Name: Caratterizzazione della rottura della membrana plasmatica MLKL-mediata in Necroptosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Scopri la caratterizzazione della rottura della membrana plasmatica mediata da MLKL nella necroptosi utilizzando microscopia a cellule vive, microscopia elettronica e NMR. Questo protocollo aiuta a studiare i meccanismi di morte cellulare.

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1. clonazione e cella linea generazione
<ol><li>PCR amplificano la regione NBB, corrispondono ai residui dell'amminoacido 1-140 (NBB140), da cDNA umano MLKL per telaio standard basati su enzimi di limitazione clonazione con la proteina legante di oligomerizzazione dominio 2 x FK506 (2xFKBP o 2xFV) e Venus fluorescente proteine nella doxiciclina (Dox) - vettore retrovirale inducibile pRetroX-TRE3G per ottenere NBB140- 2xFV-Venus (tabella 1, figure 1A-B).</li>
	<li>Immortalare primario mlkl- / - o ripk3- / - mlkl- / - fibroblasti embrionali del mouse (MEFs) ottenuti dai rispettivi topi disponibili in laboratorio verde di trasfezione transiente con antigene SV40-grande esprimendo il plasmide. Selezionare cellule immortalate in ~ 1 – 2 settimane e mantenere in DMEM completati con 10% siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-Glutammina, 100 U/mL di penicillina e streptomicina, piruvato di sodio di 1 mM e aminoacidi non essenziali a 37 ° C e 5% di CO2 in tessuto standard incubatori di cultura.</li>
	<li>Trasducono SV40-immortalato mlkl- / - MEFs con il transactivator di tetraciclina inversa controllata (rtTA)-contenente retrovirus espressa da un plasmide contenente il gene di resistenza Consciousness (nostro plasmide modificato) e trattare per 1 settimana con 5 μg/mL Consciousness per selezionare per le cellule che esprimono rtTA28.</li>
	<li>Trasducono i MEFs rtTA-esprimendo con il vettore retrovirale Dox-inducible contenente il chimerico MLKL (pRetroX-NBB140-2xFV-Venus-puro) e selezionare utilizzando 4 con puromicina μg/mL per una settimana, 2 giorni dopo la trasduzione.</li>
</ol>2. vivere-cella microscopia Imaging di Necroptosis MLKL-mediata
<ol><li>Piastra mlkl- / - MEFs esprimendo NBB140-2xFV-Venus ad una densità di 50.000 cellule per pozzetto (1 mL/pozzetto) in 24 piastre ed incubare durante la notte (Figura 2A). Utilizzare cellule vive che macchia per conta cellulare automatizzata (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Curare le cellule per 12 h con Dox (0,5 μg/mL) per indurre l'espressione di NBB140-2xFV-Venus.</li>
	<li>Indurre il necroptosis con dimerizer di 25 nM FKBP (Dim) oltre 25 fluorescente verde membrana impermeabile di nM tingere (Vedi Tabella materiali) in DMEM standard (Vedi 1.2). Cellule che subiscono necroptosis si accumulano il colorante come l'integrità della membrana plasmatica è compromessa da NBB140-mediata di rottura. Effettuare saggi in triplice o quadruplice copia.</li>
	<li>Per monitorare necroptosis utilizzando sistemi di imaging single - o dual-color (Vedi Tabella materiali), posizionare i vasi nella rispettiva unità imaging ospitato in un'incubatrice di coltura di tessuti dei mammiferi.</li>
	<li>Aprire il software (Vedi Tabella materiali) e selezionare la scheda pianificazione prossime analizza sotto l'elenco delle attività. Nota: questo protocollo è per l'imaging utilizzando sistemi di colore unico, ma un software simile è disponibile per i sistemi dual-color.</li>
	<li>Nella scheda Proprietà, selezionare il cassetto", nave, tipi di scansione" e il "modello di scansione" nella scheda "Layout fisico" e "Fast fluorescenza".</li>
	<li>Aggiungere "Scan Time" cliccando sulla finestra "Temporale" e il numero totale di punti di tempo e frequenza di acquisizione (in genere 1 acquisizione ogni 0,5 h-1 h per 6 h alle 12h, o ogni 5 min per fast-cinetica necroptosis) e avviare l'acquisizione di immagini selezionando "App ly"(pulsante rosso).</li>
	<li>Quantificare la necroptosis utilizzando il software di analisi di immagine (Vedi Tabella materiali) selezionando "Riquadro attività", "Oggetto Counting nuova analisi con soglia di segmentazione fissa sopra il livello di sfondo", che può essere determinato facendo passare il cursore del mouse sulle regioni di sfondo in diverse immagini utilizzate nell'analisi.</li>
	<li>Esaminare oggetti fluorescenti selezionando anteprima utilizzando l'immagine corrente e perfezionare i livelli di soglia come necessario.</li>
	<li>Integrare i conteggi di fluorescenza verde aprendo la scheda "Launch New Analysis", scegliere il "intervallo di tempo", selezionare i pozzetti per essere analizzati, inserire il "nome di processo di analisi" e premere "OK".</li>
	<li>Accesso ha analizzato i dati dalla scheda "Analisi processi" facendo doppio clic sul nome del rispettivo lavoro ed esportazione dalla finestra grafico/esportazione per ulteriore analisi in esterno grafica software (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Quantificare i dati come fluorescenza verde positivo (+ ve) conteggi/mm2 o normalizzare i conteggi di confluenza ed esprimere i dati come fluorescenza verde + ve conteggi/confluenza.</li>
	<li>Facoltativamente, l'endpoint sperimentale, macchia cellule con 100 nM della membrana-permeante verde fluorescente tingere (Vedi Tabella materiali). Normalizzare i dati alle celle necroptotic % come il rapporto della fluorescenza fluorescenza verde/verde all'endpoint.</li>
</ol>3. vivere-cella microscopia confocale Imaging di reclutamento della membrana plasmatica e permeabilizzazione di MLKL
<ol><li>Piastra mlkl- / - MEFs esprimendo NBB140-2xFV-Venus ad una densità di 20.000 cellule per pozzetto (0,5 mL/pozzetto) in un bicchiere basso camera 4 pozzetti microscopia pretrattato con 50 µ g/mL in PBS a 37 ° C per 30 min e incubare per ~ 12 h ( Figura 2B).</li>
	<li>Trattare le cellule con Dox (0,5 μg/mL) per ~ 12 h di indurre l'espressione di NBB140-2xFV-Venus.</li>
	<li>Indurre necroptosis incubando con medium fresco (1 mL/pozzetto) contenente 25 nM Dim per indurre NBB140-2xFV-attivazione di Venus e traslocazione alla membrana plasmatica.</li>
	<li>Posizionare la camera su un microscopio confocale, costruito su un supporto invertito dotata di controllo ambientale e un 63 di scansione laser di filatura disco 1,4 obiettivo NA e cominciare imaging acquisizione utilizzando software di scelta (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Inizializzare il software, selezionare l'icona "Focus" e configurazione del filtro di YFP (eccitazione lunghezza d'onda 515 nm).</li>
	<li>Individuare il campo di vista e il piano focale e coinvolgere il sistema di manutenzione di messa a fuoco utilizzando la scheda "Precisa messa a fuoco".</li>
	<li>Per iniziare l'acquisizione, selezionare la scheda di "Acquisizione" seguita da assegnazione di configurazione del filtro, appropriato EMCCD fotocamera esposizione tempo e intensificazione guadagno e parametri di acquisizione Time-lapse compreso intervallo e la lunghezza di acquisizione.</li>
	<li>Monitorare cellulare ridistribuzione del fluorescente NBB140-2xFV-proteina Venus durante necroptosis con l'acquisizione di immagini ogni 10 s di una macchina fotografica EMCCD utilizzando un laser di 515 nm (1 film). Nota: Photobleaching è una preoccupazione con formazione immagine di proteina fluorescente. Venere è una delle proteine fluorescenti più resistente a photobleaching29. Se vengono utilizzate le proteine fluorescenti che sono più suscettibili di photobleaching, immagine ogni 30 s o più tempo per consentire il ripristino del segnale tra imaging tempo punti.</li>
	<li>Per monitorare la membrana plasmatica associazione di NBB140-2xFV-Venus durante necroptosis, immagine ogni 10 s il campione preparato in 3.3 di fluorescenza di riflessione interna totale microscopia (TIRF) utilizzando un microscopio equipaggiato con un cursore TIRF automatizzato e un 100 x 1.4 NA obiettivo e una telecamera EMCCD (2 film). Seguire i passaggi 3,5 – 3,7, ma regolare l'angolo TIRF all'interno della scheda di messa a fuoco TIRF secondo campione e basso spessore di vetro della camera di microscopia. Nota: i marcatori di membrana plasmatica come LCK-C-RFP possono essere utilizzati come controlli per la localizzazione di membrana plasmatica in analisi TIRF.</li>
	<li>Eseguire l'elaborazione delle immagini per migliorare la qualità di convoluzione con il negativo normalizzato secondo derivato di una funzione gaussiana (algoritmo di Marr).</li>
</ol>4. microscopia elettronica
<ol><li>Piastra mlkl- / - MEFs esprimendo NBB140-2xFV-Venus ad una densità di 5 milioni di cellule in un 150 mm rivestite con plasma cell piastra di coltura e incubare per 12 h (Figura 3).</li>
	<li>Trattare le cellule con doxiciclina (0,5 μg/mL) per indurre l'espressione di NB1-140-2xFV-Venus per 12 h.</li>
	<li>Indurre NBB140-2xFV-attivazione di Venus e traslocazione alla membrana plasmatica con 25 nM di homodimerizer per 5 min. Questa volta è stabilito dalla cinetica di necroptosis osservato nell'imaging di cellule vive.</li>
	<li>Rimuovere il supporto e fissare le cellule con 10 mL di soluzione 2,5% glutaraldeide, paraformaldeide di 2% in tampone 0,1 M a pH 7.4 sodio cacodilato (tampone cacodilato) preriscaldato a 37 ° C.</li>
	<li>Raccogliere il campione da raschiare e girare i campioni per 10 min a 500 x g. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Postfix il campione per 1,5 h in tetrossido di osmio ridotto 2% con ferrocianuro di potassio 1,5% in tampone cacodilato di sodio 0.1 M. Tetrossido di osmio è un agente colorante ampiamente utilizzato in TEM per fornire contrasto. Abbiamo usato TEM come analisi preliminare prima del SEM di cella in fase di necroptosis.</li>
	<li>Sciacquare il campione 5 volte in acqua ultrapura per 5 minuti ciascuno a 500 x g, seguito da risciacqui nel buffer (vedere 4.6), acqua ed etanolo su un elaboratore automatico. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Per SEM, macchia i campioni precedentemente fissati con 1% uranile acetato e piombo aspartato macchia metalli pesanti31.</li>
	<li>Disidratare i campioni attraverso una serie graduata di alcool e propilene ossido soluzioni.</li>
	<li>Incorporare il campione in resina dura32 per ottenere un blocco di resina.</li>
	<li>Tagliare sezioni spesse di 0,5 μm per determinare la corretta area di analisi.</li>
	<li>Rivestire i campioni con un film ultra-sottile di metallo elettricamente conduttori (Iridium).</li>
	<li>Immagine e analizzare i campioni (Figura 3). Per la quantificazione, viene analizzata una basso ingrandimento immagine della superficie del blocco di resina con cellule esposte a 5 keV utilizzando un microscopio elettronico.</li>
	<li>Visualizzare le cellule attraverso singole immagini catturate da SEM o software di imaging può essere utilizzata per unire più campi di vista in una sola immagine contigua30. Circa 100 cellule possono essere utilizzate per valutare la frazione di cellule in fase di necroptosis in questo modo generando un montaggio ad alta risoluzione nel software di scelta (Vedi Tabella materiali). Nota: Segnando necrotico morfologia di SEM Confronta caratteristiche della cellula normale con la progressione dei fenotipi pre-necrotici o necrotici. Queste funzionalità includono alterazioni della membrana del plasma tra cui scomparsa microvilli, appiattimento, rotture nelle cellule che vanno da 10 nm a 1 µm in dimensione, o perdita di struttura organello attraverso almeno 30 – 40% della superficie citosolica delle cellule.</li>
</ol>5. lipid Binding di MLKL dalla spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR)
<ol><li>Preparare 15N-labeled NBB1-156 di espressione della proteina standard e purificazione come descritto in precedenza24.</li>
	<li>Sciogliere 500 µ g di sale di ammonio 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (18:0 PI) e sale di ammonio di 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (18:1 PI) in 500 µ l di gelida CHCl3 ciascuno per concentrazioni finali di 1 mg/mL.</li>
	<li>Sottoporre ad ultrasuoni 1 mg/mL 18:0 e PI 18:1 in un bagno di acqua di sonicazione per 1 min a temperatura ambiente o fino a 5 min in una miscela di acqua e ghiaccio.</li>
	<li>
Aliquotare 1 mg/mL 18:0 e PI 18:1 in fiale di vetro pulito per singole serie di titolazione di NMR (Figura 4). Trasferimento dei lipidi in solventi organici utilizzando siringhe in vetro ermetico.
	<ol>
<li>Aliquotare 132 µ l di 1 mg/mL 18:1 PI (massa molare = 880.137 g/mol) in CHCl3 per un volume finale di risospensione di 1.200 µ l a concentrazione di 125 µM. Nota: Per tubi 5mm NMR, preparare volumi di diluizione seriale di > 1.000 µ l e NMR finale esempio volumi di > 500 µ l. Per tubi da 3 mm NMR, preparare volumi di diluizione seriale di > 300 µ l e NMR finale esempio volumi di > 150 µ l.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aliquotare 1 mg/mL porcine cervello L-α-fosfatidilinositolo-4,5-bisfosfato sale di ammonio in 20:9:1 CHCl3/MeOH/H2O (cervello PI (4,5) P2) in fiale di vetro pulito.</li>
	<li>Posizionare fiale sotto un flusso gassoso di argon (Ar) o di azoto (N2) con flusso moderato per far evaporare il solvente organico senza schizzi contro le pareti del flaconcino di vetro. Cinque a trenta min è in genere sufficiente per volumi di solvente organico di 10-200 µ l.</li>
	<li>Organizzare o i flaconcini di vetro in fondo di un Büchner o beuta da vuoto con grande pinzette, sigillare con un tappo di gomma e collegare il tubo di plastica collegato a una linea di vuoto. Evacuare il pallone sotto vuoto mite durante la notte per rimuovere sostanze organiche residue.</li>
	<li>Sovrapporre le aliquote di pellicola lipidica con gas inerte, sigillare con un coperchio a chiusura ermetica e conservare a-20 ° C per l'uso entro un mese o a-80 ° C per la conservazione a lungo termine.</li>
	<li>Preparare il buffer del campione NMR senza detersivo (-Det) contenente 20 mMxH NayPO4 a pH 6.8, 10% D2O e con detergente (+ Det) contenente 20 mMxH NayPO4 a pH 6.8, 10% D2O, 0,34 mM n-dodecil-β-D-maltopyranoside (DDM).</li>
	<li>Aggiungere + Det buffer per flaconcino di vetro con film lipidico per ottenere la concentrazione desiderata e Sonicare a bagnomaria per fino a 30 min, alternati sonicazione per 10 min seguita da ispezione visiva. Nota: Sonicazione può riscaldare il campione. Lasciarli raffreddare a temperatura ambiente per 15 min prima della ricostituzione del campione finale di proteine.</li>
	<li>Effettuare diluizioni seriali di micelle lipidiche-detergente in + Det buffer mediante sonicazione di miscele 1:1 per la serie di concentrazione desiderata. A partire da concentrazione di lipidi 125 µM, tre ripetizioni produrrà 62,5 µM, 31,3 µM e dei lipidi in 0,34 mM DDM 15,6-µM.</li>
	<li>Controllo di preparare e fare riferimento a campioni di NMR di proteine e additivi in - Det e + buffer Det, rispettivamente. Aggiungi proteine e additivi per ogni diluizione del lipido in + buffer di Det. Nota: Per 15NBB N156, proteina è aggiunto ad una concentrazione finale di 40 µM e completata con 2mm deuterated dithiothreitol per mantenere residui di Cys ridotti.</li>
	<li>Trasferire il volume appropriato di campioni a 5 mm o 3 mm tubi NMR (vedere nota punto 5.4).</li>
	<li>Caricare i campioni in strumento NMR o organizzare in una piattaforma di automazione come il caricatore di SampleCase manualmente.</li>
	<li>Acquisire spettri NMR compositi utilizzando programmi di impulsi standard per spettri di 1H protone come controllo di qualità, seguita da 2D 1H -15N spettri di correlazione sia come spettroscopia di rilassamento trasversale ottimizzato (TROSY) o eteronucleari multiple quantum coerenza (SOFAST-HMQC)33. Nota: L'utilizzo di tubi da 3 mm NMR richiede 64 scansioni per 1 H -15TROSY N (~ 3 h) o 1H -15N SOFAST-HMQC (~ 90 min). Scansione di numeri sono dimezzati per i tubi NMR di 5 mm.</li>
	<li>Elaborati 2D spettri RMN possono essere aggiunto a una CARA repository34 per analisi o altri software di scelta per l'utente.</li>
	<li>
Analisi software annotando 2D risonanze NMR per tre cime ben dispersi e risolti per ciascuno stato di proteina. Registrare le ampiezze di picco per ognuno dei sei picchi per ogni condizione di buffer contenente NBB156 (Figura 5A).
	<ol>
<li>Utilizzare CARA per preparare un elenco di batch-integrazione (intestazione fare clic sul Menu principale "spettro | Impostazione elenco Batch"...) di tutti gli spettri raccolti e analizzare utilizzando un file di assegnazione singolo picco (intestazione fare clic sul Menu principale "picchi | Importare Peaklist"... e scegliere un file definito dall'utente .peaks con 6 punte totale, 3 per ogni stato di proteina, definita all'interno).</li>
		<li>Regolare le impostazioni ("Integrator | Sintonia modello Peak"...) di larghezza X 0,06 ppm e Y-larghezza 0,30 ppm (intestazione fare clic sul Menu principale "Integrator | Sintonia modello Peak"...) prima di registrare l'output finale in due selezioni di menu (1. Fare clic sull'intestazione di Menu principale "Integrator | Integrare l'elenco Batch") (2. Fare clic sull'intestazione di Menu principale "picchi | Esporta tabella di integrazione") (Figura 5B). Nota: Le risonanze di ammide di spina dorsale per residui M21, V53 e L105 sono state assegnate per lo stato di chiuso-brace156 NBB. Lo stato di parentesi graffa di apertura è stato assegnato risonanze di ammide di spina dorsale dei residui G130 e A141 e la risonanza di lato-catena protone epsilon di W133 utilizzando 3D di esperimenti NMR24.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Normalizzare i campioni per confronto diretto da diversi magneti o condizioni campione in media le tre ampiezze di parentesi graffa di apertura dei campioni di riferimento e calcolando un fattore di normalizzazione relative i due riferimenti. Calcolare le ampiezze in scala per risonanze156 NBB utilizzando il fattore di normalizzazione e ampiezze negativo impostazione a zero (tabella 2). Esempi: 1) confrontando campioni da diversi magneti: magnete una e magnete B, DDM, NBB156+ DDM, NBB156. 2) detergente confronto: 0,34 mM DDM e 1,7 mM DDM.</li>
	<li>Calcolare per ogni risonanza la frazione in scala della chiuso-aperto-gancio o dividendo con l'intervallo di ampiezza minima al massimo di tutti gli spettri raccolti contenenti riferimenti appropriati di libero NBB156 e completamente open-brace NBB156 a detergente.</li>
	<li>Tracciare le ampiezze di NMR normalizzate in funzione della concentrazione dei lipidi e confrontare la frazione di Apri-brace NBB156 in condizioni diverse (fig. 5C). Nota: In alternativa, analisi della frazione di conformazione di parentesi graffa chiusa contro la concentrazione dei lipidi possono essere eseguita per confrontare associazione del lipido a NBB156. Noi preferiamo l'analisi precedente perché è più veloce e migliore rapporti sulla frazione completamente-impegnati dai lipidi.</li>
</ol>

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<li>Tanzer, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+divergence+of+the+necroptosis+effector+MLKL%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Evolutionary divergence of the necroptosis effector MLKL.</a> Cell Death & Differentiation. 23 (7), 1185-1197 (2016).</li>
</ol>

Forniamo i protocolli per le tecniche che abbiamo combinato implicati MLKL come il presunto boia di membrana plasmatica rottura24. Oltre a decifrare la rete di regolamentazione che regola necroptosis MLKL-mediata, queste tecniche possono essere utilizzate in modo indipendente per caratterizzare altri sistemi biologici adatti. In pratica, queste tecniche sono strumenti di rilevamento medio-basso rendimento.
Abbiamo usato ordinariamente imaging di cellule vive di NBB...

Identificazione dei componenti genetiche di necroptosis ha facilitato l'uso di modelli animali per testare l'implicazione di necroptosis in fisiologia e malattia1,2,3,4,5. Ko di RIPK3 o MLKL in topi aveva minima implicazione nell'omeostasi sviluppo e adulto, suggerendo che necroptosis non è essenziale per vita3,6. Inoltre, alcune specie non contengono geni o RIPK3 o MLKL, sostenere il ruolo non essenziali di necroptosis in animali7,8. D'altra parte, impegnativo modelli animali knockout con varie patologie indotte in laboratorio ha rivelato un importante ruolo di necroptosis nell'infiammazione, immunità innata e l'infezione virale9,10, 11 , 12.
Necroptosis può essere attivato in diversi modi di segnalazione attraverso sensori differenti immunità innata, tutti che provocano l'attivazione di RIPK31,13,14. RIPK3 attivo a sua volta fosforila e attiva MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15,16,17,18. Il più studiato e forse il modo più complesso, che portano all'attivazione di RIPK3 coinvolge morte recettore legatura, che si biforca sulla base della composizione a valle dei complessi segnalazione sia indurre apoptosi o necroptosis1. Necroptosis consegue quando segnalazione attraverso RIPK1 è favorita e si traduce in impegno di RIPK319,20. Questo risultato è facilmente favorito su inibizione farmacologica o delezione genetica della caspasi 8, un inibitore endogeno putativo di necroptosis che tiene a bada il necroptosis. RIPK1 lega a ed attiva RIPK3. Un altro modo per attivare necroptosis è attraverso recettori Toll-like TLR3/TLR4 segnalazione, che coinvolge e attiva il RIPK3 TIR-dominio-contenente adattatore-induzione dell'interferone-β (TRIF)21. Un altro modo per morire di necroptosis è di attivazione del sensore del DNA DAI, che direttamente si impegna e si attiva RIPK322.
MLKL è una proteina citosolica composta da un N-terminale dell'elica bundle (NB) e un dominio di pseudochinasi C-terminale (psKD) collegati da una parentesi graffa regolamentazione regione3. In cellule normali, MLKL si trova nel citosol dove si pensa di essere in un complesso inattivo con RIPK314. Attivazione di necroptosis innesca fosforilazione di RIPK3 di MLKL nel ciclo di attivazione della psKD e potenzialmente altri siti nel NB e parentesi graffa3,15,23. La fosforilazione induce un cambio conformazionale in MLKL che si traduce in dissociazione dal RIPK314. Capito male cambiamenti conformazionali rilasciare il tutore dal psKD24. L'ortesi, che contiene 2 eliche, media oligomerizzazione di MLKL in un trimero putativo attraverso il C-terminale dell'elica25. L'elica del N-terminale della ginocchiera inibisce il dominio NB, che è essenziale per la permeabilizzazione della membrana24,26. In isolamento, NB dominio è sufficiente per indurre la permeabilizzazione della membrana del plasma e necroptosis16,24,27. L'attività di pro-necroptotic NB è stato ricostituito in fibroblasti embrionali del mouse carenti in MLKL (mlkl- / - MEFs). NB è un dominio di legame del lipido che coinvolge preferenzialmente il difosfato di fosfatidilinositolo 4,5 del fosfolipide (PIP2). Abbiamo proposto un meccanismo graduale dell'attivazione di MLKL, in cui parentesi graffa oligomerizzazione facilita il reclutamento di MLKL alla membrana del plasma tramite interazioni deboli di NB con il gruppo di testa polare di2 PIP24. La membrana, il NB subisce regolamentato l'esposizione di un sito di associazione aggiuntive di alto-affinità per PIP2, che è mascherato dal tutore in MLKL inattivo. Nel complesso, le interazioni multiple di NB con PIP2 destabilizzano la membrana plasmatica che porta alla sua rottura, anche se il meccanismo molecolare di questi eventi non sono stati delucidati.
Qui illustriamo metodi specifici utilizzati per caratterizzare la funzione di MLKL come boia di necroptosis24. In particolare, ci concentriamo sul dominio più minimo del MLKL, NB e brace (NBB), che è regolata tramite inibizione di parentesi graffa e può essere attivato attraverso la dimerizzazione forzata per indurre la necroptosis e la rottura della membrana del plasma. Descriviamo il nostro sistema di espressione inducibile combinato con forzata dimerizzazione di FKBP-mediata indotta dai farmaci per l'imaging di cellule vive e la microscopia elettronica delle cellule che subiscono necroptosis. Inoltre, vi illustriamo la nostra analisi in vitro NMR delle interazioni della NBB con phosphatidylinositols (PIPs).

<table><tbody><tr><td>Clonaggio e generazione di linee cellulari</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pRetroX-TRE3G</td><td>Clontech</td><td>631188</td><td></td></tr><tr><td>Tet-On transattivatore plasmide</td><td></td><td></td><td>Llambi et al., 2016</td></tr><tr><td>Fibroblasti embrionali di topo (MEFs) mlkl-/-</td><td></td><td></td><td>Dillon et al., 2014</td></tr><tr><td>Blasticidina S cloridrato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2647100 CAS#3513-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Quantificazione della morte cellulare e microscopia su cellule vive</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doxiciclina</td><td>Clontech 631311</td><td>CAS# 24390-14-5</td><td></td></tr><tr><td>B/B Omomodizzatore AP20187</td><td>Takara</td><td>635059 CAS# 195514-80-8</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Verde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>Syto16</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7578</td><td></td></tr><tr><td>NMR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 N Cloruro di ammonio</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>NLM-467-10 CAS# 12125-02-9</td><td></td></tr><tr><td>DTT deuterato</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-2622-1</td><td></td></tr><tr><td>Ossido di deuterio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>617385-1 CAS# 7789-20-0</td><td></td></tr><tr><td>n-dodecil-&beta;-D-maltopiranoside</td><td>Anatrace</td><td>D310 CAS# 69227-93-6</td><td></td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatidilinositolo-4,5-bisfosfato (cervello, suino) (sale di ammonio)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840046X CAS# 383907-42-4</td><td></td></tr><tr><td>1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoinositolo (sale di ammonio) (18:0 PI)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850143 CAS# 849412-67-5</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-mio-inositolo) (sale di ammonio) (18:1)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850149 CAS# 799268-53-4</td><td></td></tr><tr><td>Specialized Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte FLR o ZOOM</td><td>Essen BioScience, Inc.</td><td></td><td>Imaging per microscopia su cellule vive</td></tr><tr><td>Helios NanoLab 660 DualBeam&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific Microscopio</td><td></td><td>elettronico</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR)</td><td>Essen BioScience, Inc.</td><td>http://www.essenbioscience.com</td><td>Analisi di imaging</td>,</tr><tr><td>FEI MAPS</td>, <td>Thermo Fisher Scientific,</td><td></td> <td>analisi https://www.fei.com/software/maps/ EM</td></tr>, <tr><td>TopSpin v3.2</td>, <td>Bruker, BioSpin</td><td>http://www.bruker.com</td><td>NMR, raccolta dati</td></tr><tr><td>CARA v1.9.1.7</td><td></td><td>http://cara.nmr.ch/&nbsp;</td><td>Analisi dei dati NMR</td></tr><tr><td>Slidebook</td><td>3i (Intelligent Imaging Innovations)</td><td>https://www.intelligent-imaging.com/slidebook</td><td>Microscopia confocale</td></tr></tbody></table>

caratterizzazione della rottura della membrana plasmatica mlkl-mediata in necroptosis

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Necroptosis è una via di morte programmata delle cellule innescata dall'attivazione del recettore interacting protein chinasi 3 (RIPK3), che fosforila e attiva la pseudochinasi dominio chinasi-come stirpe misto, MLKL, rottura o permeabilize la membrana plasmatica . Necroptosis è un percorso infiammatorio associato con patologie multiple, tra cui il cancro, le malattie infettive e cardiovascolari, ictus, neurodegenerazione e autoimmunità. Qui, descriviamo i protocolli che possono essere utilizzati per caratterizzare il MLKL come il boia di rottura della membrana del plasma in necroptosis. Visualizziamo il processo di necroptosis in cellule usando la formazione immagine della vivere-cella con microscopia di fluorescenza confocale e convenzionale e in cellule fissate mediante microscopia elettronica, che insieme hanno rivelato la ridistribuzione dei MLKL dal cytosol al plasma membrana prima di induzione di grandi fori nella membrana plasmatica. Vi presentiamo in vitro analisi di risonanza magnetica nucleare (NMR) utilizzando i lipidi per identificare putativi modulatori di necroptosis MLKL-mediata. Basato su questo metodo, abbiamo identificato quantitativa del lipido-associazione preferenze e fosfatidil-inositolo fosfato (PIPs) come leganti critici di MLKL che sono necessari per il targeting di membrana plasmatica e permeabilizzazione in necroptosis.

Visualizzare l'esecuzione di necroptosis regolamentati in cellule vive è stato possibile attraverso l'espressione inducibile di un costrutto MLKL troncato minimal, NBB140-2xFV-Venus. Questo costrutto mantiene la capacità di indurre la permeabilizzazione della membrana del plasma e viene attivato tramite oligomerizzazione Dim-indotta della cassetta FKBP (2xFV). Osserviamo e quantificare necroptosis da microscopia di cellule vive di imaging, monitoraggio cineticamente (ogni 5 min...

Segnaliamo i metodi per la caratterizzazione della rottura della membrana plasmatica MLKL-mediata in necroptosis compreso formazione immagine convenzionale e confocale microscopia di cellule vive, microscopia elettronica, e associazione basata su NMR del lipido.

Caratterizzazione della rottura della membrana plasmatica MLKL-mediata in Necroptosis

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and ...

Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave sul ruolo della pseudochinasi a linea mista come MLKL nella necroptosi, come la traslocazione della membrana e la permeabilizzazione nel legame lipidico. Il vantaggio principale di queste tecniche è che implicano direttamente MLKL come esecutore della rottura della membrana plasmatica nella necroptosi. L'imaging su cellule vive ha rivoluzionato il campo della ricerca sulla morte cellulare, in particolare per la necroptosi mediata da MLKL.La risonanza magnetica nucleare è una potente tecnica per monitorare il legame lipidico alle proteine, come dimostrato qui per MLKL. Iniziare con la piastrella da cinque volte 10 al quarto MLKL knockout di fibroblasti embrionali di topo o MEF che esprimono il dominio esecutore di MLKL fuso a una cassetta di oligomerizzazione e Venus in un millilitro di DMEM integrato in piastre a 24 pozzetti per la loro incubazione notturna in un incubatore per colture cellulari. La mattina successiva, trattare le cellule con doxiciclina per 12 ore per indurre l'espressione del transgene, seguita dall'aggiunta di DMEM standard integrato con dimerizzatore proteico legante FK506 e colorante fluorescente verd

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Qui, presentiamo un protocollo per la determinazione degli eventi di segnalazione intracellulare indotti in cellule vitali dall'interazione fisica con cellule morte o morenti adiacenti. Il protocollo si concentra sugli eventi di segnalazione indotti dal riconoscimento mediato dal recettore delle cellule morte, in contrapposizione al loro assorbimento fagocitario o al rilascio di mediatori solubili.

Identificazione di segnale intracellulare eventi indotta in cellule vitali per interazione con le cellule vicine sottoposti apoptotica delle cellule morte

Descriviamo la rilevazione di NLRP3 inflammasome attivazione su base cellulare utilizzando la microscopia a fluorescenza e la macchiatura per active caspasi-1 e l'adattatore, ASC. Un test di rilascio di lattato deidrogenasi è presentato per rilevare pyroptotic lisi su base di popolazione. Queste tecniche possono essere adattate per studiare molti aspetti della biologia inflammasome.

Rilevamento di attivazione Inflammasome e morte delle cellule Pyroptotic in macrofagi murini derivate da midollo osseo

Qui descriviamo un'analisi fluorescenza-basata di alto-rendimento che misura la membrana plasmatica risigillazione efficienza attraverso analisi fluorometriche e imaging in cellule viventi. Questo test può essere utilizzato per lo screening di farmaci o geni che regolano la chiusura della membrana plasmatica in cellule di mammifero.

Misurazione di High-throughput di membrana plasmatica risigillazione efficienza in cellule di mammifero

Questo protocollo descrive un metodo completo per valutare l'attivazione della caspasi (caspasi-1, caspasi-3, caspasi-7, caspasi-8, caspasi-9 e caspasi-11) in risposta a modelli di infezione, insulti sterili e cancro sia in vitro che in vivo (nei topi) per determinare l'inizio delle vie di morte cellulare, come piroptosi, apoptosi, necroptosi e PANoptosi.

Valutazione dell'attivazione della caspasi per valutare la morte delle cellule immunitarie innate

L'amplificazione del segnale della tiramido durante la colorazione immunofluorescente consente la rilevazione sensibile di RIPK3 e MLKL fosforilati durante la necroptosi indotta da ZBP1 dopo infezione da HSV-1.

Amplificazione del segnale tiramido per la colorazione immunofluorescente della fosforilazione ZBP1-dipendente di RIPK3 e MLKL dopo infezione da HSV-1 in cellule umane

Questo protocollo descrive in dettaglio la preparazione di CLON-G per estendere la durata della vita dei neutrofili a più di 5 giorni e fornisce una procedura affidabile per valutare la morte dei neutrofili con citometria a flusso e microscopia a fluorescenza confocale.

Estensione della durata della vita dei neutrofili con CLON-G e un saggio di morte spontanea in vitro

Questo protocollo si basa sulla LPS e sulla morte indotta da ATP dei macrofagi THP-1 differenziati da PMA. Utilizziamo la citometria a flusso per analizzare l'annessina V e la doppia colorazione 7-AAD per rilevare la morte cellulare, utilizzando l'intera cellula e impiegando la microscopia elettronica a scansione per osservare la morfologia della membrana cellulare.

LPS e morte indotta da ATP dei macrofagi THP-1 differenziati da PMA e sua validazione

Questo protocollo descrive un metodo di imaging su cellule vive per monitorare la permeabilizzazione della membrana lisosomiale durante la necroptosi, utilizzando sonde fluorescenti che rilevano cambiamenti nell'integrità e nell'acidificazione della membrana lisosomiale.

Imaging su cellule vive della permeabilizzazione della membrana lisosomiale durante la necroptosi

Noi descriviamo come misurare vicino a membrana e globale dinamiche di calcio intracellulare negli astrociti in coltura utilizzando riflessione interna totale e epifluorescenza.

Misura Vicino membrana plasmatica e Global Dynamics calcio intracellulare negli astrociti

Endocitosi regolata regola i livelli di superficie cellulare espressione della maggior parte delle proteine ​​di membrana. Qui utilizziamo riducibili, reagenti biotinilazione impermeant membrana per misurare la velocità endocitico del trasportatore della dopamina (DAT), una proteina di membrana politopica. Il metodo favorisce un approccio diretto per misurare il tasso endocitico della maggior parte delle proteine ​​di membrana plasmatica.

Misurazione delle proteine ​​plasmatiche Tariffe endocitico membrana da biotinilazione reversibile

Scopri la caratterizzazione della rottura della membrana plasmatica mediata da MLKL nella necroptosi utilizzando microscopia a cellule vive, microscopia elettronica e NMR. Questo protocollo aiuta a studiare i meccanismi di morte cellulare.

Caratterizzazione della rottura della membrana plasmatica MLKL-mediata in Necroptosis

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