Un approccio In Vitro alla terapia fotodinamica

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla terapia fotodinamica, altrimenti nota come PDT. Le domande a cui si può rispondere utilizzando questo metodo includono la durata dell'incubazione di un fotosensibilizzatore o l'uso di diversi parametri nell'esperimento come la modifica della temperatura riscaldando o raffreddando le cellule. Questa tecnica può aiutare a facilitare lo sviluppo in vitro di nuovi fotosensibilizzanti, protocolli e indicazioni per la PDT.

Iniziare piastrando due volte da 10 a quattro cellule in due millilitri di terreno di coltura in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti utilizzando una tecnica sterile per un'incubazione di 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, lavare le cellule con almeno due millilitri di PBS e trattare le colture con diluizioni di zero, zero virgola cinque, uno o due millimetri di 5-ALA appena preparato. Quindi posizionare la piastra su un blocco riscaldante a 36-37 gradi Celsius per 30 minuti al riparo dalla luce.

Durante la procedura, durante la fase di incubazione, si consiglia ai ricercatori di utilizzare un blocco riscaldante per ottenere una temperatura costante per tutto il periodo di incubazione. Inoltre, si consiglia di coprire le cellule durante il periodo di incubazione con un foglio di alluminio per prevenire l'attivazione precoce del fotosensibilizzatore. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule in ogni pozzetto con due millilitri di PBS.

E rinfrescare le colture con due millilitri di terreno di coltura fresco per l'irradiazione della luce blu. Prima di irradiare le celle, riscaldare il dispositivo a luce blu a una lunghezza d'onda di uscita di 417 nanometri per un ciclo di 1.000 secondi e utilizzare un fotometro per misurare l'irraggiamento sulla superficie della cella, regolando la distanza della luce per ottenere l'irradianza appropriata in base all'intensità della sorgente luminosa. Quindi posizionare le cellule trattate con 5-ALA su una superficie nera sotto la luce blu per 1.000 secondi per una fluenza totale di 10 joule per centimetro quadrato.

Durante la fotoattivazione, si consiglia di posizionare le cellule su una superficie nera per evitare riflessi di luce e dosaggi incoerenti. Al termine del trattamento di fototerapia, lavare le cellule in ogni pozzetto con due millilitri di PBS e staccare le cellule con un millilitro di tripsina-EDTA allo 0,25% per pozzetto. Dopo tre-cinque minuti, confermare il distacco e disattivare la tripsina con il 10% di FBS e PBS.

Trasferire le cellule da ciascun pozzetto in singole provette da cinque millilitri e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Aggiungere 200 microlitri di tampone di flusso con anticorpo annessina-V coniugato a ciascun campione. Risospendere le cellule e posizionare le provette nell'incubatore per 20 minuti per consentire il legame dell'annessina-V.

Al termine dell'incubazione, aggiungere tre microlitri di 7-AAD a ciascun campione e incubare nuovamente a temperatura ambiente per cinque minuti, seguito da un'analisi del campione eseguita secondo i protocolli standard di analisi citofluorimetrica. Dopo cinque trattamenti con ALA e fototerapia con luce blu, si osserva un aumento dose-dipendente dell'apoptosi cellulare. Per calcolare la percentuale di cellule sottoposte ad apoptosi, si aggiunge la percentuale di cellule nei quadranti annexina-V alto, 7-AAD basso e annessina-V alto, 7-AAD alto.

Le incongruenze nella durata del periodo di incubazione di cinque ALA, nella temperatura di incubazione o nella dose di irradiazione per fotoattivazione possono alterare l'efficacia della fototerapia, determinando un aumento dell'apoptosi dipendente dalla temperatura, ad esempio. Seguendo questa procedura, possono essere eseguite altre tecniche, tra cui la RTQPCR e il western blot, per determinare in che modo la PDT altera l'espressione genica e l'attività proteica. Questo metodo consente ai ricercatori interessati alla terapia fotodinamica di scoprire gli effetti sulle cellule tumorali della pelle e su altre malattie della pelle in vitro.