Caratterizzazione della rottura della membrana plasmatica MLKL-mediata in Necroptosis

Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave sul ruolo della pseudochinasi a linea mista come MLKL nella necroptosi, come la traslocazione della membrana e la permeabilizzazione nel legame lipidico. Il vantaggio principale di queste tecniche è che implicano direttamente MLKL come esecutore della rottura della membrana plasmatica nella necroptosi. L'imaging su cellule vive ha rivoluzionato il campo della ricerca sulla morte cellulare, in particolare per la necroptosi mediata da MLKL.

La risonanza magnetica nucleare è una potente tecnica per monitorare il legame lipidico alle proteine, come dimostrato qui per MLKL. Iniziare con la piastrella da cinque volte 10 al quarto MLKL knockout di fibroblasti embrionali di topo o MEF che esprimono il dominio esecutore di MLKL fuso a una cassetta di oligomerizzazione e Venus in un millilitro di DMEM integrato in piastre a 24 pozzetti per la loro incubazione notturna in un incubatore per colture cellulari. La mattina successiva, trattare le cellule con doxiciclina per 12 ore per indurre l'espressione del transgene, seguita dall'aggiunta di DMEM standard integrato con dimerizzatore proteico legante FK506 e colorante fluorescente verde impermeabile alla membrana per indurre la necroptosi.

Per monitorare la morte cellulare, posizionare la piastra in un'unità di imaging appropriata alloggiata in un incubatore di coltura di tessuti di mammifero e aprire il software del sistema di imaging. Selezionare la scheda Pianifica scansioni imminenti e selezionare il vassoio, il recipiente, i tipi di scansione e il modello di scansione nella scheda Layout fisico. Seleziona la fluorescenza veloce nella scheda Proprietà e fai clic sulla finestra Timeline e il numero totale di punti temporali e la frequenza di acquisizione per aggiungere il tempo di scansione.

Quindi, fare clic su Applica per avviare l'acquisizione dell'immagine. Per quantificare la necroptosi, selezionare il riquadro Attività e passare il cursore del mouse sullo sfondo di diverse immagini per impostare il conteggio degli oggetti con una soglia di segmentazione fissa superiore al livello di sfondo. Quindi, selezionare Anteprima per esaminare gli oggetti fluorescenti nell'immagine corrente e perfezionare i livelli di soglia in base alle esigenze.

Un'attenta selezione della soglia può essere eseguita osservando i pozzetti multipli sulla piastra e utilizzando la funzione di anteprima del software. Basta fare attenzione a utilizzare la stessa impostazione di soglia per tutti i pozzetti nella piastra. Per integrare i conteggi della fluorescenza verde, nella scheda Avvia nuova analisi selezionare l'intervallo di tempo e i pozzetti da analizzare e inserire il nome del processo di analisi.

Quindi, fare clic su OK e fare doppio clic sul nome del lavoro per esportare i dati per ulteriori analisi in un programma software di grafica appropriato. Per il legame lipidico dell'MLKL mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare o NMR, utilizzare siringhe ermetiche per aliquotare un milligrammo per millilitro dei fosfolipidi di interesse in fiale di vetro pulite per le singole serie di titolazione NMR e posizionare le fiale sotto un flusso gassoso di argon o azoto per cinque-30 minuti. L'erogazione dei lipidi da solventi volatili come il cloroformio o il metanolo deve essere eseguita rapidamente da scorte conservate su ghiaccio secco per ridurre al minimo le incongruenze nelle concentrazioni di lipidi tra i campioni dovute all'evaporazione del solvente.

Al termine del periodo di evaporazione, utilizzare una pinzetta grande per disporre le fiale sul fondo di un pallone di Buchner. Sigillare il pallone con un tappo di gomma e collegare un tubo di plastica collegato a una linea del vuoto per evacuare il contenuto del flaconcino sotto vuoto leggero durante la notte per rimuovere eventuali residui di sostanze organiche. La mattina successiva, aggiungere un tampone NMR integrato con detergente alla concentrazione sperimentale appropriata a ciascuna fiala di vetro con un film lipidico e sonicare la fiala a bagnomaria per un massimo di 30 minuti, interrompendo la sonicazione ogni 10 minuti per verificare la solubilizzazione del film lipidico.

Al termine della sonicazione, lasciare raffreddare le fiale per 15 minuti ed eseguire una diluizione seriale delle micelle lipidico-detergenti in tampone NMR positivo al detergente, sonicando le miscele 1:1 per la serie di concentrazioni desiderata. Preparare campioni NMR di controllo e di riferimento di proteine e additivi rispettivamente in tampone NMR negativi e positivi al detergente, aggiungendo proteine e additivi a ciascuna diluizione lipidica in tampone positivo al detergente. Quindi, trasferire il volume appropriato di campioni in provette NMR di dimensioni adeguate e caricare i campioni sullo strumento NMR.

necroptosi completa dei MEF knockout per MLKL può essere osservata entro un'ora dall'oligomerizzazione mediata da dimero di cellule pre-incubate con doxiciclina che esprimono il transgene fuso. Questa necroptosi cinetica veloce supporta il ruolo di MLKL come esecutore putativo della rottura della membrana plasmatica, con conseguente produzione di punti di Venere associati alla membrana plasmatica entro uno o due minuti dal trattamento con il dimero e la codifica di Venere della periferia cellulare e un graduale arrotondamento cellulare entro due o tre minuti. In caso di necroptosi veloce, le cellule cambiano morfologia dalla loro normale forma allungata a arrotondata e gonfia entro cinque minuti dall'oligomerizzazione, parzialmente rotte a 10 minuti e ampiamente smantellate con citosol scomparso a 20 minuti.

Gli esperimenti in vitro di legame lipidico monitorati mediante spettroscopia NMR rivelano importanti cambiamenti strutturali nella proteina del dominio esecutore MLKL dopo il legame lipidico per spostare la regione del tutore inibitorio dalla conformazione N-elicoidale chiusa a quella aperta e intrinsecamente disordinata, nonché informazioni per residuo su miscele di entrambi i conformeri. È inoltre possibile monitorare le percentuali di conformeri chiusi e aperti in un dato campione, fornendo prove a sostegno dell'interazione del dominio esecutore MLKL con i fosfolipidi e suggerendo un legame diretto tra MLKL e la membrana plasmatica. Quindi, mentre si tenta di quantificare la morte cellulare utilizzando questa procedura, è importante sapere e ricordare che il colorante legante il DNA ha una fluorescenza di soglia più alta rispetto alla proteina di fluorescenza normalmente codificante geneticamente.

Per questo motivo, possono essere utilizzati in parallelo. Si noti inoltre che i lipidi micellari sono sensibili alla temperatura e quindi potrebbe essere necessario ottimizzare la temperatura del campione NMR. Quindi, seguendo questa procedura, potrebbero essere utilizzate altre tecniche come la microscopia a riflessione interna totale e l'elettromicroscopia per affrontare la velocità con cui avviene la rottura cellulare sulle cellule sottoposte a necroptosi e dove la rottura è localizzata sulla membrana plasmatica.

Inoltre, la termoforesi su microscala può essere eseguita per convalidare ortogonalmente il legame di MLKL ai lipidi micellari. Le tecniche descritte in questo video hanno spianato la strada ai ricercatori nel campo della necroptosi per esplorare il ruolo della MLKL come esecutore della rottura della membrana plasmatica. Non dimenticare che lavorare con il cloroformio può essere estremamente pericoloso e che quando si esegue questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare guanti e lavorare in un'area ben ventilata.