Piastra-base di coltivazione su larga scala di Caenorhabditis elegans: preparazione del campione per la studio di alterazioni metaboliche nel diabete
24 agosto 2018
Questo protocollo descrive un metodo per la coltivazione su larga scala di Caenorhabditis elegans su terreni solidi. Come alternativa alla coltura liquida, questo protocollo permette di ottenere parametri di diverse scale sotto la piastra-base di coltivazione. Questo aumenta la comparabilità dei risultati omettendo le differenze morfologiche e metaboliche tra cultura mediatica di liquidi e solidi.
Nel campo di C. elegans, questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave che richiedono la produzione di grandi popolazioni di nematodi e campioni utilizzando la coltura su piastra. I principali vantaggi di questo protocollo sono la sua facile istituzione e la sua facilità di descrizione, comprese le insidie e le applicazioni. Dopo aver ottenuto una popolazione sincronizzata di nematodi, aggiungere circa un millilitro di tampone M nine alle piastre e distribuire accuratamente il tampone facendo oscillare le piastre.
Successivamente, raccogli i nematodi in un tubo da 15 millilitri. Ora, capovolgi il tubo e usa un microscopio per valutare la densità dei nematodi. Regolare la densità della sospensione secondo necessità e continuare a valutarla al microscopio.
Applicare 150 microlitri di sospensione direttamente sulle piastre con puntali per pipette modificati. Per garantire una distribuzione uniforme dei nematodi tra le piastre, capovolgere il tubo di sospensione a intervalli regolari. Per prima cosa, lavare i nematodi utilizzando una punta di pipetta modificata con circa 500 microlitri di tampone M nine.
Utilizzando lo stesso tampone, continuare a staccare i nematodi fino a quando la maggior parte degli animali non viene raccolta in sospensione. Quindi, prelevare i nematodi con una punta di pipetta modificata e trasferirli su una piastra con OP50. Le punte delle pipette modificate riducono lo sforzo di taglio e i danni ai nematodi a causa di un diametro maggiore.
Quindi, lasciare asciugare la piastra. Prima di raccogliere i campioni, preparare l'azoto liquido per congelare i nematodi raccolti. Quindi, posizionare il tampone M nine sul ghiaccio.
Applicare un millilitro di tampone M nine su ciascuna piastra e agitare delicatamente per lavare ogni piastra. Quindi, prelevare il volume del tampone M nine e trasferirlo in nuove provette da 15 millilitri. Centrifugare brevemente la provetta a 800 volte g, prima di rimuovere la maggior parte del tampone M nine.
Successivamente, lavare i campioni tre volte con 10 millilitri di tampone M nine per rimuovere eventuali batteri. Utilizzando una pipetta di vetro, trasferire ogni pellet in una provetta vuota da 1,5 millilitri. Utilizzare la pipetta di vetro per prelevare un millilitro di tampone M nine dal secondo tubo da 1,5 millilitri, per sciacquare i nematodi dalla parete della pipetta.
Quindi, lavare i nematodi rimanenti dalle provette da 15 millilitri e trasferirli nelle provette del campione. Quindi, centrifugare le provette del campione a 19.000 volte g per un minuto e rimuovere quanto più surnatante possibile. Quindi, sigillare ogni provetta con un film di paraffina e congelarle immediatamente in azoto liquido.
Conservare i tubi a meno 80 gradi Celsius fino alla preparazione del lisato. Aggiungere gli stessi volumi di perle di ossido di zirconio da 0,5 millimetri e il doppio del volume di tampone lisato con cocktail di inibitori della proteinasi a ciascun campione congelato. Quindi, mettere i tubi in un omogeneizzatore per un minuto a velocità nove.
Centrifugare i campioni per 30 minuti a quattro gradi Celsius e 19.000 volte g. Infine, trasferisci il surnatante in un nuovo tubo su ghiaccio e conservalo a meno 80 gradi Celsius per esperimenti futuri. In questo protocollo, grandi quantità di C. elegans sono state coltivate per applicazioni nella ricerca sul diabete.
Il numero di nematodi raccolti era correlato alla resa proteica del lisato, dimostrando che l'isolamento quantitativo riproducibile delle proteine può essere ottenuto utilizzando questo protocollo. Qui sono mostrate le analisi spettrometriche di massa del metabolita reattivo metilgliossale e i prodotti finali della glicazione avanzata formati dall'esposizione al metilgliossale. Sono stati confrontati i nematodi trattati con glucosio e i controlli.
Il trasferimento dei nematodi tramite pipetta può creare stress da taglio, danneggiando potenzialmente i nematodi. I livelli di stress ossidativo nei nematodi pipettati e nei nematodi trasferiti con un filo metallico non differivano utilizzando questo protocollo. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come il western blot, al fine di rispondere a ulteriori domande in proteomica.
Questo protocollo facilita anche gli esperimenti che mettono in relazione più parametri con la stessa popolazione.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per la coltivazione su larga scala di Caenorhabditis elegans su mezzi solidi. Questo approccio facilita la produzione di popolazioni e campioni di nematodi di grandi dimensioni, migliorando la comparabilità dei risultati.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia dello sviluppo
- Microbiologia
Sfondo
- Caenorhabditis elegans è un organismo modello ampiamente utilizzato.
- La coltivazione su piastra offre vantaggi rispetto alla coltura liquida.
- Comprendere la dinamica delle popolazioni di nematodi è fondamentale per varie applicazioni di ricerca.
- Questo metodo affronta domande chiave nel campo di C. elegans.
Scopo dello studio
- Stabilire un protocollo affidabile per la coltivazione di C.elegans su mezzi solidi.
- Permettere la produzione di popolazioni sincronizzate di nematodi.
- Facilitare esperimenti che richiedono ampie dimensioni del campione.
Metodi Utilizzati
- Sincronizzazione delle popolazioni di nematodi.
- Applicazione del buffer M nine alle piastre.
- Valutazione microscopica della densità di nematodi.
- Regolazione della densità della sospensione secondo necessità.
Risultati principali
- Corretto allestimento di colture di nematodi su larga scala.
- Migliore comparabilità dei risultati ottenuti con la coltivazione su piastre.
- Individuazione di potenziali criticità nel protocollo.
- Applicazioni in diversi contesti di ricerca.
Conclusioni
- Questo protocollo fornisce un metodo affidabile per la coltivazione di C.elegans.
- Migliora la capacità di condurre esperimenti su larga scala.
- Il metodo è semplice e riproducibile.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
La coltivazione su larga scala di C. elegans permette un isolamento riproducibile e quantitativo di proteine per la scoperta di biomarcatori legati al diabete, supportando la validazione di bersagli nelle complicanze neurodegenerative. Questo metodo fornisce un flusso di lavoro scalabile e con ridotto stress da taglio per l'analisi proteomica di AGEs e ROS, direttamente applicabile alla riduzione del rischio meccanicistico nella fase iniziale della scoperta di farmaci. Facilitando la preparazione sincronizzata di popolazioni in condizioni controllate, migliora l'affidabilità predittiva nei modelli preclinici di patologia diabetica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche che collegano l'esposizione al glucosio alla formazione di AGE e ROS in modelli neuronali.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale degli obiettivi mediante la correlazione riproducibile tra resa proteica e numero di nematodi.
- Valore predittivo: Facilita la selezione del portafoglio fornendo dati proteomici quantitativi per l'identificazione di composti promettenti nelle vie delle complicanze del diabete.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per applicazioni downstream come il western blot e la spettrometria di massa.
- Riproducibilità: Standardizza la preparazione dei campioni per ridurre al minimo l’impatto fisiologico e garantire risultati proteomici costanti.
- Scalabilità: Permette l’integrazione di analisi multiple in condizioni di coltura identiche, compatibili con schermature ad alto rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le Malattie: Supporta lo studio delle complicanze diabetiche attraverso modelli di C. elegans che mostrano accumulo di AGE e ROS indipendentemente da fattori di confondimento vascolari.
- Continuità Translazionale: Collega la scoperta alla validazione preclinica consentendo una preparazione campione costante in diverse condizioni sperimentali.
- Avanzamento Corretto per il Rischio: Fornisce lisati affidabili per l'analisi dei biomarcatori, riducendo i falsi positivi nella priorizzazione degli obiettivi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si colloca all'interno del percorso di scoperta, che va dal test delle ipotesi all'identificazione dei composti promettenti fino alla validazione preclinica, supportando in particolare la ricerca sulla neurodegenerazione associata al diabete.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica di ipotesi riguardo alle alterazioni metaboliche nel diabete mediante analisi quantitative di proteine e metaboliti.
- Screening: Fornisce campioni pronti per i saggi con densità standardizzata e minimo stress da taglio, per una valutazione affidabile dei composti.
- Analisi: Consente la misurazione mediante spettrometria di massa di metilgliossale e AGEs, fornendo letture quantitative per il confronto tra condizioni.
- Ricerca Translazionale: Collega la scoperta di fenotipi neuronali alla continuità preclinica attraverso flussi di lavoro proteomici coerenti.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la coltivazione su larga scala di nematodi in numerosi studi legati al diabete.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nei modelli di complicanze diabetiche.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità nei flussi di lavoro proteomici, minimizzando la variabilità nella preparazione dei lisati.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione (go/no-go) grazie a dati biomarcatori affidabili, riducendo il rischio biologico in fase avanzata nei programmi sul diabete.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione degli obiettivi adeguata al rischio, basata su dati riproducibili di modulazione di AGE e ROS.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione di C. elegans e nelle tecniche di sincronizzazione.
- Necessita dell'accesso a centrifughe, omogeneizzatori e azoto liquido per l'elaborazione dei campioni.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la valutazione della densità in sospensione e per i protocolli di lavaggio.
- Comporta considerazioni di adattamento nel trasferimento tra piastre con condizioni sperimentali diverse.
- Include limitazioni pratiche relative alla riduzione dello stress da taglio durante i passaggi di pipettaggio, affrontate mediante l'uso di punte modificate.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
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Title
0:27
Large Scale Culture on Plates
1:15
Transfer of Large Amounts of Caenorhabditis elegans
1:52
Harvest of a Large Caenorhabditis elegans Sample
3:20
Protein Isolation for Mass Spectrometry
3:56
Results: Reproducible Quantitative Protein Isolation and Further Applications of Large-scale C. elegans Culture
4:47
Conclusion
