Name: A cellula intera elettrofisiologia di cellule enterocromaffini murino coltura primaria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Impara l'elettrofisiologia a cellula intera di cellule enterocromaffini murine in coltura primaria. Questo metodo consente di studiare in dettaglio l'eccitabilità cellulare e i meccanismi di rilascio ormonale gastrointestinale.

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Gli autori ringraziano la signora Lyndsay Busby per l'assistenza amministrativa e Mr. Robert Highet Mayo il clinica divisione di ingegneria per la progettazione e la stampa 3D dell'inserto piatto cultura. Questo lavoro è stato supportato da NIH K08 AB (DK106456), pilota e fattibilità Grant a AB da Mayo Clinic Center per la segnalazione delle cellule in gastroenterologia (NIH P30DK084567) e 2015 American Gastroenterological Association Research Scholar Award (AGA RSA) AB e NIH R01 GF (DK52766).

<ol><li>Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%22normal%22+endocrine+cell+of+the+gut%3A+changing+concepts+and+new+evidences%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).</li>
<li>Rogers, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+activity-triggered+glucagon-like+peptide-1+secretion+from+primary+murine+L-cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells.</a> The Journal of Physiology. 589, Pt 5 1081-1093 (2011).</li>
<li>Strege, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+channel+NaV1.3+is+important+for+enterochromaffin+cell+excitability+and+serotonin+release%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Sodium channel NaV1.3 is important for enterochromaffin cell excitability and serotonin release.</a> Scientific Reports. 7 (15650), (2017).</li>
<li>Bellono, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterochromaffin+cells+are+gut+chemosensors+that+couple+to+sensory+neural+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways.</a> Cell. 170 (1), 185-198 (2017).</li>
<li>Alcaino, C., Knutson, K., Gottlieb, P. A., Farrugia, G., Beyder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+ion+channel+Piezo2+is+inhibited+by+D-GsMTx4%5BTitle%5D)+AND+%22Channels%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive ion channel Piezo2 is inhibited by D-GsMTx4.</a> Channels. 11 (3), 245-253 (2017).</li>
<li>Kim, M., Javed, N. H., Yu, J. G., Christofi, F., Cooke, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+activates+Galphaq+signaling+pathways+and+5-hydroxytryptamine+release+from+human+carcinoid+BON+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation activates Galphaq signaling pathways and 5-hydroxytryptamine release from human carcinoid BON cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 108 (7), 1051-1059 (2001).</li>
<li>Modlin, I. M., Kidd, M., Pfragner, R., Eick, G. N., Champaneria, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+characterization+of+normal+and+neoplastic+human+enterochromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The functional characterization of normal and neoplastic human enterochromaffin cells.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 91 (6), 2340-2348 (2006).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+ion+channel+Piezo2+is+important+for+enterochromaffin+cell+response+to+mechanical+forces%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive ion channel Piezo2 is important for enterochromaffin cell response to mechanical forces.</a> The Journal of Physiology. 595 (1), 79-91 (2017).</li>
<li>Li, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+cellular+origins+for+serotonin-expressing+and+enterochromaffin-like+cells+in+the+gastric+corpus%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Distinct cellular origins for serotonin-expressing and enterochromaffin-like cells in the gastric corpus.</a> Gastroenterology. 146 (3), 754-764 (2014).</li>
<li>Psichas, A., Tolhurst, G., Brighton, C. A., Gribble, F. M., Reimann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+primary+cultures+of+murine+small+intestine+intended+for+the+study+of+gut+hormone+secretion+and+live+cell+imaging+of+enteroendocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), 55687(2017).</li>
<li>Raghupathi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+unique+release+kinetics+of+serotonin+from+guinea-pig+and+human+enterochromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Identification of unique release kinetics of serotonin from guinea-pig and human enterochromaffin cells.</a> The Journal of Physiology. 591, Pt 23 5959-5975 (2013).</li>
<li>Nozawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPA1+regulates+gastrointestinal+motility+through+serotonin+release+from+enterochromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">TRPA1 regulates gastrointestinal motility through serotonin release from enterochromaffin cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3408-3413 (2009).</li>
<li>Reimann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+functional+role+of+voltage+gated+cation+conductances+in+the+glucagon-like+peptide-1+secreting+GLUTag+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line.</a> The Journal of Physiology. 563, Pt 1 161-175 (2005).</li>
</ol>

Comprendere appieno la funzione delle cellule CE richiede un metodo di coltura primaria di alta qualità per generare cellule per elettrofisiologia tutta la cella. Colture primarie di epitelio GI erano stata tradizionalmente difficile dovuto la bassa sopravvivenza. Alleviare questo fattore di confusione, il presente metodo produce colture di cellule EC singolare dall'intestino sia piccolo o grande che sono in grado di sopravvivere per diversi giorni.
Abbiamo trovato che erano critici per miglio...

L'epitelio gastrointestinale (GI) è una comunità variegata composta da diversi tipi di cellule. Le cellule enteroendocrine costituiscono circa 1% di tutte le cellule epiteliali e cellule enterocromaffini (EC) sono il più grande popolazione di cellule enteroendocrine1. Studi recenti dimostrano che ce3,4 cellule enteroendocrine2 e sono elettricamente eccitabili. Siamo interessati a capire primario elettrofisiologia cellulare di CE. Così, lo scopo di questo studio era di stabilire colture primarie di cellule CE ottimizzati per elettrofisiologia tutta la cella.
Cella CE esistente linee che producono e secernono 5-HT (ad es., QGP-15, BON6, KRJ-17) e sono state usate per esaminare l'elettrofisiologia5,8 vengono tipicamente generate da immortalato neoplastici tessuti. Mentre le informazioni acquisite da queste linee cellulari sono prezioso5,8, studi di elettrofisiologia cellulare primaria sono necessari per comprendere correttamente la fisiologia cellulare CE. L'elettrofisiologia di cellule primarie CE richiede l'isolamento e coltura di singole cellule epiteliali, che è stato limitato dalla bassa redditività delle culture epiteliali.
Il metodo di cultura presentato in questo studio si basa sui topi transgenici con fluorescente identificati dalle cellule EC, come Tph1-CFP9, utilizzato in questo studio. Il metodo ottimizza primaria misto epiteliali colture sviluppate in precedenza2,10 per singola cella elettrofisiologia3. Metodi precedenti utilizzate combinazioni di tripsina/EDTA plus A collagenosi o EDTA e DTT per digestione enzimatica e utilizzato gradienti di densità per isolare in modo specifico e cultura-cavia11 e ratto CE cellule12. Più recentemente, organoids intestinale sono stati generati e meccanicamente interrotta per registrazioni elettrofisiologiche4. Culture, usando questi metodi sono adatte per esperimenti, analisi di RT-qPCR di rilascio di serotonina e, mentre potrebbero essere usati per elettrofisiologia, fanno affidamento sul successo della generazione organoid che richiede tempo, gradienti di densità per identificare cellule EC e la effetti cellulari e dirompenti di tripsina ed EDTA. Al contrario, il protocollo descritto qui migliora trattamenti enzimatici e meccanici, ottimizza le condizioni di coltura e semplifica le procedure per produrre cellule EC di singole e sane adatte per gli elevati standard cellulari necessari per elettrofisiologia.
Questo metodo sarà utile per gli scienziati che vogliono lavorare su cellule primarie di CE in colture miste anziché culture immortalizzate e vuole indagare l'elettrofisiologia delle singole cellule. Tuttavia, può rivelarsi meno appropriato per lo studio di popolazioni di cellule che hanno bisogno di colture di ordinamento o a lungo termine che richiedono sopravvivenza ultime 72 ore.

<table><tbody><tr><td>Piastra di coltura da 100 mm x 15 mm</td><td>Corning (Falcon)</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta di trasferimento</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica da 10 ml</td><td>Corning (Falcon)&nbsp;</td><td></td><td></td>357551</tr><tr><td>50 ml</td><td>di Corning conico (Falcon)&nbsp;</td><td></td><td></td>352098</tr><tr><td>15 ml</td><td>di Corning conico (Falcon)&nbsp;</td><td></td><td></td>352097</tr><tr><td>Punte per pipette barriera da 1.000 mL</td><td>Thermo Scientific (Art)</td><td>2079E</td><td>Mantenere sterili</td></tr><tr><td>Piastre con fondo in vetro MatTek</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Mantenere sterili</td></tr><tr><td>Pinze per microdissezione - Punte molto fini ed extra lunghe</td><td>Strumenti per la scienza</td><td>fine SB12630M</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche affilate</td><td>Nasco</td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per micro-dissezione</td><td>Nasco</td><td>SB46568M</td><td></td></tr><tr><td>Monoject Hypo Needle, 21 G x 1" A, 100/BX</td><td>Covidien</td><td>8881250172</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice</td><td>Jackson</td><td>Stock # 028366</td><td>Utilizzare topi maschi o femmine di età compresa tra 4 e 7 settimane</td></tr><tr><td>Aghi per siringa non metallici Microfil (calibro 34, 67 mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm "M" Film da laboratorio</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R6101</td><td>Siringa Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>da 6 ml con punta luer normale</td><td>Siringa monoject</td><td></td><td></td></tr><tr><td>da 3 mL con punta luer regolare</td><td>Monoject</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apparecchiature per elettrofisiologia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di acquisizione dati (daq)</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Condizionatore</td> <td>di segnaleDispositivi molecolari</td><td>CyberAmp 320</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>Dispositivi molecolari</td><td>pClamp 10.6</td><td></td></tr></tbody></table>

a cellula intera elettrofisiologia di cellule enterocromaffini murino coltura primaria

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

Cellule enterocromaffini (EC) nell'epitelio gastrointestinale (GI) costituiscono la più grande sottopopolazione delle cellule enteroendocrine. Come le cellule sensoriali specializzate, cellule EC percepiscono stimoli luminal e convertono in eventi di rilascio di serotonina (5-hyroxytryptamine, 5-HT). Tuttavia, l'elettrofisiologia di queste cellule è capito male perché sono difficili per cultura e per identificare. Il metodo presentato in questa carta contorni primaria CE, colture cellulari ottimizzati per elettrofisiologia singola cella. Questo protocollo utilizza un reporter transgenici ciano proteina fluorescente (CFP) per identificare le cellule di topo CE in colture miste di primarie, avanzando l'approccio per ottenere registrazioni di alta qualità di elettrofisiologia di tutta la cella in modalità di morsetto di tensione e di corrente.

Culture: Cellule epiteliali murine primarie effettuate in un modello transgenico Tph1-CFP allegare ai piatti dopo 4 ore e sono pronte per esperimenti fisiologici tra 24-72 h. Quando le condizioni di coltura non avevano state ottimizzate, la coltura delle cellule epiteliali ha consistito di grandi ciuffi, galleggiante di detriti cellulari, membrane danneggiate e segnale debole di PCP nelle cellule CE (Figura 1A). Culture ch...

Cellule enterocromaffini (EC) comprendono un piccolo sottoinsieme delle cellule epiteliali gastrointestinali. Dalle cellule EC sono elettricamente eccitabili e rilascio della serotonina, ancora difficoltà nella coltura e nell'identificazione di cellule EC hanno limitato gli studi fisiologici. Il metodo presentato qui stabilisce un modello di cultura primaria suscettibile di esame delle singole cellule EC di elettrofisiologia.

A cellula intera elettrofisiologia di cellule enterocromaffini murino coltura primaria

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nelle neuroscienze enteriche e nella fisiologia gastrointestinale, come, quali sono i meccanismi di eccitabilità delle cellule enterocromaffini e risposta agli stimoli luminali e quali sono i meccanismi del rilascio dell'ormone gastrointestinale? Il principale vantaggio di questa tecnica è che ci permette di studiare in dettaglio le cellule enterocromaffini utilizzando tecniche a cella singola, come l'elettrofisiologia. A dimostrare la procedura saranno i co-primi autori Kaitlyn Knutson e Peter Strege, gli eccezionali tecnologi che hanno sviluppato queste tecniche.Per iniziare questa procedura, posizionare un ago della siringa da sei millilitri riempito con PBS ghiacciato nel lume del segmento intestinale estratto. Utilizzare le pinze di microdisezione, bloccare e sigillare l'intestino attorno all'ago della siringa e sciacquare delicatamente sei millilitri di PBS attraverso il lume per risciacquare qualsiasi materia fecale. Successivamente, invertire il tessuto intestinale tessendo delicatamente le pinasi della microdisezione attraverso il lume, pizzicando una parete intestinale e ritraendo il tessuto prossimale alla punta del

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Kv canale disfunzione è associata ad aritmie cardiache. Al fine di studiare i meccanismi molecolari che portano a tali aritmie che utilizziamo un protocollo sistematico per l'isolamento di cardiomiociti atriali e ventricolari da Kv topi knockout subunità dei canali ausiliari. Cardiomiociti isolati possono essere utilizzate immediatamente per cellulari studi elettrofisiologici, biochimici o di immunofluorescenza (IF) saggi.

Isolamento e registrazioni dei canali Kv in cardiomiociti murini atriale e ventricolare

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Coltura primaria Rat midollare interna Raccolta cellule del dotto

Dimostriamo un protocollo di coltura cellulare per lo studio diretto dei componenti neuronali e gliali del sistema nervoso enterico. Un neurone / cultura mista glia su vetrini è preparato dal plesso mienterico di topo adulto fornendo la possibilità di esaminare singolo neurone e la funzione glia di elettrofisiologia,...

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Questo video dimostra un protocollo per condurre registrazioni elettrofisiologiche a fibra singola su un preparato di nervo colorettato di topo in vitro.

In vitro Caratterizzazione funzionale del topo colorettale Afferent Endings

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L&#39;incubazione prolungata di acuta neuronale tessuto per Elettrofisiologia e Calcio imaging

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Mixed colture primarie di murino tenue finalizzate allo studio di Gut secrezione dell&#39;ormone e imaging cellulare dal vivo di celle enteroendocrine

Presentiamo un protocollo che combina l'isolamento delle cellule e la registrazione delle patch-clamp a cellule intere per misurare le proprietà elettriche delle cellule epiteliali primarie dissociate dagli epididimidi di cauda di cauda. Questo protocollo consente di indagare le proprietà funzionali delle cellule epitidimali epididimali primarie per illustrare ulteriormente il ruolo fisiologico dell'epididimo.

Registrazioni Patch-clamp intere cellule delle cellule epiteliali primarie isolate dall&#39;epididimo

Descriviamo un metodo per la preparazione delle singole cellule muscolari lisce dei detrusivi appena isolate da campioni di vescica urinaria umana utilizzando una procedura enzimatica in due fasi. Le cellule DSM vitali ottenute possono essere studiate con varie tecniche a cella singola, tra cui l'elettrofisiologia patch-clamp amphotericin-B descritta per rivelare proprietà fisiologiche e farmacologiche.

Preparazione e utilizzo di cellule muscolari lisce del detrusore umano appena isolate per la caratterizzazione delle correnti di Cazione sensibili a 9-Phenanthrol

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Imaging ottico di miociti Murine Ventricolari isolati

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Microscopia confocale per misurare tre modalità di dinamica dei pori di fusione nelle cellule cromaffini surrenali

Questo studio delinea un protocollo per la generazione di monostrati 2D di organoidi suini derivati dall'intestino tenue e crasso. La crescita di questi monostrati è contrassegnata da valori TEER crescenti, che indicano una robusta integrità epiteliale. Inoltre, questi monostrati mostrano risposte secretorie fisiologiche negli esperimenti della camera di Ussing dopo l'applicazione della forskolina.

Organoidi intestinali suini bidimensionali che riflettono le proprietà fisiologiche dell'intestino nativo

Impara l'elettrofisiologia a cellula intera di cellule enterocromaffini murine in coltura primaria. Questo metodo consente di studiare in dettaglio l'eccitabilità cellulare e i meccanismi di rilascio ormonale gastrointestinale.

A cellula intera elettrofisiologia di cellule enterocromaffini murino coltura primaria

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