Name: Proyección de imagen de tomografía multimodal bioluminiscente y emisión positrónica tomografía/computacional de xenoinjertos de médula ósea del mieloma múltiple en ratones NOG (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 32 s
Description: Aprende a realizar imagen multimodal bioluminiscente y PET/CT en xenoinjertos de mieloma múltiple en médula ósea de ratones NOG. Este método permite estudios longitudinales no invasivos para evaluar la inhibición de mTOR y su efecto sobre el crecimiento tumoral in vivo.

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Este trabajo fue apoyado por un grant1I01BX001532 de mérito VA desde los Estados Unidos Departamento de los veteranos asuntos laboratorio investigación biomédica y desarrollo servicio (BLRDS) y P.F., C.E. reconoce apoyo de la (VA ciencia clínica R & D servicio Merecen Premio I01CX001388) y rehabilitación VA R & D servicio (mérito Premio I01RX002604). Más apoyo vino de una donación de semillas Facultad de UCLA a J.K. Estos contenidos no representan necesariamente las opiniones de la nos Department of Veterans Affairs o el gobierno.

Todos los procedimientos animales que se describe a continuación fueron aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la mayor Los Angeles VA Healthcare system y se realizaron bajo condiciones estériles y libre de patógenos.
1. preparación de 8226 células expresan luciferasa (8226-LUC)
<ol><li>Mantener la línea celular humana de MM, 8226, en Medio RPMI-1640 suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y penicilina-estreptomicina de 1% a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contenga 95% aire y 5% de dióxido de carbono (CO2).</li>
	<li>Generar células de reportero 8226 LUC-expresión estables de transferencia 1 x 106 8226 células con un vector reportero de luciferasa seguido de una selección con Higromicina (100-350 mg/mL) como ya describieron6.</li>
	<li>Mantener las células en condiciones estándar estéril cultivo durante 2-3 semanas, cambiando el medio día, hasta que se ha generado el establecimiento de una línea celular 8226 estable transfected.</li>
	<li>Confirmar la actividad de luciferasa en vitro en 1 x 106 transfectadas las células/100 μl de tampón fosfato salino (PBS) al agregar el sustrato de la luciferasa, D-luciferin (150 μg/mL solución de trabajo en medio de cultivo precalentado) y medir la bioluminiscencia de las células en un tubo de ensayo o una placa de 96 pozos utilizando un luminómetro6.</li>
</ol>2. trasplante orthotopic del xenoinjerto modelo
<ol><li>Mantener los ratones NOG (4-6 semanas edad, hombres o mujeres) bajo condiciones estériles patógeno-libre en un centro de atención animal.</li>
	<li>Preparar las células transfected LUC 8226 para inyección IV en los ratones NOG (~ 5 x 106 células/ratón) en el día del experimento. Lavar las células 3 x en PBS helado, contarlos y les vuelva a suspender en PBS helado (menos antibióticos y FBS) a una concentración final de 5 x 106 células/200 μL de PBS) en un tubo de ensayo estéril. Mantener las células en hielo y desafiar los ratones tan pronto como sea posible (dentro de 30-120 min).</li>
	<li>Anestesiar el ratón (con isoflurano, 1% - 3% en el aire a 0.5 - 1 L/min) y coloque el animal en una posición supina sobre una almohada con la cabeza hacia fuera. Compruebe el nivel de anestesia pellizcando el dedo del pie. Aplicar pomada oftálmica en los ojos.</li>
	<li>Inyectar las células LUC 8226 en los ratones a través de la vena de la cola (200 μL/inyección) usando una jeringa de insulina de 1 mL y una aguja de 26 G. Nota: Puede utilizarse una lámpara de calor para calentar la cola, de tal modo dilatación de la vena y aumentando la eficacia de las inyecciones.</li>
	<li>Regresar el animal a su jaula casera y vigilar los animales hasta que han recuperado plenamente.</li>
	<li>Confirmar el engraftment de células 8226-LUC en el esqueleto del ratón midiendo el BLI en ratones anestesiados (se describe a continuación y se muestra en la figura 1A). Nota: Exudados del BM también pueden manchados para la expresión de CD45 humano mediante citometría de flujo (figura 1B) o por inmunohistoquímica del hueso cosechado (figura 1).</li>
</ol>3. medición de BLI en Vivo
Nota: Típicamente, BLI medible de engrafted tumores en ratones se observa primero entre 10-20 días postchallenge, pero esto puede necesitar ser determinado experimentalmente.
<ol><li>Anestesiar el ratón (con isoflurano, 1% - 3% en el aire a 0.5 - 1 L/min) y controlar el nivel de anestesia pellizcando el dedo del pie. Aplicar ungüento oftálmico en sus ojos.</li>
	<li>Dar al animal una inyección de IP (200 μL/inyección) de "en vivo-grado" sustrato D luciferin (30 mg/mL diluido en solución salina estéril).</li>
	<li>Medir el BLI en 5-10 min, después de la inyección del sustrato luciferin (aunque la actividad BLI puede ser observable en los ratones hasta 45-60 minutos), colocando el animal anestesiado en posición supina en un sistema de proyección de imagen de pequeños animales (figura 2 ). Seleccione luminiscente y análisis de la radiografía y adquisición de imágenes (figura 3).<ol>
<li>Medir la luminosidad media (/steradian fotones/s/cm2) en las regiones de interés (ROIs) utilizando el software de proyección de imagen (figura 4).</li>
		<li>Devolver el animal a su jaula casera y vigilar hasta que haya recuperado completamente (aproximadamente 15-20 min).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. tratamiento de los ratones con terapia dirigida
<ol><li>Medir la línea base BLI y aleatorizar los animales en grupos de tratamiento (4-8 ratones/grupo).</li>
	<li>Tratar a los ratones con una inyección de IP (200 μL/inyección) de temsirolimus (0.2 - 40 mg/kg ratón) utilizando un régimen de cinco inyecciones diarias de IP seguido de 2 días de descanso y una inyecciones diarias cinco adicional11.</li>
	<li>Medir la actividad de luciferasa (/steradian fotones/s/cm2) 2 x por semana tal como se describe en la sección 3 y trama el cambio de la BLI en el tiempo. Cambios en tumor BLI puede presentarse como imágenes seriales de los ratones (figura 5B). Nota: Se recomienda que seguimiento diario de los animales se realizará hasta que presentan los siguientes síntomas (normalmente dentro de 45-60 días del reto inicial): peso (pérdida de más del 10% en relación con el peso antes de la implantación) o posteriores parálisis de miembro, momento en el cual debe sacrificados utilizando una cámara de CO2 seguida por dislocación cervical.</li>
</ol>5. PET/CT análisis usando 18F-FDG para medir cambios en el metabolismo del Tumor
<ol><li>Rápidamente los animales en su jaula casa quitando sus alimentos durante 24 h antes del experimento para evitar la excesiva absorción no específica de 18F-FDG.</li>
	<li>Preparar 18sondas PET FDG radiactiva F (50-100 μCi/inyección de solución salina estéril) en el día del experimento. Registrar el tiempo y la actividad de la sonda de 18F-FDG con un calibrador de dosis. Nota: 18F tiene una vida media relativamente corta (~ 2 h), una esmerada preparación y planificación para el uso de estas sondas deben ser establecidas.</li>
	<li>Anestesiar al animal (con isoflurano, 1% - 3% en el aire a 0.5 - 1 L/min) y coloque en una posición supina sobre una almohada con la cabeza hacia fuera. Compruebe el nivel de anestesia pellizcando el dedo del pie. Aplicar ungüento oftálmico en sus ojos.</li>
	<li>Inyectar la sonda a través de la vena de la cola (100 μl/inyección) usando una jeringa de insulina 1 mL blindado y una aguja de 26 G. Nota: Puede utilizarse una lámpara de calor para calentar la cola, de tal modo dilatación de la vena y aumentando la eficacia de las inyecciones.</li>
	<li>Mida la radiactividad residual en la aguja y jeringuilla en un calibrador de dosis y tenga en cuenta la actividad y el tiempo. Nota: La estandarización de la incubación de ratón, la dosis y el tiempo es esencial para asegurar la comparabilidad y reproducibilidad de los datos.</li>
	<li>Mantener los ratones bajo anestesia y a 37 ° C utilizando una almohadilla de calefacción durante todo el período de absorción de la punta de prueba (~ 45-90 min). Nota: Es importante que los ratones permanezcan quietos y a 37 ° C para evitar la absorción inespecífica de la sonda.</li>
	<li>Alterne las inyecciones de la sonda de 18F-FDG a ocurrir a intervalos de aproximadamente 20 - 30 min para veces Etiquetadoras similares en los ratones. Nota: Flujo de trabajo adecuado y el momento de las inyecciones sonda dará lugar a condiciones de proyección de imagen óptima y reproducibles.</li>
	<li>Medir la actividad de 18F-FDG en un sistema imagen de PET/CT de pequeños animales en las regiones de interés que corresponden a los tumores implantados (figura 6). Nota: Inicialmente, se recomiendan una exposición estática de PET de 10 minutos y una exposición de CT de 2 min, pero los tiempos de exposición exacto deba determinarse experimentalmente.</li>
	<li>Devolver los animales a sus jaulas hogar y controlarlos hasta que se recuperó completamente. Los ratones en un cuarto retorno dedicado 24 h mientras que la caries sonda a niveles de fondo de la casa. Nota: Debido a la corta vida media de 18F, mediciones múltiples usando una punta de prueba fresca pueden hacer tan con frecuencia como 2 x por semana.</li>
</ol>

<ol><li>Raab, M. S., Podar, K., Breitkreutz, I., Richardson, P. G., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19541364">Multiple Myeloma.</a> The Lancet. 374 (9686), 324-339 (2009).</li>
<li>Galson, D. L., Silbermann, R., Roodman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Multiple+Myeloma+Bone+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22BoneKEy+Reports%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Multiple Myeloma Bone Disease.</a> BoneKEy Reports. 1, 135(2012).</li>
<li>Anderson, K. C., Carrasco, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+Myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of Myeloma.</a> Annual Review of Pathology. 6, 249-274 (2011).</li>
<li>Reagan, M. R., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigating+the+Bone+Marrow+Niche%3A+Translational+Insights+and+Cancer-Driven+Dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Navigating the Bone Marrow Niche: Translational Insights and Cancer-Driven Dysfunction.</a> Nature Reviews Rheumatology. 12 (3), 154-168 (2016).</li>
<li>Frost, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+Target+of+Rapamycin+Inhibitors+Induce+Tumor+Cell+Apoptosis+in+Vivo+Primarily+by+Inhibiting+Vegf+Expression+and+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Mammalian Target of Rapamycin Inhibitors Induce Tumor Cell Apoptosis in Vivo Primarily by Inhibiting Vegf Expression and Angiogenesis.</a> Journal of Oncology. 2013, 897025(2013).</li>
<li>Mysore, V. S., Szablowski, J., Dervan, P. B., Frost, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA-Binding+Molecule+Targeting+the+Adaptive+Hypoxic+Response+in+Multiple+Myeloma+Has+Potent+Antitumor+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A DNA-Binding Molecule Targeting the Adaptive Hypoxic Response in Multiple Myeloma Has Potent Antitumor Activity.</a> Molecular Cancer Research. 14 (3), 253-266 (2016).</li>
<li>Podar, K., Chauhan, D., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+Marrow+Microenvironment+and+the+Identification+of+New+Targets+for+Myeloma+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Bone Marrow Microenvironment and the Identification of New Targets for Myeloma Therapy.</a> Leukemia. 23 (1), 10-24 (2009).</li>
<li>Campbell, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laglambda-1%3A+A+Clinically+Relevant+Drug+Resistant+Human+Multiple+Myeloma+Tumor+Murine+Model+That+Enables+Rapid+Evaluation+of+Treatments+for+Multiple+Myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Laglambda-1: A Clinically Relevant Drug Resistant Human Multiple Myeloma Tumor Murine Model That Enables Rapid Evaluation of Treatments for Multiple Myeloma.</a> International Journal of Oncology. 28 (6), 1409-1417 (2006).</li>
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<li>Frost, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Antitumor+Effects+of+the+Mtor+Inhibitor+Cci-779+against+Human+Multiple+Myeloma+Cells+in+a+Xenograft+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In Vivo Antitumor Effects of the Mtor Inhibitor Cci-779 against Human Multiple Myeloma Cells in a Xenograft Model.</a> Blood. 104 (13), 4181-4187 (2004).</li>
<li>Asosingh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+Hypoxic+Bone+Marrow+Microenvironment+in+5t2mm+Murine+Myeloma+Tumor+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Role of the Hypoxic Bone Marrow Microenvironment in 5t2mm Murine Myeloma Tumor Progression.</a> Haematologica. 90 (6), 810-817 (2005).</li>
<li>Storti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-Inducible+Factor+%28Hif%29-1alpha+Suppression+in+Myeloma+Cells+Blocks+Tumoral+Growth+in+Vivo+Inhibiting+Angiogenesis+and+Bone+Destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-Inducible Factor (Hif)-1alpha Suppression in Myeloma Cells Blocks Tumoral Growth in Vivo Inhibiting Angiogenesis and Bone Destruction.</a> Leukemia. 27 (8), 1697-1706 (2013).</li>
<li>Fryer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Novel+Mouse+Model+of+Multiple+Myeloma+and+Its+Use+in+Preclinical+Therapeutic+Assessment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Novel Mouse Model of Multiple Myeloma and Its Use in Preclinical Therapeutic Assessment.</a> PLoS One. 8 (2), e57641(2013).</li>
<li>Gould, S. J., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+Luciferase+as+a+Tool+in+Molecular+and+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Firefly Luciferase as a Tool in Molecular and Cell Biology.</a> Analytical Biochemistry. 175 (1), 5-13 (1988).</li>
<li>Czernin, J., Phelps, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positron+Emission+Tomography+Scanning%3A+Current+and+Future+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Medicine%22%5BJournal%5D)">Positron Emission Tomography Scanning: Current and Future Applications.</a> Annual Review Medicine. 53, 89-112 (2002).</li>
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<li>Wang, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+Vivo+Molecular+Imaging+Probe+%2818%29F-Annexin+B1+for+Apoptosis+Detection+by+Pet%2FCt%3A+Preparation+and+Preliminary+Evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">An in Vivo Molecular Imaging Probe (18)F-Annexin B1 for Apoptosis Detection by Pet/Ct: Preparation and Preliminary Evaluation.</a> Apoptosis. 18 (2), 238-247 (2013).</li>
</ol>

El autor Kevin Francis es un empleado de Perkin-Elmer.

A pesar de una gran variedad de modelos de xenoinjerto preclínica de MM6,9,11,12,13, la capacidad para el estudio de las interacciones del tumor/BM en el microambiente del BM sigue siendo difícil 14. las técnicas aquí descritas permiten el engraftment rápido y reproducible de las células de tumores 8226-LUC en el esqueleto de los ratone...

MM es una enfermedad incurable de plasma maligno de células B que infiltran el BM y causar destrucción ósea, anemia, insuficiencia renal e infección. MM hasta 10% - 15% de todas las malignidades hematológicas1 y es el cáncer más frecuente participación del esqueleto2. El desarrollo de la m proviene de la transformación oncogénica de larga vida células plasmáticas que se establezcan en los centros germinales de los tejidos linfoides antes de finalmente autoguiado hacia el blanco a la BM3. El BM se caracteriza por nichos altamente heterogéneas; como críticos y diversos componentes celulares, regiones de baja pO2 (hipoxia), extensa vascularización, complejas matrices extracelulares y redes citocinas y factor de crecimiento, todos los cuales contribuyen al tumorgenesis MM4. Así, el desarrollo de un modelo de xenoinjerto MM diseminado caracterizado por tumores que son estrictamente engrafted en el BM sería una herramienta muy potente y clínicamente relevante para el estudio de MM patología en vivo5,6. Sin embargo, numerosos obstáculos técnicos pueden limitar la efectividad de la mayoría de las modelos de xenoinjerto, haciéndolos costosos y difíciles de aplicar. Esto incluye problemas relacionados con el engraftment tumor consistente y reproducible dentro del nicho de BM, un prolongado desarrollo del tumor, y limitaciones en la capacidad de observar y medir los cambios de crecimiento del tumor/supervivencia sin tener que directamente sacrificio de ratones durante el curso del experimento7,8.
Este protocolo utiliza un modelo de xenoinjerto modificado que fue desarrollado inicialmente por Miyakawa et al. 9, en el que un desafío (IV) intravenosa con células de mieloma produce tumores que engraft consistente y reproducible en la BM de NOD/SCID/IL-2γ(null) (NOG) ratones10"diseminada". La visualización en situ de estos tumores se logra mediante la transfección estable de la línea de celular MM humano 8226 con un alelo LUC y en serie, medir los cambios en el BLI producido por estas células tumorales implantada del6. Lo importante, este modelo puede ser ampliado para utilizar varias otras LUC-expresión humana MM líneas celulares (por ejemplo, U266 y OPM2) con una propensión similar a engraft específicamente en el esqueleto de los ratones NOG. La identificación de los tumores por imágenes bioluminiscentes de los ratones es seguida por la medición de la captación de radiofármacos sondas (como la 18F-FDG) por PET/CT. juntos, esto permite la caracterización adicional de crítica bioquímico vías (es decir, alteraciones en el metabolismo, cambios en la hipoxia y la inducción de apoptosis) en el microambiente del tumor/BM. Las principales fortalezas de este modelo se pueden destacar la disponibilidad de una amplia gama de sondas radiactivos, bioluminiscentes y fluorescentes y marcadores que pueden utilizarse para estudiar la progresión MM y patología en vivo.

<table><tbody><tr><td>8226 línea celular de mieloma humano</td><td>ATCC</td><td>CCL-155</td><td></td></tr><tr><td>NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Ratones (NOG)</td><td>Jackson Labs</td><td>5557</td><td></td></tr><tr><td>VivoGlo Sustrato de luciferina</td><td>Promega</td><td>P1041</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxyprobe-1Kit</td><td></td><td>HPL HP1-100</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD45 (clon H130)</td><td>BD Biosciences</td><td>555483</td><td>Utilizado para la citometría de flujo para identificar células tumorales CD45+ humanas en exudado</td></tr><tr><td>BM conejo anti-humano CD45 (clon D3F8Q)</td><td>Señalización celular Tecnología</td><td>70527</td><td>Anticuerpo primario utilizado para la inmunohistoquímica de hueso extirpado</td></tr><tr><td>IgG anti-conejo de cabra (HRP conjugado)</td><td>ABCAM</td><td>ab205718</td><td>Anticuerpo secundario utilizado para la inmunohistoquímica del hueso</td></tr><tr><td>extirpado Sistema de ensayo reportero de luciferasa</td><td>dual Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>pGL4.5 Luciferasa Vector Reportero Promega</td><td></td><td>E1310</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina XRMS In Sistema de imagen Vivo</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sofie G8 Sistema de imagen PET/CT</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

proyección de imagen de tomografía multimodal bioluminiscente y emisión positrónica tomografía/computacional de xenoinjertos de médula ósea del mieloma múltiple en ratones nog

Multimodal Bioluminescent and Positronic-emission Tomography/Computational Tomography Imaging of Multiple Myeloma Bone Marrow Xenografts in NOG Mice

Mieloma múltiple (MM) tumores engraft en la médula (BM) y su supervivencia y progresión dependen de complejas interacciones moleculares y celulares que existen dentro de este microambiente. Sin embargo el microambiente BM no puede ser fácilmente replicada en vitro, que potencialmente limita la relevancia fisiológica de muchos modelos experimentales in vitro y ex vivo . Estos problemas pueden ser superados mediante la utilización de un modelo de xenoinjerto en que luciferasa (LUC)-células transfected 8226 MM se engraft específicamente en el esqueleto del ratón. Cuando estos ratones se les da el sustrato apropiado, D-luciferin, los efectos del tratamiento sobre el crecimiento del tumor y la supervivencia pueden ser analizadas midiendo cambios en las imágenes bioluminiscentes (BLI) producida por los tumores in vivo. Estos datos BLI combinaron con tomografía de emisión positrónica/computacional análisis de tomografía (PET/CT) utilizando el marcador metabólico 2-deoxy - 2-(18F) fluoro-D-glucosa (18F-FDG) se utiliza para monitorizar los cambios en el metabolismo del tumor con el tiempo. Estas plataformas de proyección de imagen permiten varias mediciones no invasivas en el microambiente del tumor/BM.

En estudios piloto iniciales, las inyecciones IV de células LUC 8226 en ratones NOD/SCID no desarrollaron tumores m m BM-engrafted, aunque forman squamous MM tumores eran fácilmente (100% de éxito). En cambio, desafíos IV con 8226 células en ratones NOG generan (dentro de 15-25 días) tumores en el esqueleto (y sólo raramente formados tumores en tejidos no esqueléticos, como el hígado o bazo). Puesto que los tumores en el esqueleto no se podían confirmar visualmente examinando físicamente ...

Aquí utilizamos bioluminiscente, rayos x y emisión de positrones la tomografía/computado tomografía la proyección de imagen para estudiar cómo inhibidor mTOR actividad impactos tumores mieloma engrafted de médula ósea en un modelo de xenoinjerto. Esto permite fisiológicamente relevantes, no invasivo y multimodales análisis del efecto anti-mieloma de tratamientos contra tumores mieloma médula engrafted en vivo.

Proyección de imagen de tomografía multimodal bioluminiscente y emisión positrónica tomografía/computacional de xenoinjertos de médula ósea del mieloma múltiple en ratones NOG

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular ...

Este método se puede utilizar para responder preguntas clave sobre el papel del microambiente de la médula ósea y la supervivencia de los tumores de mieloma injertado. La principal ventaja de este procedimiento es que se puede aplicar a estudios longitudinales anti-drogas y se utiliza para ensayor múltiples vías bioquímicas de una manera no invasiva. El día del experimento lave por primera vez las 8226 células transfactadas Luciferase tres veces en PBS helado a 200 RCF durante cinco minutos por centrifigación y resuspend el pellet en PBS frío fresco a cinco veces diez a las sextas células por cada 200 microlitros de PBS frío de hielo por ratón.A continuación, confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del y el dedo del dedo del otro y aplicar un ratón NOG de cuatro a seis semanas de edad y aplicar un ungán oftálmico a los ojos del animal. Cargue las células en una jeringa de insulina de un mililitro equipada con una aguja de calibre 26. Inyectar todo el volumen de células en la vena de la cola del animal, antes de devolver el ratón a su jaula, monitoreando hasta la recuperación completa.Diez a veinte días después del desafío, inyectar cada animal injertado con 200 microlitros de sustrato de D-luciferina grado in vivo en la salina estéril intraperitonealy. Coloque los animales anestesiados en la posición supina en un sistema de imágenes de animales pequeños dentro de los 5 a 10 minutos de la inyección. Mida el resplandor medio en determinadas regiones de interés dentro del software de imágenes correspondiente.Para la terapia dirigida de los tumores 8226 Luciferase, Después de medir la bioluminiscencia basal en cada animal como acaba de demostrarse, aleatorizar a los animales en grupos de tratamiento y tratar cada ratón con una serie de 200 microlitro inyección IP de Temsirolimus o un control salino. Mida la actividad de Luciferase dos veces por semana y trace los cambios en la bioluminiscencia a lo largo del tiempo. Para medir los cambios en el metabolismo tumoral, primero retire los alimentos de la jaula casera de los ratones durante 24 horas para evitar el exceso de absorción de fludeoxidasa radiomarcada en exceso.Al día siguiente diluir de 500 a 100 microcuries de 18 sondas de Fludeoxglucosa radiomarcadas por flúor en solución salina estéril a un volumen final de 100 microlitros por ratón y registrar el tiempo y la actividad de las sondas con un calibrador de dosis. Cuando las sondas estén listas, coloque al primer animal anestesiado en una almohadilla calefactora con la cabeza hacia otro lado y utilice una jeringa de insulina blindada de un mililitro equipada con una aguja de calibre 26 para inyectar 100 microlitros de la sonda en la vena de la cola. Mida la radiactividad residual en la aguja y la jeringa con el calibrador de dosis y observe la actividad y el tiempo.A continuación, mida la actividad radiomarcada de la fludeoxglucosa en determinadas regiones de interés que corresponden a los tumores injertados en un sistema de imágenes por TC PET animal pequeño. Un injerto exitoso de tumores de médula ósea puede confirmarse mediante imágenes de bioluminiscencia como se ha demostrado. Se pueden utilizar imágenes en serie de varios animales para visualizar la distribución de los tumores de mieloma múltiple injertados en la médula ósea.Además, el análisis óptico de rayos X muestra una determinación rápida y no invasiva de la ubicación exacta y la distribución de los tumores de mieloma múltiple dentro del esqueleto del ratón. La bioluminiscencia producida por estas células tumorales injertadas se puede medir en serie y de forma no invasiva para evaluar los cambios en el crecimiento tumoral. Además, se puede controlar la supervivencia de los ratones tratados con el inhibidor de mTOR Temsirolimus y se pueden utilizar pruebas de emisión de positrones y análisis de tomografía computarizada para la captación de fludexiglucosa radiomarcada por tumor para demostrar cambios mediados por Temsirolimus en el metabolismo de la glucosa.Al realizar este procedimiento es importante inyectar las células IEV. Hemos descubierto que si no se inyectan las células en la vena se produce la formación de células tumorales no injertadas en la médula cerca del lugar de la inyección. Después de este procedimiento, otros métodos como la inmunohistoquímica y la micro-CT se pueden utilizar para abordar preguntas sobre el impacto de los tumores en la arquitectura ósea y los componentes celulares y moleculares no tumorales del entorno de la médula.

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Investigación del cáncer

Luciferasa modificados xenoinjertos de tumores humanos el cerebro puede ser establecida por vía intracraneal en ratones atímicos, con posterior seguimiento del crecimiento del tumor y la respuesta a la terapia que utiliza imágenes de bioluminiscencia. En combinación con el análisis de supervivencia, la supervisión de bioluminiscencia es una herramienta esencial para la investigación pre-clínica de las terapias que se consideran para el tratamiento de tumores cerebrales.

El establecimiento de xenoinjertos de tumor cerebral intracraneal, con posterior análisis del crecimiento tumoral y respuesta al tratamiento con imágenes de bioluminiscencia

Un modelo experimental de ratón de las metástasis óseas se estableció después de la entrega intracardíaca de luciferasa que expresan las células del tumor mamario. El desarrollo de tumores y dio lugar a lesión osteolítica fueron controlados longitudinalmente con bioluminiscencia y micro TC.

Monitoreo metástasis tumorales y lesiones osteolíticas con bioluminiscencia y Micro Imágenes de TC

Imágenes de bioluminiscencia de inducible por hipoxia-1α factor de actividad se aplica al seguimiento del desarrollo de la hipoxia tumoral intracraneal en un modelo de ratón de cáncer de mama metástasis cerebrales.

Imágenes in vivo de tumores bioluminiscencia Dinámica hipoxia de la metástasis cerebral cáncer de mama en un modelo de ratón

La tomografía de fluorescencia difusa ofrece un enfoque relativamente de bajo costo y alto potencial de toda la...

Guiada por tomografía computarizada dominio del tiempo de fluorescencia difusa tomografía en pequeños animales para la localización de biomarcadores de cáncer

Se describe un método integrado para la implantación precisa, estereotáctica de las células de glioblastoma multiforme en el cerebro de ratones desnudos y posterior...

La implantación estereotáctica intracraneal y<em&gt; En vivo</em&gt; Radiología bioluminiscente de xenoinjertos de tumores en un sistema modelo de ratón de glioblastoma multiforme

En este video, describimos la tomografía molecular de fluorescencia o FMT para la obtención de imágenes in vivo de xenoinjertos de glioblastoma marcados con proteínas fluorescentes en modelos de ratón. La técnica es útil para dilucidar los efectos de la terapéutica antitumoral a nivel molecular.

Tomografía molecular de fluorescencia: una técnica de imagen para la obtención de imágenes in vivo de xenoinjertos de glioblastoma marcados con proteínas fluorescentes en modelo de ratón

Fuente: Clark, A.J., et al. Imágenes de bioluminiscencia de un modelo animal inmunocompetente para el glioblastoma. J. Vis. Exp. (2016)Este video muestra imágenes de bioluminiscencia para rastrear la progresión del glioblastoma en un modelo de ratón inmunocompetente, utilizando células tumorales que expresan luciferasa y luciferina para cuantificar el crecimiento tumoral de forma no invasiva.

Imágenes de bioluminiscencia de un modelo de ratón inmunocompetente para el glioblastoma

La implantación de injertos óseos autólogos y alogénicos constituyen aceptó enfoques para tratar la importante pérdida de masa ósea craneofacial. Sin embargo, el efecto de la composición de injerto en la interacción entre la neovascularización, la diferenciación celular y la formación de hueso no está claro. Se presenta un protocolo de imagen multimodal destinado a dilucidar la interdependencia angiogénesis osteogénesis en la proximidad del injerto.

Tomografía Computarizada e Imagen Óptico de Acoplamiento-Osteogénesis angiogénesis para evaluar la integración de craneales hueso autoinjertos y aloinjertos

Aquí, presentamos un protocolo utilizar inyección guiada por ultrasonido de las células de (ES) el sarcoma de Ewing y neuroblastoma (NB) (estableció líneas celulares y células tumorales derivados del paciente) en sitios biológicamente relevantes para crear modelos preclínicos fiables para el cáncer investigación.

Utilización de ultrasonido guiado implantación celular dirigida de tejido para el establecimiento de xenoinjertos de tumores metastásicos biológicamente relevantes

Este trabajo preestablece un protocolo avanzado para evaluar con precisión la carga del tumor mediante la detección de señales de proteína fluorescente verde y bioluminiscencia, así como la integración de la técnica de detección molecular cuantitativa.

Estudio del triple cáncer de mama negativo con el modelo de cáncer de mama ortotópico

La traslación de los hallazgos de la microscopía intravital se ve desafiada por su poca profundidad de penetración en el tejido. Aquí describimos un modelo de ratón de cámara de ventana dorsal que permite el registro conjunto de la microscopía intravital y las modalidades de imagen clínicamente aplicables (p. ej., TC, RM) para la correlación espacial directa, lo que podría agilizar la traducción clínica de los hallazgos de la microscopía intravital.

Un modelo de ratón tumoral con cámara de ventana de pliegue cutáneo dorsal para la microscopía intravital combinada y la resonancia magnética en la investigación traslacional del cáncer

Aprende a realizar imagen multimodal bioluminiscente y PET/CT en xenoinjertos de mieloma múltiple en médula ósea de ratones NOG. Este método permite estudios longitudinales no invasivos para evaluar la inhibición de mTOR y su efecto sobre el crecimiento tumoral in vivo.

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