In Vitro Differenziazione dei Mouse del Granulocyte-macrofago-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producendo le cellule T Helper (T_HGM)

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle cellule T CD4, come ad esempio quale sottogruppo di cellule T-helper è la principale fonte di GM-CSF nella patogenesi di malattie infiammatorie come la sclerosi multipla. Il vantaggio principale di questa tecnica è che genera oltre il 50% di cellule T che esprimono GM-CSF da cellule T CD4 naive con nessuna o poche cellule di espressione gamma OI17 interferenti, che forniscono una fonte cellulare essenziale per lo studio della regressione e della funzione di THGM, un nuovo sottogruppo di cellule T-helper. A dimostrare la procedura sarà Yi Lu, uno studente laureato del mio laboratorio.

Inizia usando una pinza per sollevare la pelle sopra l'addome di un topo di sei-otto settimane e praticando un'incisione di circa quattro centimetri sotto la gabbia toracica sul lato sinistro dell'animale. Aprire il sacco peritoneale per esporre la milza e utilizzare una pinza sterile per trasferire la milza su un colino da 70 micrometri pre-bagnato con due millilitri di tampone di isolamento cellulare. Quando sono state raccolte due o tre milze, utilizzare l'estremità di una siringa da cinque millilitri per macerare il tessuto della milza e sciacquare il colino più volte con uno o due millilitri di tampone di isolamento cellulare fino a quando tutte le cellule sono state lavate nella provetta.

Raccogliere le cellule per centrifugazione e risospendere il pellet in cinque millilitri di tampone di lisi di potassio di cloruro di ammonio a quattro gradi Celsius. Dopo due minuti di miscelazione delicata, interrompere la lisi con 10 millilitri di terreno RPMI completo e centrifugare immediatamente le cellule. Per isolare le cellule T CD4 positive, risospendere il pellet di globuli bianchi in cinque millilitri di tampone di isolamento cellulare e filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino da 30 micrometri in una nuova provetta da 15 millilitri per rimuovere eventuali detriti.

Dopo il conteggio, risospendere le cellule a una volta da 10 alla settima cellula per 90 microlitri di concentrazione del tampone e aggiungere 10 microlitri di perle magnetiche coniugate anti-CD4 per una volta 10 alla settima cellula per un'incubazione di 15 minuti a quattro gradi Celsius con miscelazione ogni cinque minuti. Durante l'incubazione delle cellule, posizionare una colonna di separazione su un supporto magnetico e pre-bagnare la colonna con due millilitri di tampone. Quindi, lavare le celle con cinque millilitri di tampone e risospendere il pellet in un millilitro di tampone.

Caricare il campione sulla colonna e raccogliere la frazione negativa CD4 in una provetta conica da 15 millilitri. Quando tutte le cellule sono passate attraverso la colonna, lavare il serbatoio tre volte con un millilitro di tampone per lavaggio prima che si asciughi. Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire la colonna in una nuova provetta conica da 15 millilitri e immergere la colonna con due millilitri di tampone di isolamento cellulare per espellere la frazione positiva del microslatino.

Quindi, raccogliere le cellule CD4 positive mediante centrifugazione. Per la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza delle cellule T naive, risospendere il pellet di cellule CD4 positive selezionato con perline in 500 microlitri di tampone e mescolare le cellule con un appropriato cocktail di anticorpi coniugati a fluorescenza. Dopo 20-30 minuti su ghiaccio al riparo dalla luce, lavare le celle in cinque millilitri di tampone fresco e risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone fresco.

Filtrare le cellule attraverso una rete di nylon e trasferire le cellule in una provetta FACS pre-rivestita con 500 microlitri di tampone. Gate per selezionare le popolazioni cellulari CD4 positive, CD25 negative e CD44 a basso ligando CD62. Quindi, smistare le frazioni di cellule T naive CD4 positive CD25 CD44 CD44 basse CD62 in una nuova provetta da centrifuga da 15 millilitri e pellettare le cellule T CD4 positive isolate mediante centrifugazione.

Per il fattore stimolante le colonie di macrofagi granulociti o la differenziazione delle cellule T-helper GM-CSF, risospendere le cellule T selezionate a una concentrazione di una volta da 10 a una sesta cellula per millilitro in un terreno RPMI completo contenente 50 micromolari di beta-mercaptoetanolo e aspirare l'anticorpo epsilon anti-CD3 da ciascun pozzetto di una piastra pre-rivestita a 48 pozzetti. Quindi, seminare 2,5 volte 10 fino alla quinta cellula in ciascun pozzetto insieme a IL7, anti-CD28 e anti-IFN gamma e incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per tre giorni. Il terzo giorno di coltura, utilizzare un microscopio per controllare la differenziazione cellulare e raccogliere le cellule per la centrifugazione.

Risospendere il pellet in terreno RPMI completo fresco per due lavaggi, risospendendo le celle in un millilitro di terreno completo fresco dopo il secondo lavaggio per il conteggio. Dividere le cellule in tre volumi uguali e stimolare nuovamente la prima aliquota di cellule con PMA e ionomicina in presenza di un inibitore del trasporto proteico per quattro-sei ore. Al termine della stimolazione, raccogliere le cellule per la colorazione con anticorpo anti-CD4.

Dopo 30 minuti, fissare le cellule con 200 microlitri di tampone di fissazione per 20-60 minuti, seguiti da due lavaggi in un millilitro di tampone di permeabilizzazione per lavaggio. Quindi, colorare per l'espressione delle citochine intracellulari per 30 minuti al buio. Per l'analisi PCR quantitativa dell'espressione genica delle citochine cellulari differenziate, attivare le cellule con l'epsilon anti-CD3 legato alla piastra per tre ore.

Quindi, utilizzare un reagente di estrazione dell'RNA fenolico per isolare l'RNA totale per consentire la preparazione del cDNA per la PCR quantitativa. Per valutare la secrezione di proteine citochiniche da parte delle cellule differenziate, ri-stimolare le cellule con epsilon anti-CD3 legato alla piastra per 24 ore e analizzare i surnatanti di coltura per IL17 e GM-CSF mediante ELISA. Circa il 55% delle cellule coltivate in condizioni di differenziazione cellulare T-helper GM-CSF esprimeva GM-CSF, mentre solo circa il 2% delle cellule differenziate in condizioni T-helper 17 esprimeva questa citochina.

Rispetto alle condizioni di differenziazione del T-helper 17 che determinano la produzione di IL17 da parte di circa l'8% delle cellule, le condizioni di differenziazione delle cellule T-helper GM-CSF inducono l'espressione di IL17 solo in circa l'1% delle cellule. In particolare, solo una frazione di cellule esprime IFN gamma o IL4 in entrambe le condizioni di coltura. Le cellule differenziate T-helper GM-CSF dimostrano un'espressione significativamente più elevata dell'mRNA di CSF2, ma un'espressione molto più bassa di IL17 rispetto alle cellule T-helper 17.

Ciò è correlato con l'espressione della proteina GM-CSF osservata nei surnatanti di coltura di cellule T-helper GM-CSF e T-helper 17, con una concentrazione tre volte superiore della citochina rilevata nelle colture cellulari T-helper GM-CSF e nessuna IL17 misurabile. Le cellule T-helper GM-CSF mostrano anche un'espressione leggermente inferiore di Rorc, una maggiore espressione di Stat5 e un'espressione leggermente inferiore di Stat3 rispetto alle cellule T-helper 17, indicando che, sebbene la differenziazione delle cellule T-helper GM-CSF e IL17 sia governata da diversi fattori trascrizionali, possono condividere alcune caratteristiche comuni. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di eseguire tutti i passaggi in cabina di sicurezza biologica per mantenere sterili le cellule e i reagenti.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'analisi del trascrittoma per rispondere a ulteriori domande come: quali sono i geni importanti espressi dalle cellule THGM? Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia per esplorare come il GM-CSF derivato dalle cellule T contribuisca all'infiammazione nei roditori. Non dimenticare che lavorare con il beta-mercaptoetanolo e il reagente di estrazione dell'RNA può essere estremamente pericoloso e che durante l'utilizzo di questi reagenti è necessario prendere sempre precauzioni come l'uso di cappe aspiranti.