Name: In Vitro Differenziazione dei Mouse del Granulocyte-macrofago-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producendo le cellule T Helper (THGM) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Impara a differenziare le cellule T helper GM-CSF (THGM) murine da cellule CD4+ naive. Questo metodo genera oltre il 50% di cellule esprimenti GM-CSF per studiare le malattie infiammatorie come la sclerosi multipla.

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Questo studio è stato sostenuto da borse di studio dal National University salute sistema di Singapore (T1-2014 ott-12 e T1-2015 set-10).

Tutti i topi usati in questo protocollo sono stati il background genetico C57BL/6 e alloggiati in condizioni da organismi patogeni specifiche presso la National University of Singapore. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando protocolli approvati dal comitato di uso della Università nazionale di Singapore e istituzionali Animal Care.
1. reagenti e preparazione del materiale
<ol><li>Preparare 500 mL di tampone fosfato salino (PBS) contenente 2% siero bovino fetale (FBS) e 1 millimetro di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Nota: Mantenere il buffer sul ghiaccio durante l'intera procedura per ottenere risultati ottimali.</li>
	<li>Preparare 50 mL di completo supporto RPMI contenente RPMI 1640, 10% FBS e 1% di penicillina-streptomicina. Utilizzare supporti RPMI completi contenente 50 µM β-mercaptoetanolo per la differenziazione delle cellule di THGM. Aggiungere il β-mercaptoetanolo in una cappa aspirante.</li>
	<li>Preparare 7,5 mL di una miscela di anticorpi anti-CD3e diluendo stock anti-CD3e concentrato a 3 μg/mL in PBS. Cappotto 48 pozzetti aggiungendo 150 µ l della miscela dell'anticorpo ad ogni pozzetto e incubare la piastra a 37 ° C per almeno 1 h, o a 4 ° C durante la notte.</li>
	<li>Sterilizzare un paio di forbici e pinze e tenerli in etanolo al 70% tra le dissezioni.</li>
</ol>2. preparazione degli Splenocytes murini
<ol><li>Eutanasia del mouse (di 6 – 8 settimane vecchie) utilizzando un istituzionalmente approvato CO2 asfissia o dislocazione cervicale. Spruzzare il mouse con etanolo al 70% e montarlo su un blocco di polistirolo sulla sua schiena. Trasferire il mouse a una sicurezza microbiologica per procedere con i passaggi seguenti.</li>
	<li>Tenere la pelle usando un paio di pinze e tagliare la pelle sotto la gabbia toracica sul lato sinistro per circa 4 cm, utilizzando un paio di forbici. Aprire il sac peritoneale per esporre la milza e utilizzare pinze sterili per estrarre la milza.</li>
	<li>Collocare un filtro cella 70 μm su un tubo da 50 mL e pre-bagnare con 2 mL di tampone. Posizionare le milze sul filtro cella (2 – 3 milze per filtro di una cella) e macerare li usando l'estremità di un pistone della siringa 5 mL.</li>
	<li>Risciacquare il filtro e il tubo parecchie volte con 1 – 2 mL di buffer di isolamento cella fino a quando tutte le celle vengono scaricate nel tubo. Eliminare il filtro cella e centrifugare le cellule a 350 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare con 5 mL di freddo (4 ° C) ammonio-cloruro-potassio (ACK) Lisi buffer (150mm NH4Cl, 10mm KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA; pH 7,2-7,4) e mescolare delicatamente per 2 minuti aggiungere 10 mL di multimediale RPMI completo per neutralizzare l'ACK buffer e centrifugare immediatamente le cellule a 350 x g per 5 min a 4 ° C. Eliminare il supernatante dopo la centrifugazione.</li>
</ol>3. isolamento di CD4 + T Cells utilizzando microsfere magnetiche CD4 e una colonna di separazione cellulare
<ol><li>Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di buffer di isolamento delle cellule. Filtrare la sospensione cellulare utilizzando un filtro di pre-separazione (30 μm) in una nuova provetta da 15mL per rimuovere eventuali detriti.</li>
	<li>Prendere 10 μL della sospensione cellulare e fare una diluizione di 10 x aggiungendo 90 μL di tampone. Prendere 10 μL della sospensione delle cellule diluito e mescolare con 10 μL di trypan blu per il conteggio delle cellule. Contare le celle in un emocitometro per determinare il rendimento di cellule vitali.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 350 x g per 5 min a 4 ° C e scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 90 μL di tampone per 107 cellule. Aggiungere 10 μL di microperle magnetiche CD4 per 107 cellule. Incubare le cellule per 15 min a 4 ° C. Per risultati ottimali, miscelare la sospensione cellulare delicatamente ogni 5 minuti durante l'incubazione.</li>
	<li>Mentre sono incubando le cellule, è possibile posizionare una colonna di separazione sul supporto magnetico. Pre-bagnato la colonna con 2 mL di tampone.</li>
	<li>Alla fine dell'incubazione delle cellule/tallone, lavare le cellule con 5 mL di tampone e li Centrifugare a 350 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 1 mL di tampone, caricare il campione nella colonna di separazione cellulare e lasciarlo fluire attraverso. Utilizzare una provetta per centrifuga 15 mL per raccogliere la frazione di cellule CD4. Aggiungere 1 mL di tampone per lavare il serbatoio prima che sia asciutto. Ripetere la fase di lavaggio 2 x.</li>
	<li>Rimuovere la colonna di separazione delle cellule dal supporto magnetico e posizionarlo su una nuova provetta da centrifuga da 15 mL. Aggiungere 2 mL di buffer di isolamento delle cellule nella colonna di separazione cellulare e applicare lo stantuffo saldamente per forzare le celle dalla colonna.</li>
	<li>Centrifugare la frazione a 350 x g per 5 min a 4 ° C per ottenere cellule CD4 +. Scartare il surnatante.</li>
</ol>4. purificazione delle cellule T CD4 + Naive (CD4+CD25–CD44loCD62LCiao) di differenziazione di ordinamento delle cellule e THGM fluorescenza-attivato
<ol><li>Risospendere il pellet di cellule CD4 + ottenuto in 500 µ l di tampone. Mescolare le cellule con una miscela di anticorpi coniugati fluorescenti contenenti CD4-PerCp (2,8 µ g/mL), CD44-APC (2,4 µ g/mL), CD25-PE (2 µ g/mL) e CD62L-FITC (10 µ g/mL) (tabella 1). Incubare le cellule in ghiaccio per 20 – 30 minuti, mentre li protegge dalla luce. Nota: Le concentrazioni degli anticorpi sono state ottimizzate in precedenza in laboratorio. Il numero di anticorpi elencati è per celle da 1 – 2 topi.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, lavare le cellule con 5 mL di tampone e centrifugare le cellule a 350 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 500 µ l di tampone. Filtrare le celle utilizzando una rete di nylon.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare in una provetta di FACS per l'ordinamento delle cellule. Precoat i tubi di raccolta FACS con 500 µ l di tampone.</li>
	<li>Ottenere un CD4+CD25–CD44loCD62LCiao popolazione (di ingenuo CD4+ T cellule) ordinando FACS. Cancello il CD4+CD25– prime e quindi selezionare CD44loCD62LCiao cellule da questa popolazione.</li>
	<li>Raccogliere l'ingenuo CD4+ T cell frazioni in una nuova provetta da centrifuga 15 mL. Centrifugare le cellule a 350 x g per 5 min a 4 ° C e scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere le cellule di T di CD4 + ingenuo ad una concentrazione di 106 cellule/mL in completo supporto RPMI contenente 50 µM β-mercaptoetanolo.</li>
	<li>Aspirare gli anticorpi di anti-CD3e utilizzati per spre-spalmatura in lastra 48 pozzetti. Le cellule di seme 0,25 milioni (250 µ l) in ciascun pozzetto con IL-7 (2 ng/mL), anti-CD28 (1 µ g/mL) e anti-IFNγ (10 µ g/mL) (tabella 1). Nota: Le concentrazioni di citochine e gli anticorpi sono state ottimizzate in precedenza in laboratorio per una differenziazione delle cellule di THGM.</li>
	<li>Incubare le cellule a 37 ° C con 5% CO2 per 3 giorni. Non modificare il mezzo durante l'incubazione.</li>
</ol>5. analisi delle cellule di GM del Mouse THgenerato In Vitro
<ol><li>Utilizzando un microscopio, controllare la differenziazione cellulare 3 d dopo la differenziazione. Raccogliere le cellule e loro Centrifugare a 350 x g per 5 min a 4 ° C. Lavare le cellule 2 x con completo supporto di RPMI. Nota: Le cellule differenziate sono più ampie rispetto alle cellule di T di CD4 + ingenuo.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 1 mL di multimediale completo RPMI. Prendere 10 µ l di sospensione cellulare e mescolare bene con 10 μL di trypan blu per determinare il numero di cellulare con un emocitometro. Dividere le cellule differenziate in tre pozioni per una restimolazione e analisi. Nota: Intracellulari di cytokine colorazione e saggi ELISA richiedono ≥0.5 milione cellule e analisi qPCR richiedono ≥ 1 milione cellule.</li>
	<li>
Per la colorazione intracellulare cytokine, stimolare le cellule con forbolo miristato 12 13-acetato (PMA) (100 ng/mL) e ionomicina (1 μg/mL) in presenza di un inibitore del trasporto di proteine (1 µ l/mL) per 4-6 h.
	<ol>
<li>Raccogliere le cellule e li macchia con l'anticorpo anti-CD4 (PerCP-coniugato, 0,2 mg/mL, diluizione 1: 100; o coniugato FITC, 0,5 mg/mL, diluizione 1: 100) per 30 min.</li>
		<li>Fissare le cellule con 200 μL di tampone di fissazione per 20 – 60 min. Dopo la fissazione, lavare le cellule 2 x con 1 mL di tampone di permeabilizzazione.</li>
		<li>Eseguire la colorazione intracellulare con gli anticorpi contro il GM-CSF (PE-coniugato, 0,2 mg/mL, diluizione 1: 100), IL-17A (FITC-coniugato, 0,5 mg/mL, diluizione 1: 100; APC-conjugated, 0,2 mg/mL, diluizione 1: 100), IL-4 (APC-coniugato, 0,2 mg/mL, diluizione 1: 100) e IFNγ (APC-coniugato, 0,2 mg/mL, diluizione 1: 100; PE-conjugated, 0,2 mg/mL, diluizione 1: 100) per 30 min al buio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per un'analisi qPCR dell'espressione genica citochina da cellule differenziate, attivare le cellule con piastra-associazione anti-CD3e (3 μg/mL) (precoating la piastra come descritto al punto 1.3). A 3 h dopo la stimolazione, raccogliere le cellule per isolare RNA totale usando un reagente di estrazione del fenolo RNA per prepararsi la qPCR di cDNA. I primer e il programma utilizzato per la qPCR sono riportati nelle tabelle 2 e 3, rispettivamente.</li>
	<li>Per l'analisi della secrezione della proteina citochina da cellule differenziate, stimolare le cellule con piastra-associazione anti-CD3e (3 μg/mL) per 24 h (precoating la piastra come descritto al punto 1.3). Raccogliere il surnatante per IL-17 e GM-CSF ELISA per determinare le loro concentrazioni di coltura cellulare.</li>
</ol>

<ol><li>Zhu, J., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4+T+cells%3A+fates%2C+functions%2C+and+faults%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD4 T cells: fates, functions, and faults.</a> Blood. 112, 1557-1569 (2008).</li>
<li>Kara, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailored+immune+responses%3A+novel+effector+helper+T+cell+subsets+in+protective+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity.</a> PLoS Pathogens. 10, e1003905(2014).</li>
<li>Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Immunology+meets...Immunology%3A+Modified+cancer+cells+as+professional+APC+for+priming+naive+tumor-specific+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Tumor Immunology meets...Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells.</a> Oncoimmunology. 6, e1356149(2017).</li>
<li>Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TH17+cells+in+development%3A+an+updated+view+of+their+molecular+identity+and+genetic+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming.</a> Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).</li>
<li>Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-17+and+Th17+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-17 and Th17 Cells.</a> Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).</li>
<li>Sheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT5+programs+a+distinct+subset+of+GM-CSF-producing+T+helper+cells+that+is+essential+for+autoimmune+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation.</a> Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).</li>
<li>Codarri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RORgammat+drives+production+of+the+cytokine+GM-CSF+in+helper+T+cells%2C+which+is+essential+for+the+effector+phase+of+autoimmune+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation.</a> Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).</li>
<li>El-Behi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+encephalitogenicity+of+T%28H%2917+cells+is+dependent+on+IL-1-+and+IL-23-induced+production+of+the+cytokine+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF.</a> Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).</li>
<li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orphan+nuclear+receptor+RORgammat+directs+the+differentiation+program+of+proinflammatory+IL-17%2B+T+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells.</a> Cell. 126, 1121-1133 (2006).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+subset+of+helper+T+cells+promotes+immune+responses+by+secreting+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF.</a> Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).</li>
<li>Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+in+Neuroinflammation%3A+Licensing+Myeloid+Cells+for+Tissue+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage.</a> Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui abbiamo descritto un protocollo di una differenziazione in vitro THGM da ingenuo CD4 + cellule di topo, seguita da un'analisi delle cellule differenziate per convalidare il metodo. Della nota, linfonodi e milza può essere utilizzati per ingenuo purificazione di cellule T CD4 + e THGM differenziazione. L'espressione di citochine determinato macchiando intracellulari di cytokine combinato con citometria a flusso ha mostrato che circa il 55% delle cellule sono state indotte a diventare GM-...

Linfociti CD4 + T helper (TH) sono componenti essenziali del sistema immunitario, avendo un ruolo cruciale nella difesa ospite contro gli agenti patogeni microbici, nella sorveglianza del cancro e nell'autoimmunità1,2,3. Al momento dell'attivazione del ricevitore (TCR) di cellule T, cellule T CD4 + ingenuo possono essere differenziate in TH1, TH2, TH 17, o regolamentazione T (Treg) cellule sotto l'influenza di citochine differenti ambienti2,4, 5. recentemente, un nuovo subset di cellule TH , che produce principalmente GM-CSF, è stato identificato e denominato THGM6. La differenziazione delle cellule di THGM è guidata da IL-7 attraverso l'attivazione di un trasduttore di segnale e attivatore di trascrizione 5 (STAT5). Queste cellule esprimono una grande quantità di GM-CSF pur avendo una bassa espressione di altri TH-cell firma citochine quali IFNγ e IL-176. GM-CSF è stato trovato per svolgere un ruolo critico nello sviluppo di CD4 + T cellulo-mediata neuroinflammation7,8. Rispetto al IFNγ o IL-17-esprimendo le cellule T autoreattive, GM-CSF-esprimendo T cellule trasferito al selvaggio-tipo topi (WT) ha causati un inizio più iniziale di malattia e la maggiore severità di malattia. Inoltre, le cellule di T di QCS2- / - non riuscito ad indurre encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) dopo essere stato trasferito passivamente ai destinatari WT, mentre le cellule di T che mancano IFNγ o IL-17A mantenuto la capacità di mediare EAE7. Inoltre, un blocco di GM-CSF utilizzando anticorpi neutralizzanti ha migliorato EAE malattia gravità8. Inoltre, una carenza di STAT5 in cellule di T in topi ha provocato in una generazione di THGM diminuita e, quindi, in una resistenza dei topi a EAE sviluppo6. Questi risultati sottolineano l'importanza delle cellule di T di GM-CSF-esprimendoH nella malattia autoimmune neuroinfiammatorie. Quindi, stabilire un metodo per differenziare le cellule di T di GM-CSF-esprimendoH da cellule T CD4 + ingenuo sarebbe importante nello studio della patogenesi autoimmune neuroinflammation e immunitaria mediata da cellule T. Tuttavia, un protocollo che efficientemente genera cellule THGM da murino ingenuo che CD4 + non è stata stabilita.
Qui presentiamo un metodo che differenzia cellule murine THGM da cellule T CD4 + ingenuo. Questo protocollo descrive l'intera procedura, compreso l'estrazione della milza dal mouse, la preparazione di una sospensione unicellulare, la selezione positiva CD4, la cella di fluorescenza-attivato ordinano (FACS) e la cellula di TH differenziazione e analisi. Il differenziato cellule T helper vengono analizzate da intracellulare cytokine colorazione combinato con citometria a flusso per determinare l'espressione di citochine a livello di singola cellula, mediante una PCR quantitativa in tempo reale per determinare l'espressione di citochine a livello di mRNA, e da ELISA per valutare l'espressione di citochine a livello di proteina. Questo metodo può essere applicato agli studi di biologia cellulare THGM in varie condizioni, come ad esempio EAE, dove GM-CSF svolge un ruolo importante nella patogenesi.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Biowest</td><td>L0500-500</td><td></td></tr><tr><td>FBS Capricorno inattivato a caldo</td><td></td><td>FBS-HI-12A</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>1a base</td><td>BUF-2040-10</td><td>Diluito a 1x PBS in acqua sterile</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>1a base</td><td>BUF-1053-100ml-pH8.0</td><td></td></tr><tr><td>10x tampone</td> <td>ACKBiolegend</td><td>420301</td><td>diluito in acqua sterile</td></tr><tr><td>Filtro cellulare</td><td>SPL Life Sciences</td><td>93070</td><td></td></tr><tr><td>CD4 microsfere</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-201</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>LS colonna</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>supporto magnetico</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 mL</td><td>Terumo</td><td>SS+01T</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Selezionatrice cellulare Sony SY3200</td><td>Selezionatrice</td><td></td><td>cellulare Sony Sony SY3200</td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga conica da 50 mL Provetta da centrifuga conica</td><td>Greiner Bio-One</td><td>210261</td><td></td></tr><tr><td>15 mL</td><td></td><td></td> Provetta FACS da 188271 <td></td>Greiner</tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>piastra per coltura cellulare a 24 pozzetti</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>anti-topo CD4 PerCP-eFluor 710</td><td>eBioscience</td><td>46-0041-82</td><td></td></tr><tr><td>PE coniugato anti-topo CD25 (IL-2Ra, p55)</td><td>eBioscience</td><td>12-0251-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-umano/topo CD44 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0441-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-topo CD62L FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0621-85</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer-camera di conteggio migliorata</td><td>Marienfeld</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Trypan Blue Solution</td><td>GE healthcare Life Sciences</td><td>SV30084.01</td><td></td></tr><tr><td>microscopio</td><td>Nikon</td><td>Nikon Elipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Purified&nbsp; anti-topo CD3e&nbsp; anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>100314</td><td></td></tr><tr><td>Criceto purificato anti-topo CD28</td><td>BD Biosciences</td><td>553295</td><td></td></tr><tr><td>Ratto purificato anti-topo IFN&gamma; &nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>16-7312-85</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo IL-4 anti-topo purificato</td><td>Biolegend</td><td>504102</td><td></td></tr><tr><td>Proteina IL-7 ricombinante di topo</td><td>R& Sistema D</td><td>407-ML</td><td></td></tr><tr><td>ricombinante umano TGF-beta</td><td>R& Sistema D</td><td>240-B-010</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Merck Millipore</td><td>19-144</td><td></td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore del trasporto della proteina GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>51-2301KZ</td><td></td></tr><tr><td>Fissazione intracellulare & Set di tamponi per permeabilizzazione</td><td>eBioscience</td><td>88-8824-00</td><td></td></tr><tr><td>anti-topo GM-CSF PE</td><td>eBioscience</td><td>12-7331-82</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-topo IL-17A</td><td>Biolegend</td><td>506908</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-topo IFN-gamma</td><td>Biolegend</td><td>505810</td><td></td></tr><tr><td>GO Taq qPCR master mix</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td></td></tr><tr><td>topo GM-CSF ELISA Ready-SET-Go!</td><td>invitrogen</td><td>88-7334-88</td><td></td></tr><tr><td>Topo IL-17A ELISA non couted</td><td>invitrogen</td><td>88-7371-22</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro differenziazione dei mouse del granulocyte-macrofago-colony-stimulating factor (gm-csf)-producendo le cellule t helper (thgm)

In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells

Il fattore di stimolazione del granulocyte-macrofago-colonia (GM-CSF)-la produzione di cellule T helper (THGM) è un sottoinsieme di cellule helper T recentemente identificato che principalmente secerne GM-CSF senza produrre l'interferone (IFN) γ o interleuchina (IL) -17 e si trova a svolgono un ruolo essenziale nella neuroinfiammazione autoimmuni. Un metodo di isolamento di cellule T CD4 + ingenuo da una cella singola sospensione degli splenocytes e generazione di cellule THGM da cellule T CD4 + ingenuo sarebbe una tecnica utile nello studio dell'immunità mediata da cellule T e malattie autoimmuni. Qui descriviamo un metodo che differenzia le cellule di T di CD4 + ingenuo di topo in cellule di THGM promosse da IL-7. L'esito della differenziazione è stata valutata tramite l'analisi dell'espressione di citochine utilizzando diverse tecniche, tra cui intracellulare cytokine colorazione combinato con citometria a flusso, una reazione a catena quantitativa in tempo reale della polimerasi (PCR), e analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA). Utilizzando il protocollo di differenziazione THGM come descritto qui, circa il 55% delle cellule espresso GM-CSF con una minima espressione di IL2 o IL-17. L'espressione predominante di GM-CSF dalle cellule di THGM è stato ulteriormente confermato dall'analisi dell'espressione di GM-CSF, IL2 e IL-17 a livelli di mRNA e di proteina. Pertanto, questo metodo può essere utilizzato per differenziare le cellule CD4 + T naive a THGM cellule in vitro, che saranno utili nello studio della biologia delle cellule di THGM.

Cellule T CD4 + Naive isolate da due 8-settimana-vecchio maschio C57BL/6 topi sono stati divisi in tre porzioni. Una porzione delle cellule è stata differenziata in cellule di THGM seguendo il protocollo descritto. Un'altra porzione è stata coltivata in una condizione di THGM in presenza dell'anticorpo anti-IL-4 (10 µ g/mL) per testare l'influenza di un blocco di IL-4 nella differenziazione delle THGM. L'ultima parte è stata coltivata in una condizione di ...

Qui, presentiamo un protocollo per differenziare murino granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing linfociti T helper (THGM) da cellule T CD4 + ingenuo, incluso l'isolamento delle cellule T CD4 + Naive, differenziazione di THGM, e analisi delle cellule di THGM differenziate. Questo metodo può essere applicato agli studi del regolamento e la funzione delle cellule di THGM.

In Vitro Differenziazione dei Mouse del Granulocyte-macrofago-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producendo le cellule T Helper (THGM)

The granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF)-producing T helper (THGM) cell is a newly identified T helper cell subset that predominantly ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle cellule T CD4, come ad esempio quale sottogruppo di cellule T-helper è la principale fonte di GM-CSF nella patogenesi di malattie infiammatorie come la sclerosi multipla. Il vantaggio principale di questa tecnica è che genera oltre il 50% di cellule T che esprimono GM-CSF da cellule T CD4 naive con nessuna o poche cellule di espressione gamma OI17 interferenti, che forniscono una fonte cellulare essenziale per lo studio della regressione e della funzione di THGM, un nuovo sottogruppo di cellule T-helper. A dimostrare la procedura sarà Yi Lu, uno studente laureato del mio laboratorio.Inizia usando una pinza per sollevare la pelle sopra l'addome di un topo di sei-otto settimane e praticando un'incisione di circa quattro centimetri sotto la gabbia toracica sul lato sinistro dell'animale. Aprire il sacco peritoneale per esporre la milza e utilizzare una pinza sterile per trasferire la milza su un colino da 70 micrometri pre-bagnato con due millilitri di tampone di isolamento cellulare. Quando sono state raccolte due o tre milze, utilizzare l'estremità di una siringa da cinque millilitri per macerare il tessuto dell

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Questo video dimostra l'innesco dei monociti primari nei macrofagi. I monociti umani primari possono essere isolati e differenziati in un fenotipo pro-infiammatorio M1-simile utilizzando il fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) o in un fenotipo antinfiammatorio M2-simile utilizzando il fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF).

Coltura in vitro e differenziazione dei monociti primari in macrofagi

Questo video dimostra la differenziazione in vitro del fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi o delle cellule T helper produttrici di GM-CSF (THGM). Le cellule T naïve isolate sono stimolate per la differenziazione in THGM, che è confermata dal rilevamento di un'elevata produzione intracellulare di GM-CSF e di una bassa espressione di altre citochine specifiche delle cellule T helper.

Una tecnica in vitro per differenziare le cellule T helper produttrici di GM-CSF dalle cellule T naive

Le cellule staminali embrionali di topo possono essere differenziate in cellule T in vitro utilizzando il sistema di co-coltura OP9-DL1. Il successo di questa procedura richiede un'attenta attenzione alla manutenzione del reagente/cellula e ai passaggi chiave della tecnica. Qui discutiamo questi parametri critici e forniamo un protocollo dettagliato per incoraggiare l'adozione di questa tecnologia.

Derivazione di cellule T In Vitro Da cellule staminali embrionali di topo

Le cellule T CD4+ ingenue si polarizzano in vari sottoinsiemi a seconda dell'ambiente al momento dell'attivazione.  La differenziazione delle cellule T CD4+ naive in vari sottogruppi di effettori può essere ottenuta in vitro attraverso l'aggiunta di stimoli recettoriali delle cellule T e segnali specifici delle citochine.

Mouse Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento T cellulare e<em&gt; In vitro</em&gt; Differenziazione in T sottopopolazioni cellulari

Le cellule del midollo osseo coltivate con il fattore stimolante le colonie di macrofagi granulociti (GM-CSF) generano una coltura eterogenea contenente macrofagi e cellule dendritiche (DC). Questo metodo evidenzia l'utilizzo del legame MHCII e ialuronano (HA) per differenziare i macrofagi dalle DC nella coltura GM-CSF. I macrofagi in questa cultura hanno molte somiglianze con i macrofagi alveolari.

Generazione e identificazione di GM-CSF Derivato alveolo-come macrofagi e dendritiche cellule da midollo osseo di topo

Viene presentato un protocollo per la coltura cellulare di macrofagi derivati da monociti umani differenziati da fattori stimolanti le colonie di macrofagi (M-CSF). Il protocollo utilizza la crioconservazione dei monociti accoppiata alla loro differenziazione di massa in macrofagi. Quindi i macrofagi raccolti possono essere seminati in pozzetti di coltura alle densità cellulari richieste per l'esecuzione degli esperimenti.

Cultura dei macrofagi macrofagi colony-stimulating factor differenziata umana derivate da monociti

Qui vengono presentati protocolli dettagliati per coltura la linea 32D/G-CSF-R cellula precursore mieloide murino, eseguendo le infezioni virali e svolgere le analisi di proliferazione e differenziazione. Questa linea cellulare è adatta per lo studio dello sviluppo delle cellule mieloidi e il ruolo dei geni di interesse in crescita delle cellule mieloidi e differenziazione neutrophilic.

Proliferazione e differenziazione dei precursori mieloidi murino 32D/G-CSF-R cellule

Qui forniamo un metodo per identificare e isolare un numero elevato di GM-CSF guidato cellule mieloidi utilizzando l'ordinamento delle cellule ad alta velocità. Cinque popolazioni distinte (comune dei progenitori mieloidi, progenitori del granulocita/macrofago, monociti, macrofagi monocito-derivati e DCs monocito-derivato) possono essere identificati sulla base di Ly6C e CD115 espressione.

Generazione di un gran numero di progenitori mieloidi e precursori delle cellule dendritiche dal midollo osseo murino utilizzando una romanzo cella ordinamento strategia

Questo studio descrive un metodo per isolare vescicole extracellulari arricchite di esosomi che trasportano fattori di stimolazione delle colonie di macrofagi dei granulociti immunostimoltori da cellule staminali embrionali.

Isolamento di vescicole extracellulari arricchite con esosomi che trasportano il fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi da cellule staminali embrionali

Questo protocollo descrive la robusta generazione di macrofagi da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo e metodi per la loro successiva caratterizzazione. L'espressione del marcatore di superficie cellulare, l'espressione genica e i saggi funzionali vengono utilizzati per valutare il fenotipo e la funzione di questi macrofagi derivati da iPSC.

Produzione e caratterizzazione di macrofagi umani da cellule staminali pluripotenti

Impara a differenziare le cellule T helper GM-CSF (THGM) murine da cellule CD4+ naive. Questo metodo genera oltre il 50% di cellule esprimenti GM-CSF per studiare le malattie infiammatorie come la sclerosi multipla.

In Vitro Differenziazione dei Mouse del Granulocyte-macrofago-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producendo le cellule T Helper (THGM) (Video) | JoVE Journal

In Vitro Differenziazione dei Mouse del Granulocyte-macrofago-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producendo le cellule T Helper (T_HGM)

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