Valutazione dell'interfaccia sinaptica primaria umana delle cellule di T dal sangue periferico e tessuto linfoide
July 30th, 2018
Il protocollo descrive una tecnica per studiare la capacità delle cellule T umane policlonali primarie per formare sinaptiche interfacce utilizzando lipidici planare. Usiamo questa tecnica per dimostrare la capacità di formazione di sinapsi differenziale delle cellule T umane primarie derivata da linfonodi e nel sangue periferico.
L'approccio di cui parleremo oggi è stato derivato per confrontare le proprietà e le attività funzionali delle cellule T derivate dai tessuti e del sangue periferico. L'importanza dell'argomento è esemplificata dal fatto che le cellule T del sangue periferico rappresentano solo il 20% del totale delle cellule T in un corpo. Essere in grado di studiare un piccolo numero di cellule T derivate da tessuti è molto essenziale, ed è esattamente ciò che abbiamo ottenuto.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che richiede un numero inferiore di cellule e volumi minori di reagenti rispetto alle tecniche tradizionali. Inizia usando una pinza a forbice in polipropilene per immergere i vetrini coprioggetti in una soluzione di piranha acida appena preparata per 25-30 minuti. Al termine del lavaggio, sciacquare i vetrini coprioggetti sette volte in un volume fresco di acqua ultrapura per ogni lavaggio.
Quindi metti da parte i vetrini coprioggetti bagnati per far scivolare via l'acqua rimanente dal bicchiere pulito. Quando i vetrini coprioggetti sono asciutti, aliquotare due microlitri della miscela di liposomi finale esattamente al centro di un canale di scorrimento autoadesivo all'interno di una cappa di flusso sterile. E allineare immediatamente ma con attenzione un vetrino coprioggetti pulito e asciutto con il vetrino per consentire al vetrino coprioggetti di essere abbassato delicatamente sul lato adesivo del vetrino.
E usa l'anello esterno della pinza a forbice in polipropilene per applicare una leggera pressione al contatto periferico del vetrino coprioggetti con il vetrino, assicurandoti che il vetrino sia saldamente attaccato al vetrino per evitare perdite. Quindi capovolgi la diapositiva e usa un pennarello indelebile per disegnare quattro punti attorno al doppio strato sul lato esterno del gruppo diapositiva. Prima della prima iniezione, designare una porta del canale come porta di ingresso e l'altra come porta di uscita, mantenendo questa designazione per tutta la durata dell'esperimento.
Per evitare la formazione di bolle, inserire l'estremità del puntale della pipetta direttamente nella porta di ingresso fino a quando non si avverte la guarnizione in gomma del canale di scorrimento che penetra con il puntale. Riempire lentamente il canale con 50 microlitri di tampone di saggio caldo. Iniettare 200 microlitri di cloruro di nichel (II) nella soluzione bloccante della caseina nella porta di ingresso.
E rimuovere 50 microlitri di tampone dalla porta di uscita. Dopo un'incubazione di 45 minuti, rimuovere la soluzione di caseina in eccesso dalla porta di uscita. Iniettare 100 microlitri di ICAM-1 in soluzione di streptavidina nella porta di ingresso per un'incubazione di 45 minuti a temperatura ambiente.
Al termine dell'incubazione, rimuovere la soluzione proteica in eccesso dalla porta di uscita. E lavare il doppio strato due volte con 100 microlitri di tampone di analisi per lavaggio. Quindi etichettare i doppi strati con 100 microlitri di anticorpo anti-CD3 coniugato con fluoro-4 per 45 minuti a temperatura ambiente.
Seguito da due lavaggi in 100 microlitri di tampone per saggio, come dimostrato. Per visualizzare le interazioni del doppio strato delle cellule T, posizionare il vetrino sul tavolino riscaldato a 37 gradi Celsius di un microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale, o TIRF. E regola il tavolino usando i segni di inchiostro per centrare il doppio strato sull'obiettivo a 100 potenze.
Per l'imaging del rilascio dei granuli, aggiungere frammenti FAB di anticorpi anti-CD107A coniugati a fluorescenza alla sospensione delle cellule T CD4. E risospendere le cellule marcate in 50 microlitri di tampone per l'iniezione nella porta di ingresso del canale del vetrino. Quindi selezionare il numero appropriato di campi sperimentali e registrare le immagini di ciascun campo una volta al minuto per 30 minuti dopo l'iniezione.
In questo esperimento rappresentativo, non sono state osservate differenze tra le cellule T CD8 che formavano sinapsi immunologiche classiche sui doppi strati lipidici costruiti nella cella a flusso o nel vetrino a flusso multicanale. Dopo l'interazione del doppio strato lipidico, le cellule T CD4 hanno stabilito sinapsi immunitarie mature, ma rilasciano o non rilasciano granuli, rilasciano granuli senza la formazione di sinapsi mature o non formano sinapsi né rilasciano granuli. Da notare che le cellule T CD4 derivate da cellule mononucleate del sangue periferico sono in grado di iniziare a rilasciare granuli quasi due volte più velocemente rispetto alle cellule CD4 derivate dai linfonodi.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere una temperatura costante e pipettare lentamente in modo che non si formino bolle. Oltre alle nostre capacità di studiare un'interfaccia a doppio strato di cellule T, questo approccio ci consentirebbe anche di eseguire una colorazione intercellulare delle cellule T che hanno toccato il doppio strato. Il che faciliterebbe in modo significativo una quantità di informazioni che possono essere utilizzate per descrivere particolari cellule T derivate da tessuto linfoide o da altri tessuti.
Non dimenticare che lavorare con la soluzione piranha è estremamente pericoloso ed è fondamentale indossare DPI adeguati mentre si tenta questa procedura.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Panoramica
Questo protocollo delinea una tecnica per investigare le capacità di formazione dell'interfaccia sinaptica delle cellule T umane policlonali primarie utilizzando bilayer lipidici planari. Lo studio evidenzia le differenze nella formazione della sinapsi tra le cellule T derivate dai linfonodi e quelle dal sangue periferico.
Componenti Principali dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienza
- Immunologia
- Biologia Cellulare
Contesto
- Le cellule T del sangue periferico costituiscono solo il 20% del totale delle cellule T nel corpo.
- Studiare le cellule T derivate dai tessuti è cruciale per comprendere le risposte immunitarie.
- La tecnica consente un'analisi con meno cellule e reagenti rispetto ai metodi tradizionali.
- I bilayer lipidici planari forniscono un modello per studiare le interazioni cellulari.
Obiettivo dello Studio
- Confrontare le capacità di formazione della sinapsi delle cellule T derivate dai tessuti e dal sangue periferico.
- Sviluppare un metodo che richieda meno cellule per l'analisi.
- Migliorare la comprensione della funzionalità delle cellule T in diversi ambienti.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di vetrini di vetro utilizzando soluzione piranha acida.
- Risciacquatura dei vetrini in acqua ultra pura.
- Utilizzo di bilayer lipidici planari per gli studi di interazione delle cellule T.
- Valutazione della formazione dell'interfaccia sinaptica tra le cellule T e i bilayer lipidici.
Principali Risultati
- Ha dimostrato capacità differenziali di formazione della sinapsi delle cellule T da diverse fonti.
- Ha confermato l'efficacia della tecnica nello studio di piccole popolazioni cellulari.
- Ha fornito informazioni sulle attività funzionali delle cellule T in vari tessuti.
- Ha evidenziato i vantaggi dell'uso di meno reagenti nelle configurazioni sperimentali.
Conclusioni
- Il protocollo consente con successo lo studio della formazione della sinapsi delle cellule T.
- Offre uno strumento prezioso per i ricercatori che studiano la funzionalità delle cellule T.
- I risultati potrebbero avere implicazioni per la comprensione delle risposte immunitarie nella salute e nella malattia.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
Direct assessment of synaptic interfaces in primary human T cells from both peripheral blood and lymphoid tissue addresses a critical gap in translational immunology and cell therapy R&D. This technique enables mechanistic de-risking and predictive confidence by allowing functional interrogation of rare tissue-derived T cell populations using minimal sample input. The approach supports portfolio decisions by providing quantitative, reproducible data on T cell activation and granule release kinetics relevant to immune modulation strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct functional comparison of tissue- and blood-derived T cells for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by revealing differences in synapse formation and granule release kinetics.
- Facilitates hypothesis testing on immune cell activation pathways using primary human samples.
- Provides quantitative outputs for portfolio triage and early-stage decision making.
Screening & Assay Development
- Establishes a reproducible, low-input assay platform for evaluating T cell activation and effector function.
- Supports assay standardization and scalability by minimizing cell and reagent requirements.
- Enables screening of functional responses in rare or limited primary cell populations.
- Delivers quantitative, time-resolved readouts suitable for compound or biologic evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant tissue T cell phenotypes for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement by comparing functional outputs across health and disease contexts.
- Supports biomarker discovery by correlating synaptic interface dynamics with functional granule release.
- Provides mechanistic insights to inform preclinical model selection and validation.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and translational research by enabling direct, quantitative analysis of primary T cell function from both blood and tissue sources.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of T cell activation and synapse formation mechanisms.
- Screening: Provides a standardized, scalable assay for functional screening of T cell responses.
- Analytics: Delivers quantitative, time-resolved measurements of granule release and synaptic interface formation.
- Translational Research: Facilitates alignment of in vitro findings with disease-relevant tissue phenotypes.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse immune cell functional studies across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in T cell functional studies.
- Operational Value: Minimizes sample and reagent requirements, enabling studies with rare or limited primary cells.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immune modulation programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation and advanced fluorescence microscopy.
- Demands access to TIRF microscopy and precise fluid handling instrumentation.
- Standardization of assay conditions is critical for reproducibility across teams.
- Adaptation may be needed for different tissue sources or T cell subsets.
- Careful handling of hazardous reagents and strict adherence to safety protocols are essential.
