciugatura rimuove l'acqua da una miscela di gas campione.</li>
		<li>Misurare l'esempio iniziando con tre picchi di gas di riferimento di CO2 con una composizione isotopica conosciuta. Intensità di picco dovrebbe essere 4000 mV per abbinare l'intensità dei picchi del campione (tra 4000 e 8000 mV). Le tre cime di gas di riferimento dovrebbero essere 20 s lunga e 30 s apart. Seguire con definisce l'intervallo di misurazione del campione. Misurare il campione 10 volte per 5 s ciascuno e 55 s apart. Garantire che altezza picco diminuisce con il tempo che indica il corretto trasporto della miscela campione/Elio (Figura 5). Nota: Durante la misurazione, il software calcola la composizione isotopica del campione confrontando il valore noto isotopica, l'altezza del picco e area del picco del gas riferimento con l'altezza di picco e area dei picchi dei campioni. Il crudo 13C /12C e 18O /16O composizione del campione è calcolata.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Normalizzare i campioni dopo la misurazione. Nota: Questo è importante perché il gas di riferimento non subisce lo stesso percorso di chimico e fisico come il campione di gas quando introdotto nello spettrometro di massa. Pertanto, è essenziale che i campioni sono inoltre calibrati per gli standard internazionali (punto 5.3) che subiscono lo stesso trattamento fisico e chimico all'interno di una corsa come il campione stesso20. Questi standard internazionali carbonato attivare la calibrazione a due punti di campioni su una scala di misurazione internazionale delta e la valutazione della precisione e ripetibilità nell'intero tratto specificato.</li>
</ol>

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<li>Schoeninger, M. J., Hallin, K., Reeser, H., Valley, J. W., Fournelle, J. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/oa.653">Isotopic alteration of mammalian tooth enamel.</a> International Journal of Osteoarchaeology. 13 (1-2), 11-19 (2003).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Le sfide del successo di campionamento (massa e incrementali) della dentatura si basa sull'accesso a conoscenza per quanto riguarda tecniche di perforazione e preparazione, a fianco l'investimento in attrezzature relativamente poco costosa del campione. Queste sfide sono facilmente superabile quando chiare istruzioni sono disponibili riguardanti i metodi di campionamento e di pretrattamento. In questo articolo, speriamo di avere questi in modo chiaro e conciso diffusa per i ricercatori di nuovi a questi metodi. Gli studi...

Analisi stabile degli isotopi di carbonio e ossigeno di carbonato dello smalto del dente è stato utilizzato per studiare passato ingestione dietetica umana, lo svezzamento e mobilità, così come affidarsi faunistica di vegetazione, il movimento di animali e bestiame foddering. Queste applicazioni sono state ampiamente discusse e recensione per una varietà di condizioni ambientali che indica gli effetti dell'aridità locale, temperatura, fonti d'acqua e vegetazione composizioni1,2, 3,4,5,6. La diversità delle potenziali applicazioni in archeologia e paleontologia, così come la buona conservazione del carbonato di smalto del dente, ha reso un materiale molto interessante per isotopo stabile lavoro3. Metodi di campionamento, pretrattamento e diagenesi screening sono brevemente descritti in una serie di precedenti pubblicazioni1,7. Tuttavia, rimangono in gran parte non disponibile, in particolare a persone di fuori di laboratori di scienza archeologica e tra gruppi di laboratorio con risorse limitate, dove sta aumentando l'interesse nell'uso di questa tecnica approfondite dimostrazioni verbali e visive 5.
Lo smalto dei denti è principalmente costituito da idrossiapatite (bioapatite) cristalliti8 più grande di quelli in osso, rendendolo più resistente a sostituzioni ionico diagenetiche post mortem e contaminazione3. Studi moderni hanno dimostrato che carbonio stabile dell'isotopo (δ13C) misure del dente faunistica dello smalto in modo affidabile record animale dieta e comportamento9,10. Il valore di isotopo (δ18O) ossigeno stabile dello smalto dei denti è determinato dalla composizione isotopica dell'ossigeno dell'acqua ingerita, che include l'acqua nella pianta e alimenti di origine animale, acqua potabile, respirazione, nonché vari impatti ambientali sull'acqua che può portare a ulteriore frazionamento isotopico (ad es., aridità, quantità di precipitazioni, temperatura, altitudine, posizione continentale)11. Questo ha reso un metodo popolare per la ricostruzione dietetico ed ambientale nella ricerca archeologica, paleoecological e paleontologica.
Il periodo di formazione dello smalto dentario è relativamente breve (anni) e si differenzia a seconda del dente campionato. Per gli esseri umani, primo molare smalto detossinarsi tra nascita e 3 anni di età, premolari mineralizzano tra 1,5 e 7 anni di età, secondi molari mineralizzano tra 2,5 e 8 anni di età e terzi molari mineralizzano durante l'adolescenza, tra i 7 e i 16 anni12 . Dato che forme di smalto del dente in modo incrementale nel corso del suo periodo di formazione, possono essere campionata in massa lungo l'asse di crescita intero o campionamento in sequenza al fine di studiare i cambiamenti nella dieta e l'ambiente che si sono verificati durante il periodo di formazione13 . Il cambiamento dietetico ordinati cronologicamente all'interno di un determinato dente è osservabile per gli esseri umani e altri animali1,14, fornendo informazioni sulle inter-annuale variazione stagionale e dietetici.
Mentre lo smalto è solitamente resistente alla diagenesi, isotopiche modifiche risultanti dall'ambiente di sepoltura sono possibili e sono state osservate15,16, facendo verifiche sperimentali e pretrattamento scelte utili. Anche se non è l'unico metodo disponibile, spettroscopia a infrarossi trasformata di Fourier (FTIR), specialmente in modalità di trasmissione attenuato, è emerso come un rapido, poco costoso e relativamente accessibile metodo per la valutazione tafonomica alterazione nello smalto dei denti, specialmente in contesti paleontologico17,18,19,20. Tuttavia, dettaglio i protocolli e gli standard di registrazione rimangono relativamente inaccessibili per molte persone fuori i campi della scienza geochimica o materiale.
Tempi di reazione e le sostanze chimiche impiegate dai ricercatori nel pretrattamento dello smalto dei denti anche variano considerevolmente nella letteratura, spesso con limitata considerazione quanto a che cosa può fare questa variabilità per carbonio stabile e i valori dell'isotopo dell'ossigeno del campione21 ,22. Qui, segnaliamo un approccio che usi diluire acido acetico (0.1 M) per il pretrattamento dei campioni di polvere di smalto. Tuttavia, dato che le differenze nelle misurazioni isotopiche derivando dal pretrattamento sono relativamente minori per lo smalto dei denti, è meglio per i ricercatori di seguire i protocolli per i DataSet con cui desiderano confrontare i loro dati a11. Inoltre, dove piccoli campioni sequenziali sono prese, in particolare sui campioni dell'Olocene, nessun pretrattamento può essere scelti (a seguito di test pilota diagenetici) per evitare lo spreco di campione.
Anche se i metodi che segnaliamo qui non sono affatto nuovi, a nostra conoscenza, questa è la prima volta che una documentazione approfondita di scritta e visiva di massa e campionamento sequenza, pretrattamento scelte e metodi di controllo diagenetica (sotto forma di FTIR) per dente smalto sono state apportate ampiamente disponibile un variegato pubblico accademico. Mentre ci auguriamo che i nostri sforzi farà questo approccio più facilmente accessibile a un più ampio numero di individui e laboratori, i ricercatori che vogliono applicare e pubblicare questa tecnica devono essere consapevoli di minimo reporting standard, considerazioni diagenetiche, e requisiti di presentazione monitorata altrove20, come pure la potenziale complessità interpretativa che saranno unici per la loro regione di studio, taxa analizzati e tempo periodo5.

<table><tbody><tr><td>Dremel Micro</td><td>Dremel</td><td></td><td>https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/tools/8050-micro</td></tr><tr><td>Punta diamantata</td><td>Dremel</td><td></td><td>https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/accessories/7122-diamond-wheel-point</td></tr><tr><td>provetta per microcentrifuga da 1,5 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t2422?lang=de&region=DE&gclid=EAIaIQ obChMI7pHRpauW2QIV77ftCh1p1 wjhEAAYASAAEgKzkvD_BwE</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td></td><td></td><td>Formula lineare:&nbsp; CH3OH</td></tr><tr><td>Formula lineare dell'acido</td><td></td><td></td> acetico<td>:&nbsp; CH3CO2H</td></tr><tr><td>Configurazione del rig Dremel (postazione di lavoro)</td>Microcentrifuga <td>Dremel</td><td></td><td>https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/tools/220-01-workstation</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/75002401</td></tr><tr><td>Mini-centrifuga</td><td>Sprout</td><td></td><td>http://www.heathrowscientific.com/sprout-mini-centrifuge-4</td></tr><tr><td>Liofilizzatore</td><td>Zirbus Technology</td><td></td><td>http://www.zirbus.com</td></tr></tbody></table>

campionamento e pretrattamento dello smalto dei denti carbonato per carbonio stabile e analisi di isotopi di ossigeno

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Stabile analisi di isotopi di carbonio e ossigeno di carbonato di smalto del dente umano e animale sono stato applicato nella ricerca paleoambientali e paleodietary, paleoecological, periodi storici risale a più di 10 milioni anni fa. Approcci alla rinfusa forniscono un campione rappresentativo per il periodo di mineralizzazione dello smalto, mentre campioni sequenziali all'interno di un dente possono monitorare cambiamenti dietetici e ambientali durante questo periodo. Mentre queste metodologie sono stati ampiamente applicate e descritte in archeologia, ecologia e paleontologia, non ci sono stati nessun linee guida esplicite per aiutare nella scelta delle attrezzature di laboratorio necessarie e per descrivere accuratamente il campionamento laboratorio dettagliate e protocolli. In questo articolo, abbiamo documento testualmente e visivamente, l'intero processo dal campionamento attraverso lo screening di pretrattamento e diagenetiche per rendere la metodologia più ampiamente disponibili ai ricercatori considerare la sua applicazione in una varietà di regolazioni del laboratorio.

Utilizzando la procedura di campionamento presentata sopra, smalto incrementale bioapatite campioni sono stati preparati. L'analisi di bioapatite in smalto dipende dall'accuratezza del campionamento, alla rinfusa o incrementale. In questo caso, abbiamo scelto di presentare i risultati dei campioni archeologici (due pecore) da diverse zone climatiche. Campioni elementari sono stati analizzati da secondi molari pecore ed etichettati a partire da ERJ (Figura 4)....

Analisi di isotopi stabili carbonio e ossigeno di carbonato di smalto del dente umano e animale sono stato utilizzato come proxy per dieta individuale e di ricostruzione ambientale. Qui forniamo una descrizione dettagliata e documentazione visiva di massa e sequenziale del dente smalto campionamento, come pure il pretrattamento dei campioni paleontologici e archeologici.

Campionamento e pretrattamento dello smalto dei denti carbonato per carbonio stabile e analisi di isotopi di ossigeno

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Questo metodo può rispondere a domande chiave in archeologia, paleontologia ed ecologia, come le diete degli animali domestici, le strategie di gestione degli animali e la mobilità degli animali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è relativamente non distruttiva e che si concentra su un materiale ragionevolmente resistente ai cambiamenti chimici nell'ambiente di sepoltura. Gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché non ci sono ausili visivi disponibili per il campionamento di resti paleontologici e archeologici di esseri umani e animali.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché è difficile da imparare e la pratica sui materiali archeologici è limitata. Per iniziare il campionamento di massa, impostare un trapano portatile come indicato nel protocollo di testo, con un trapano pulito con punta di diamante di forma uniforme, collegato tramite un mandrino alla configurazione del trapano. Utilizzando il trapano, pulire la superficie esterna del dente mediante leggera abrasione.Quindi, tarare una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri su una bilancia adeguatamente accurata. Quindi, posizionare un foglio di alluminio pulito o della carta per pesare sotto il trapano per raccogliere la polvere di smalto. Utilizzare la fresa per fornire un'abrasione delicata e uniforme, creando una scanalatura parallela all'intero asse di crescita.Tenere presente che la quantità di polvere campione perforata varia a seconda dell'attrezzatura utilizzata per l'analisi, del protocollo di pretrattamento e delle dimensioni del dente. Raccogli la polvere di smalto risultante e trasferiscila in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Registrare sia il numero del campione che il peso dello smalto in un quaderno di laboratorio e in un database elettronico.Dopo che ogni dente è stato perforato, pulire tutte le punte da trapano usate utilizzando acido cloridrico 0,5 molare su un tessuto robusto. Lavare nuovamente le punte con un solvente organico su un nuovo tessuto robusto. Pulire il trapano stesso utilizzando un aspirapolvere o aria compressa.Una volta completata una sessione di perforazione, pulire accuratamente l'area di lavoro utilizzando un aspirapolvere dedicato o una paletta e una spazzola. Pulire lo spazio di campionamento con metanolo. Pulire il trapano utilizzando l'aspirapolvere o l'aria compressa.Per il campionamento sequenziale, pulire prima la superficie del dente rimuovendo uno strato molto sottile di smalto esterno dei denti. Scegliere una punta da trapano appropriata per il campione, poiché la larghezza della linea di campionamento è determinata dal diametro della punta da trapano. Per iniziare la perforazione, premere lo smalto dei denti contro la punta del trapano e applicare pressione.Forare lungo la superficie buccale perpendicolare all'asse di crescita del dente, che va dalla giunzione smalto-radice alla sommità della corona. Assicurati di forare dall'apice alla base della corona nella posizione della giunzione smalto-radice, creando una scanalatura attraverso lo strato di smalto. Al termine della perforazione, pesare il campione per assicurarsi che ci sia abbastanza polvere di smalto e registrare il peso.Ripetere il processo di foratura più volte per dente, con ogni linea consecutiva parallela alla linea di campionamento precedente e a circa uno o due millimetri di distanza. Successivamente, utilizzare i calibri per misurare la distanza di ciascuna linea di campionamento dalla giunzione smalto-radice. Registra ogni distanza per il confronto.Per iniziare, utilizzare una pipetta per aggiungere acido acetico 0,1 molare a ciascun campione a una concentrazione di 0,1 millilitri per un milligrammo di smalto. Agitare i campioni agitandoli o utilizzando un agitatore. Lasciare riposare i campioni agitati per 10 minuti.Centrifugare i campioni a 13.700 g per due minuti. Utilizzando una pipetta pulita, sostituire l'acido acetico con un millilitro di acqua ultrapura e agitare agitando o utilizzando un agitatore. Centrifugare nuovamente a 13, 700 g per due minuti.Ripetere il processo di sostituzione dell'acqua ultrapura e centrifugare altre due volte. Testare i campioni per verificarne la neutralità. Se il campione non ha raggiunto la neutralità, ripetere il processo di lavaggio fino a quando non lo fa.Quindi, utilizzare una pipetta per rimuovere il liquido rimanente senza disturbare il surnatante. Posizionare un quadrato pretagliato di un centimetro per un centimetro di Parafilm su ogni provetta per microcentrifuga. Utilizzando un oggetto appuntito, praticare un piccolo foro nel Parafilm per assicurarsi che il campione si asciughi correttamente e posizionare le provette in congelatore per una notte.Il giorno successivo, trasferire i campioni nel liofilizzatore per rimuovere il liquido residuo. Una volta che i campioni sono asciutti, rimuovere il Parafilm e chiudere i coperchi della microcentrifuga. Controllare l'etichettatura delle provette e, se necessario, annotarle.In questo studio vengono preparati campioni incrementali di bioapatite dello smalto. Ogni posizione del campione incrementale viene numerata e viene misurata la distanza tra ciascuna posizione e la giunzione smalto-radice. I diversi risultati degli isotopi stabili del carbonio e dell'ossigeno provenienti da due pecore rappresentative confermano che questi animali vivevano in ambienti diversi.La pecora A proviene da una prateria tropicale e mostra ossigeno 18 incrementale in un intervallo ristretto, tra 3,3 e 5,1 per mil. Ciò suggerisce l'ingestione di acqua da fonti con valori isotopici simili e la mancanza di forti cambiamenti stagionali nelle precipitazioni. Al contrario, la pecora B, che proviene da una prateria steppica secca temperata, ha valori di ossigeno 18 con un'elevata ampiezza di variazione, che va da 5,2 a 13,1 per mil.Ciò indica una forte variazione stagionale delle precipitazioni. I valori stabili degli isotopi del carbonio suggeriscono che la dieta delle pecore A è costituita principalmente da piante C4, mentre la dieta delle pecore B è costituita principalmente da vegetazione C3. I valori incrementali di ossigeno 18 e carbonio 13 per un dente umano proveniente da un ambiente di foresta pluviale sono fortemente limitati.Questi valori, che rientrano in un intervallo di due per mil, suggeriscono una mancanza di variazione nelle strategie di foraggiamento durante il periodo di mineralizzazione dello smalto. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di esercitarsi nel campionamento sequenziale su denti moderni prima di perforare campioni antichi che non sono sostituibili. Il campionamento sequenziale può richiedere diverse ore di pratica prima di raggiungere la competenza.Per i campioni antichi, è importante scegliere denti in grado di resistere al processo di campionamento. È improbabile che i denti mal conservati o che rischiano di sgretolarsi si rivelino utili per un campionamento sequenziale dettagliato. Seguendo questa procedura, è possibile tentare altri metodi come l'analisi degli isotopi dello stronzio per comprendere la mobilità umana e animale.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'archeologia e della paleontologia per esplorare le strategie di allevamento e migrazione degli animali in diverse regioni e periodi di tempo. Non dimenticare che lavorare con trapani e acido acetico può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come occhiali, guanti e maschere per il viso.

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Biochimica

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Presentiamo il metodo dell'acido policarbossilico benzenico (BPCA) per valutare il carbonio pirogeno (PyC) nell'ambiente. L'approccio specifico del composto fornisce informazioni simultanee sulle caratteristiche, la quantità e la composizione isotopica (13C e 14C) di PyC.

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