Analisi Live Cell Imaging Studio Glioblastoma cerebrale tumore cellule staminali migrazione e invasione

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del glioblastoma, delle cellule staminali tumorali cerebrali o della biologia BTSC, facilitando l'identificazione di nuovi approcci per inibire la migrazione e l'invasione. Il vantaggio principale di queste tecniche è che consentono di quantificare la migrazione e l'invasione dei BTSC nel tempo in molteplici condizioni. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia del glioblastoma, poiché la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali nel tessuto cerebrale normale contribuiscono alla recidiva della malattia.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni su come i BTSC migrano e invadono, può anche essere applicato alle cellule staminali tumorali derivate da altri tipi di tumore. Inizia scongelando una fiala di BTSC conservati criogenicamente in un becher di etanolo al 70% posto all'interno di un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius fino a quando l'ultimo ghiaccio non si è scongelato. Diluire le cellule scongelate e 10 millilitri di terreno in una provetta conica da 15 millilitri per la loro centrifugazione e risospendere il pellet BTSC in otto millilitri di terreno completo.

Trasferire le cellule in un pallone di coltura T25 per 10-14 giorni di coltura in condizioni non aderenti, monitorando quotidianamente il pallone, e integrare le cellule con uno o due millilitri di terreno completo fresco, se necessario. Quando le neurosfere raggiungono un diametro di circa 250 micrometri, utilizzare una pipetta per lavare il terreno sul fondo del pallone per staccare eventuali cellule aderenti e trasferire il surnatante in una provetta conica da 15 millilitri per la centrifugazione. Per dissociare le neurosfere BTSC in singole cellule, risospendere il pellet in un millilitro di soluzione preriscaldata per il distacco cellulare e incubare per sette minuti a 37 gradi Celsius, seguiti da 40 triturazioni con una micropipetta P1000 impostata su 800 microlitri.

Quando le cellule sono completamente dissociate, aggiungere cinque millilitri di PBS integrato con antibiotici alla provetta per un'altra centrifugazione e risospendere il pellet in uno o quattro millilitri di terreno completo a seconda delle dimensioni del pellet. Quindi seminare da due a tre volte 10 alla quinta cellula in otto millilitri di terreno completo per pallone T25 e trasferire i palloni nell'incubatore di coltura cellulare per una o due settimane di coltura. Per valutare gli effetti di un trattamento farmacologico di interesse sulla migrazione, pretrattare prima le cellule con la concentrazione appropriata del farmaco per un periodo sperimentale adeguato.

Per preparare la piastra per chemiotassi, rivestire tre pozzetti con inserto a membrana e tre pozzetti con serbatoio inferiore per condizione di una piastra per chemiotassi a 96 pozzetti con 75 e 225 microlitri di 0,2 milligrammi per millilitro di collagene di tipo I rispettivamente per un'ora a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, aspirare la soluzione di collagene da ciascun pozzetto senza graffiare il rivestimento di collagene e lavare i pozzetti due volte con PBS sterile. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere l'inserto dalla piastra e aggiungere 225 microlitri di terreno privo di fattore di crescita integrato con il 10% di FBS a ciascun pozzetto del serbatoio inferiore della piastra per chemiotassi.

Quindi riposizionare delicatamente l'inserto superiore nel serbatoio inferiore ad angolo per evitare la formazione di bolle e aggiungere 2,5 volte 10 alle terze BTSC dissociate in 50 microlitri di terreno privo di fattore di crescita a ciascun pozzetto dell'inserto. È importante dissociare completamente le BTSC in singole cellule e contarle attentamente prima della placcatura per evitare di avere grumi di cellule o troppe cellule nell'inserto superiore. Per visualizzare la migrazione delle BTSC lungo il gradiente FBS, posizionare la piastra in un sistema di imaging di cellule vive e impostare il software di imaging automatizzato per acquisire immagini microscopiche della lastra ogni una o due ore per un massimo di 72 ore.

Al termine dell'acquisizione dell'immagine, selezionare una nuova definizione di elaborazione per distinguere le BTSC dai loro pori di inserimento sul lato inferiore della membrana, modificando l'analisi se non distingue accuratamente le cellule dalla membrana di fondo come necessario. Per quantificare le cellule che sono migrate attraverso i pori, raccogli i dati come l'area della superficie cellulare sul lato inferiore della membrana per ciascuno dei tre pozzetti replicati per condizione, quindi rappresenta graficamente la migrazione cellulare come l'area delle cellule migrate in micrometri al quadrato nel tempo. Per valutare l'invasione della neurosfera BTSC, aggiungere prima il composto di interesse al pallone alla concentrazione desiderata per il decorso temporale predeterminato prima della placcatura dell'invasione della neurosfera.

Quando la dimensione media della neurosfera raggiunge circa 150-200 micrometri, puntare e mescolare delicatamente il pallone con una pipetta e trasferire 500 microlitri di neurosfere BTSC risospese in una provetta da 1,5 millilitri per condizione sperimentale su ghiaccio. Aspirare il più possibile il terreno dal fondo di ogni provetta da 1,5 millilitri senza perdere il pellet di neurosfera e risospendere delicatamente le neurosfere in 500 microlitri di soluzione di collagene di tipo I da 0,4 milligrammi per millilitro appena preparata. Trasferire 100 microlitri di neurosfere sospese in collagene in tre pozzetti per condizione in una nuova piastra da 96 pozzetti su ghiaccio e lasciare che le neurosfere si stabilizzino per cinque minuti.

È fondamentale consentire alle neurosfere di depositarsi per cinque minuti sul ghiaccio. In caso contrario, le sfere non saranno sullo stesso piano di messa a fuoco per l'imaging. Dopo cinque minuti di polimerizzazione del collagene nell'incubatore per colture cellulari, trasferire la piastra nel vassoio del sistema di imaging di cellule vive per acquisire un'immagine di riferimento delle dimensioni della neurosfera al momento della placcatura prima dell'inizio dell'invasione.

Quindi impostare il software per acquisire immagini ogni una o due ore fino a quando il tasso di invasione non si è stabilizzato, in genere entro 24 ore. Per visualizzare l'aumento della superficie delle BTSC mentre invadono la matrice nel tempo, utilizzare l'obiettivo 10X per acquisire quattro immagini per pozzetto per ogni serie di tre pozzetti replicati. Per determinare l'area relativa della superficie cellulare rappresentata come percentuale di confluenza del pozzo, impostare una definizione di elaborazione che evidenzi in modo specifico le celle sullo sfondo del pozzetto, quindi raccogliere i dati come area totale della superficie cellulare per ogni pozzetto in ogni punto temporale, determinare la media dei tre pozzetti replicati, e rappresentare graficamente l'invasione delle BTSC tracciando l'aumento dell'area cellulare nel tempo.

Le BTSC piatte come singole cellule possono essere coltivate come neurosfere fluttuanti. Le neurosfere possono quindi essere trattate con un farmaco di interesse e piastrate per l'analisi chemiotassica degli effetti degli interventi terapeutici sulla migrazione di BTSC. Se le BTSC non sono completamente dissociate, le cellule non migrano attraverso i pori e rimangono come piccole neurosfere.

Se vengono piastrate più di 2,5 volte 10 al terzo BTSC per pozzetto, le cellule si aggregano piuttosto che migrare verso i lati inferiori delle membrane. Inoltre, è essenziale evitare la formazione di bolle nei pozzetti dell'inserto della membrana durante la placcatura delle cellule o quando si posiziona l'inserto della membrana nel serbatoio inferiore, poiché le bolle impediscono l'imaging e la quantificazione accurati delle cellule. L'invasione di BTSC dalle neurosfere nella matrice circostante può essere ripresa e misurata nel tempo in un formato di piastra a 96 pozzetti.

L'effetto degli interventi terapeutici sull'invasione di BTSC può essere valutato quantificando l'area superficiale delle cellule mentre invadono la matrice nel tempo. L'incorporazione di neurosfere BTSC con un diametro superiore a 200 micrometri porta a un piano di messa a fuoco troppo grande per quantificare con precisione tutte le sfere nel campo visivo. Allo stesso modo, l'incapacità di mantenere la matrice a quattro gradi Celsius durante l'incorporazione delle neurosfere nel collagene per il test di invasione può anche portare a sfere che non si trovano sullo stesso piano di messa a fuoco con una matrice extracellulare che non si solidifica in modo uniforme, impedendo un'accurata acquisizione dei dati.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ottimizzare le condizioni di trattamento farmacologico e i tempi di acquisizione delle immagini per ogni coltura BTSC oggetto di indagine. Questa procedura può anche essere modificata per rispondere a ulteriori domande su come le cellule staminali tumorali di altri tipi di tumore migrano e invadono in vitro. Questa tecnica può aiutare a spianare la strada ai ricercatori nel campo della biologia del cancro per esplorare la migrazione e l'invasione in vitro nelle BTSC del glioblastoma.