Valutazione dell'interfaccia sinaptica primaria umana delle cellule di T dal sangue periferico e tessuto linfoide

L'approccio di cui parleremo oggi è stato derivato per confrontare le proprietà e le attività funzionali delle cellule T derivate dai tessuti e del sangue periferico. L'importanza dell'argomento è esemplificata dal fatto che le cellule T del sangue periferico rappresentano solo il 20% del totale delle cellule T in un corpo. Essere in grado di studiare un piccolo numero di cellule T derivate da tessuti è molto essenziale, ed è esattamente ciò che abbiamo ottenuto.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che richiede un numero inferiore di cellule e volumi minori di reagenti rispetto alle tecniche tradizionali. Inizia usando una pinza a forbice in polipropilene per immergere i vetrini coprioggetti in una soluzione di piranha acida appena preparata per 25-30 minuti. Al termine del lavaggio, sciacquare i vetrini coprioggetti sette volte in un volume fresco di acqua ultrapura per ogni lavaggio.

Quindi metti da parte i vetrini coprioggetti bagnati per far scivolare via l'acqua rimanente dal bicchiere pulito. Quando i vetrini coprioggetti sono asciutti, aliquotare due microlitri della miscela di liposomi finale esattamente al centro di un canale di scorrimento autoadesivo all'interno di una cappa di flusso sterile. E allineare immediatamente ma con attenzione un vetrino coprioggetti pulito e asciutto con il vetrino per consentire al vetrino coprioggetti di essere abbassato delicatamente sul lato adesivo del vetrino.

E usa l'anello esterno della pinza a forbice in polipropilene per applicare una leggera pressione al contatto periferico del vetrino coprioggetti con il vetrino, assicurandoti che il vetrino sia saldamente attaccato al vetrino per evitare perdite. Quindi capovolgi la diapositiva e usa un pennarello indelebile per disegnare quattro punti attorno al doppio strato sul lato esterno del gruppo diapositiva. Prima della prima iniezione, designare una porta del canale come porta di ingresso e l'altra come porta di uscita, mantenendo questa designazione per tutta la durata dell'esperimento.

Per evitare la formazione di bolle, inserire l'estremità del puntale della pipetta direttamente nella porta di ingresso fino a quando non si avverte la guarnizione in gomma del canale di scorrimento che penetra con il puntale. Riempire lentamente il canale con 50 microlitri di tampone di saggio caldo. Iniettare 200 microlitri di cloruro di nichel (II) nella soluzione bloccante della caseina nella porta di ingresso.

E rimuovere 50 microlitri di tampone dalla porta di uscita. Dopo un'incubazione di 45 minuti, rimuovere la soluzione di caseina in eccesso dalla porta di uscita. Iniettare 100 microlitri di ICAM-1 in soluzione di streptavidina nella porta di ingresso per un'incubazione di 45 minuti a temperatura ambiente.

Al termine dell'incubazione, rimuovere la soluzione proteica in eccesso dalla porta di uscita. E lavare il doppio strato due volte con 100 microlitri di tampone di analisi per lavaggio. Quindi etichettare i doppi strati con 100 microlitri di anticorpo anti-CD3 coniugato con fluoro-4 per 45 minuti a temperatura ambiente.

Seguito da due lavaggi in 100 microlitri di tampone per saggio, come dimostrato. Per visualizzare le interazioni del doppio strato delle cellule T, posizionare il vetrino sul tavolino riscaldato a 37 gradi Celsius di un microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale, o TIRF. E regola il tavolino usando i segni di inchiostro per centrare il doppio strato sull'obiettivo a 100 potenze.

Per l'imaging del rilascio dei granuli, aggiungere frammenti FAB di anticorpi anti-CD107A coniugati a fluorescenza alla sospensione delle cellule T CD4. E risospendere le cellule marcate in 50 microlitri di tampone per l'iniezione nella porta di ingresso del canale del vetrino. Quindi selezionare il numero appropriato di campi sperimentali e registrare le immagini di ciascun campo una volta al minuto per 30 minuti dopo l'iniezione.

In questo esperimento rappresentativo, non sono state osservate differenze tra le cellule T CD8 che formavano sinapsi immunologiche classiche sui doppi strati lipidici costruiti nella cella a flusso o nel vetrino a flusso multicanale. Dopo l'interazione del doppio strato lipidico, le cellule T CD4 hanno stabilito sinapsi immunitarie mature, ma rilasciano o non rilasciano granuli, rilasciano granuli senza la formazione di sinapsi mature o non formano sinapsi né rilasciano granuli. Da notare che le cellule T CD4 derivate da cellule mononucleate del sangue periferico sono in grado di iniziare a rilasciare granuli quasi due volte più velocemente rispetto alle cellule CD4 derivate dai linfonodi.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere una temperatura costante e pipettare lentamente in modo che non si formino bolle. Oltre alle nostre capacità di studiare un'interfaccia a doppio strato di cellule T, questo approccio ci consentirebbe anche di eseguire una colorazione intercellulare delle cellule T che hanno toccato il doppio strato. Il che faciliterebbe in modo significativo una quantità di informazioni che possono essere utilizzate per descrivere particolari cellule T derivate da tessuto linfoide o da altri tessuti.

Non dimenticare che lavorare con la soluzione piranha è estremamente pericoloso ed è fondamentale indossare DPI adeguati mentre si tenta questa procedura.